Summary
Questo protocollo descrive l'applicazione della tomografia combinata a fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) imaging e micro-computerizzata (microCT) per la visualizzazione tromboembolie cerebrale. Questa tecnica consente la quantificazione del carico trombotico ed evoluzione. La tecnica di imaging NIRF visualizza fluorescente trombo nel cervello asportato, mentre la tecnica microCT visualizza trombo all'interno gli animali viventi utilizzando oro-nanoparticelle.
Abstract
l'imaging diretto trombo visualizza la causa principale di infarto tromboembolica. Essere in grado di immagine trombo permette direttamente di gran lunga migliore ricerca di ictus che basarsi su misure indirette, e sarà uno strumento potente e robusto ricerca vascolare. Usiamo un approccio di imaging ottico che etichetta trombi con un pennarello l'imaging molecolare trombo - una sonda fluorescente Cy5.5 vicino infrarosso (NIRF) che è legata covalentemente ai filamenti di fibrina del trombo dall'azione enzimatica fibrina reticolazione di attivazione fattore della coagulazione XIIIa durante il processo di maturazione coagulo. Un micro-tomografia computerizzata (microCT) approccio basata su utilizza nanoparticelle di oro trombo-seeking (AuNPs) funzionalizzati di indirizzare il componente principale del coagulo: fibrina. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per la combinata in vivo microCT e ex vivo l'imaging NIRF di tromboembolie in un modello murino di ictus embolico. Abbiamo dimostrato che in vivo </ em> microCT e AuNPs glicole-chitosano fibrina mirati (FIB-GC-AuNPs) può essere utilizzato per la visualizzazione sia in situ trombi e cerebrale trombi embolico. Descriviamo anche l'uso di imaging in vivo trombo diretta microCT-based per monitorare serialmente gli effetti terapeutici del plasminogeno tissutale trombolisi attivatore-mediata. Dopo l'ultima sessione di imaging, dimostriamo da ex vivo NIRF imaging la portata e la distribuzione di tromboembolie residua nel cervello. Infine, si descrive l'immagine di analisi quantitative e microCT NIRF dati di imaging. La tecnica combinata di immagini dirette trombo permette due metodi indipendenti di visualizzazione trombo da confrontare: l'area del segnale fluorescente trombi correlati a ex vivo NIRF l'imaging rispetto al volume di iperdensa microCT trombi in vivo.
Introduction
Uno in 6 persone avranno un ictus a un certo punto nella loro vita. Ictus ischemico è di gran lunga il tipo di tratto più comune, e rappresenta circa il 80 per cento di tutti i casi di ictus. Perché tromboembolie causano la maggior parte di questi ictus ischemico, vi è un crescente interesse per l'imaging diretto trombo.
E 'stato stimato che circa 2 milioni di cellule cerebrali muoiono durante ogni minuto di cerebrale media occlusione dell'arteria 1, che porta lo slogan "Il tempo è cervello". La tomografia computerizzata (CT) studi può essere fatto rapidamente, e sono ampiamente disponibili; Per questo motivo, CT rimane il imaging di scelta per la diagnosi e il trattamento di ictus ischemico iperacuto iniziale. CT è particolarmente utile per informare le prime decisioni critiche: la somministrazione di attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) per trombolisi e / o triaging a endovascolare coagulo-recupero 2. Attuale CT-based Imaging trombo, tuttavia, non può in serie monitorare cerebral tromboembolie in vivo, perché utilizza metodi indiretti per dimostrare trombi: dopo opacizzazione della pozza di sangue da parte di contrasto iodati, il trombi sono dimostrati come difetti di riempimento nei vasi. Ci sono limiti di dose ei rischi associati con la somministrazione ripetuta di contrasto iodato, che precludono ripetono l'imaging di trombi in questo modo.
Pertanto, vi è una necessità critica per una metodologia di imaging diretto trombi cerebrale nei pazienti con ictus, per consentire più veloce e migliori decisioni di trattamento da effettuare. Noi proponiamo di ottenere questo risultato, migliorando il valore del CT, la modalità di imaging prima linea attualmente utilizzata per il colpo, con l'uso di un agente di imaging molecolare nanoparticular trombo-seeking.
Abbiamo dimostrato l'uso di questo agente utilizzando micro-tomografia computerizzata (microCT), ad alta risoluzione ex vivo o in vivo (piccoli animali) la versione per immagini della TC che permette l'acquisizione rapida di dati <sup> 3,4. Anche con il relativamente scarso contrasto dei tessuti molli a disposizione per le piccole microCT animali (molto peggio di quanto disponibili da scanner umani imprese), l'agente di imaging è stato in grado di cercare e contrassegnare trombi facendoli iperdensa alla TC, un 'segno nave densa' arricchito da molecolare imaging.
A complemento della tecnica CT, il nostro gruppo ha già messo a punto una tecnica di imaging trombo diretta ottica utilizzando la sonda fluorescente Cy5.5 nel vicino infrarosso (NIRF) di visualizzare cerebrale trombo onere 5. Questa è una tecnica ex vivo sul cervello post mortem, ma è molto sensibile, e serve a confermare dati in vivo nella cornice di ricerca.
Avendo entrambi TC e NIRF basano tecniche di imaging trombo-seeking ci permette di confrontare e contrapporre queste tecniche per ottenere i dati altamente informativi sul ruolo di trombi e di imaging trombo nel processo di sviluppo ictus ischemico.
Here, descriviamo un protocollo dettagliato di una tecnica combinata di microCT in vivo e ex vivo l'imaging NIRF di visualizzare direttamente tromboembolie in un modello murino di ictus embolico. Questi metodi semplici e robusti sono utili per migliorare la nostra comprensione delle malattie trombotiche consentendo l'accurata nella valutazione vivo di trombi carico / distribuzione e caratterizzazione dell'evoluzione trombo dinamica in modo rapido e quantitativa in vivo durante la terapia, seguita da ex vivo dati che serve come controllo e standard di riferimento per la conferma dei risultati di imaging in vivo.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali hanno dimostrato in questo protocollo sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l'uso di animali Ilsan Hospital Dongguk University e condotto in conformità con i principi e le procedure descritte nella Guida NIH per la cura e l'uso di animali.
1. Preparazione di esogena coagulo formato etichetta con la fluorescenza Marker (Figura 1)
- Anestetizzare un topo in una camera di induzione utilizzando 3% isoflurano miscelato con il 30% di ossigeno (1,5 L / min 100% di ossigeno). Assicurare un'adeguata profondità dell'anestesia osservando tono muscolare e confermando l'assenza del riflesso punta pinch.
- Posto l'animale su un telo sterile in posizione prona, e tenerlo in anestesia utilizzando una maschera inalazione e 2% isoflurano miscelato con il 30% di ossigeno. Eseguire le seguenti procedure utilizzando tecniche asettiche e sterili abiti / maschere / guanti / strumenti. Mantenere condizioni sterili per la pulizia e la sanificazione dell'area sperimentale con il 70% di alcol prima di unnd dopo le procedure.
- Prelevare il sangue di circa 300 ~ 1000 ml arteriosa dopo puntura cardiaca 6. Mescolare 70 ml di sangue intero con 30 microlitri sonda C15 5 (20 micromol / L concentrazione), una sonda fluorescente Cy5.5 sensibili all'attività di fibrina-reticolazione del fattore attivato XIII (FXIIIa) coagulazione enzimatica, in occasione fluorescente il coagulo (Figura 1A ). Iniettare il sangue misto utilizzando una siringa da 3 ml (23 gauge) in un tubo di polietilene lungo 20 cm (PE-50, ID 0,58 millimetri). tubi PE deve essere sterilizzato (o certificato sterili dal produttore) e la formazione di coaguli deve essere preparato asetticamente in una cappa di coltura di tessuti.
- Verificare morte dell'animale osservando la mancanza di respiro e pulsazioni cardiache.
- Lasciare il tubo di sangue caricati a temperatura ambiente per 2 ore, quindi a 4 ° C per 22 ore, ed eseguire le procedure seguenti, come riportato in precedenza 7.
- Tagliare il tubo trombo contenenti in pezzi di 1,5 cm di lunghezza. Usando una siringa da 3 ml riempito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), espellere trombo su una piastra da 6 pozzetti PBS contenente iniettando delicatamente PBS in ogni pezzo di tubo. Lavare i trombi tre volte con PBS (Figura 1B).
- Caricare la porzione di estremità distale di un cm lungo PE-10 tubo 15 (ID 0,28 millimetri) con 1,5 cm lungo trombo disegnando attentamente il trombo lavato, evitando bolle d'aria, utilizzando una siringa da 1 ml di soluzione salina-riempita con 30 gauge che viene inserito nell'estremità prossimale del tubo.
- Collegare il PE-10 tubo trombo-caricato con una lunghezza di 3 cm PE-50 tubo (ID 0,58 millimetri) modificato per avere una estremità rastremata (ID 200 micron), che sarà collocato sull'arteria cerebrale media (MCA) - cerebrale anteriore Area arteria (ACA) biforcazione della carotide interna (ICA) in un modello murino di ictus embolico (Figura 1C).
2. Modellazione un modello murino di ictus tromboembolico (Figura 2)
- AnesthetizEA mouse diverso da accarezzò come precedentemente riportato 7 in una camera di induzione utilizzando 3% isoflurano miscelato con il 30% di ossigeno (1,5 L / min). Iniettare Meloxicam (5 mg / kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio. Assicurare un'adeguata profondità dell'anestesia osservando tono muscolare e confermando l'assenza del riflesso punta pinch.
- Applicare una piccola quantità di pomata veterinaria per ciascun occhio per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Eseguire le seguenti procedure chirurgiche utilizzando tecniche asettiche e sterili abiti / maschere / guanti / strumenti. Mantenere condizioni sterili per la pulizia e la sanificazione della zona chirurgica con 70% alcol prima, durante e dopo l'intervento chirurgico.
- Muovi il mouse per un tavolo operatorio. Posto l'animale su un telino sterile in posizione prona, e tenerlo in anestesia utilizzando una maschera inalazione e 2% isoflurano. Quindi, serrare la temperatura corporea a 36,5 ° C utilizzando una coperta omeotermi con retroazione da un termometro rettale.
- dopo Surgical preparazione con Betadine e il 70% di alcol, fare una incisione verticale 1 centimetro utilizzando un bisturi sul cuoio capelluto tra l'orecchio sinistro e l'occhio. Colla l'estremità distale della fibra ottica di un flussimetro laser Doppler sulla superficie dell'osso temporale sinistro esposta (1 mm e 4 mm sinistra sotto dal bregma). Quindi, avviare il monitoraggio del flusso Doppler (Figura 2A).
- Stendere l'animale. Raddrizzare collo tirando dente anteriore superiore con un filo attaccato ad un perno e radere la zona del collo. Poi, fare un 3 cm linea mediana verticale un'incisione, diffonderla aperta, ed esporre l'area bulbo carotideo data da sezionare tessuti molli peri-vascolare. Fare attenzione a non danneggiare il nervo vago.
- Legare l'arteria sinistra prossimale carotide comune (CCA) utilizzando una sterile 6-0 nero di sutura di seta, e legare l'ICA a sinistra e l'arteria pterigopalatino sinistra (PPA) con sterili 7-0 punti di sutura di seta nera.
- Cauterizzare la tiroidea superiore sinistro, che è un ramo della esterna usi carotide sinistrang una cauterizzazione elettrica monopolare, e legare il prossimale dell'arteria carotide esterna sinistra (ECA) liberamente e il sito più distale strettamente con sterili 7-0 punti di sutura di seta nera.
- Utilizzo di un micro-forbice, fare un piccolo foro (circa 0,2 ~ 0,25 micron di diametro) tra i siti legatura della CCE.
- Inserire il catetere trombo contenente nel foro della Corte dei conti, mentre allentando la prossimale legatura ECA. Serrare nuovamente il prossimale legatura ECA dopo aver avanzato il catetere nella CCA per cinch il catetere in posizione.
- Cauterize tagliare la parte distale ECA, che è distale al sito legatura distale, e ruotare la libera prossimale ECA senso orario per allinearlo alla direzione dell'ACI mentre si ritira il catetere dal CCA. Poi, far avanzare il catetere di circa 9 mm nella MCA - zona biforcazione ACA del distale ICA subito dopo aver allentato la legatura ICA. Quindi, serrare la legatura ICA.
- Posizionare il trombo nella zona biforcazione delicatamentepremendo la siringa 1 ml per iniettare il trombo. Controllare la diminuzione di Doppler flusso sanguigno cerebrale (CBF), che dovrebbe essere abbassata del 30% o inferiore rispetto al basale, se il trombo occlude successo recipiente (Figura 2B).
- Rimuovere il catetere, e legare immediatamente e saldamente il sito prossimale ECA. Inoltre, unligate il CCA e il PPA.
- Chiudere il sito di incisione con 6-0 punti di sutura in seta. Interrompere l'anestesia dopo aver continuato il monitoraggio Doppler in un arco di tempo desiderato (qui, per 30 minuti dopo l'iniezione di trombi). Ritorno il mouse in una gabbia vuota, e tenere in caldo con una lampada riscaldante. Non lasciare il mouse senza sorveglianza fino a quando non ha acquisito la coscienza sufficiente a mantenere decubito sternale.
3. In Vivo microCT Imaging di Cerebral trombo (Figura 3)
- Re-anestetizzare il mouse con 2% isoflurano come descritto nel passaggio 2.1 in un time-point prestabilito (qui, 1 hr) dopo l'iniziodi ictus embolico grazie al collocamento di trombi nell'arteria cerebrale. Assicurare un'adeguata profondità dell'anestesia confermando l'assenza del riflesso punta pinch. Applicare una piccola quantità di pomata veterinaria per ciascun occhio per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Risospendere nanoparticelle di oro fibrina targeting (FIB-GC-AUNP 4) ad una concentrazione di 10 mg / ml in Au 10 mM PBS, e sonicare l'agente di imaging trombo per 30 minuti per garantire dissoluzione e dispersione delle nanoparticelle. Iniettare 300 microlitri FIB-GC-AUNP (10 mg / ml) nella vena del pene.
- Posto l'animale sul letto di una macchina microCT, e raddrizzare collo tirando il dente anteriore superiore con un filo attaccato ad un perno per ridurre artefatti da movimento.
- A 5 minuti dopo l'iniezione di fib-GC-AUNP, cominciano a ottenere immagini microCT del cervello. Per gli esperimenti descritti qui, utilizzare i seguenti parametri di imaging: 65 kVp, 60 μA, 26,7 x 26,7 x 27,9 millimetri 3 campo di vista, 0,053 x 0,053 x 0,054 millimetri 3 dimensioni voxel, 100 millisecondi per fotogramma, 1 media, a 360, 512 x 512 matrice di ricostruzione, 600 fette, 64 sec tempo di scansione.
- Ritorno il mouse in una gabbia vuota, e tenere in caldo con una lampada riscaldante. Non lasciare il mouse senza sorveglianza fino a quando non ha acquisito la coscienza sufficiente a mantenere decubito sternale.
- Trasformare i dati grezzi in immagini Digital Imaging e delle comunicazioni in formato Medicina (DICOM) tramite il comando 'Start' del pannello 'ricostruzione' in un pacchetto software installato sullo scanner microCT.
- Per le analisi quantitative delle immagini (al punto 6), di trasformare i dati DICOM in formato TIFF utilizzando un pacchetto software disponibile in commercio in base alle istruzioni del produttore.
- Per le analisi qualitative e quantitative di analisi in modo più semplice e più rapida, utilizzare il pacchetto software e l'originale 0.054 mm di spessore immagini in formato DICOM per la generazione di una nuova serie diimmagini assiali e coronali resi avere 1 o 2 mm (qui, 2 mm) di spessore, come segue.
- Selezionare la cartella DICOM su un albero del 'Data Source', fare clic sul pulsante destro del mouse, e importare la cartella di 'MasterDB' o 'PrivateDB'.
- Fare clic sul 'MasterDB' o 'PrivateDB' nella struttura del 'origine dati', e selezionare la cartella importata. Dopo aver fatto clic sulla scheda '3D' sul pannello di sinistra, quando finestra 'Opzioni' di caricamento si apre, premere 'OK' per importare una sequenza di immagini nella cartella come una pila.
- Modificare la rappresentazione di immagini in formato di proiezione massima intensità (MIP) facendo clic sulla parola 'MRP' nel assiale e finestre delle immagini coronali e scegliendo 'MIP' nel menu a comparsa. Quindi, cambiare lo spessore dell'immagine a 2 mm dopo aver cliccato 'TH: 0 [mm]' nelle stesse finestre.
- Utilizzando il 2 mm Larghezza 3D nabar vigator che permette di esplorare una serie di immagini e affettare in un angolo e la posizione del caso, preparare un'immagine sezione di spessore assiale a 2 mm con una copertura completa del circolo di Willis (COW), che ospita trombi. Fare clic sul pulsante di acquisizione (icona della fotocamera) sul pannello 'Output'. Salvare l'immagine in formato TIFF.
- Poi, preparare cinque spessore di 2 mm sezione immagini coronali che coprono contiguo dal lobo frontale al cervelletto.
- In primo luogo, preparare la seconda fetta allineando con attenzione la barra di navigazione sull'immagine assiale in modo che l'immagine coronale può meglio visualizzare la MCA - trombi ACA.
- Quindi, preparare gli altri quattro fette in modo contiguo. Fare clic sul pulsante di acquisizione (icona della fotocamera) sul pannello 'Output'. Salvare le immagini in formato TIFF.
4. trombolisi e in vivo microCT Imaging di Cerebral trombo (Figura 3)
- Preparare lunga 100 centimetri PE-10 tubo con un ago da 30 gauge su un'estremità e una siringa da 1 ml sull'altra estremità. Riempire il tubo con soluzione salina (600 ml) o tPA (qui, 24 mg / kg, 600 microlitri) evitando bolle d'aria.
- Re-anestetizzare il mouse come descritto nel passaggio 2.1. Inserire la punta dell'ago all'interno della vena del pene dell'animale. Posto l'animale con cura sul letto della macchina microCT. Poi, immobilizzare e stabilizzare la parte iniettata per via endovenosa del sistema catetere taping al letto.
- Eseguire una sessione di imaging di follow-up come base di riferimento pre-trattamento. Poi, iniettare o 60 microlitri di soluzione salina normale o tPA premendo lo stantuffo della siringa nel sistema catetere. Dopo l'iniezione in bolo, comincerà a infondere la soluzione rimanente (540 ml) per un periodo di tempo (qui, 30 min).
- Ottenere immagini microCT utilizzando gli stessi parametri nella fase 3.4 in punti temporali pre-specificati: qui, alle 3 e 24 ore dopo l'iniezione in bolo. Per eseguire il seguente ex vivo NIRF ThromImaging bus del cervello, eutanasia l'animale in anestesia per dislocazione cervicale.
5. Ex Vivo NIRF trombo Imaging e trifeniltetrazolo cloruro (TTC) colorazione del tessuto cerebrale (Figura 4)
- Dopo la decapitazione, rimuovere il cuoio capelluto e tagliare il cranio con le forbici del foro occipitale verso il sutura sagittale. Rimuovere la volta cranica elevando accuratamente i bordi del cranio incisa con le forbici, evitando lesioni al cervello sottostante, quindi mettendo a nudo gli emisferi.
- Tagliare i nervi ottici nella base del cervello più vicino possibile alla superficie del cervello, perché potrebbero sovrapporsi con il cerchio di arterie Willis che devono essere visualizzati su imaging NIRF. Quindi, al fine di visualizzare chiaramente la forma a Y 'MCA / ACA / ICA distale' per imaging NIRF trombo, tagliare il distale ICA, per quanto possibile alla superficie del cervello dopo la compressione delicatamente la base del cervelletto per esporre °punti di taglio e (Figura 4a).
- Eseguire l'imaging NIRF (eccitazione / emissione, 675/690 nm; 1 esposizione sec) del tessuto cerebrale rimosso con la base rivolta verso l'alto (figura 4B, C), che visualizza il tromboembolie fluorescente nelle arterie della vacca (Figura 4D) . Quindi, eseguire ulteriori immagini con il vertice del cervello rivolta verso l'alto, che visualizza tromboembolie corticali. Evitare l'essiccazione del cervello mettendo alcune gocce di soluzione salina sul tessuto.
- Utilizzando un dispositivo matrice cerebrale secondo le istruzioni del produttore, preparare rapidamente 2 mm di spessore fette di cervello coronale: 6 pezzi di 2 mm fette spesse (2.3, 0.3, -1.7, -3.7, -5.7 mm dal bregma). Evitare asciugatura delle fette di cervello utilizzando gocce saline, ed eseguire NIRF imaging sia la parte anteriore e la superficie posteriore delle sezioni.
- Mettere le fette di cervello in soluzione al 2% di cloruro trifeniltetrazolo (TTC) per 20 minuti, evitando l'esposizione al light. Quindi spostare le fette in soluzione di formaldeide 4% a 4 ° C, evitando l'esposizione alla luce.
6. Quantificazione del trombo Area Uso delle immagini MicroCT e ImageJ (1.49d) Software (Figura 5)
- Immagini aperte (Figura 5a).
- Aprire i file di sequenze di immagini per creare un file di stack scegliendo 'File> Importa> Immagine Sequenza' o 'File> Apri'. Convertire le immagini a 8-bit in scala di grigi utilizzando 'Immagine> Tipo> 8-bit'.
- Convertire l'unità da pollici a millimetri (Figura 5A).
- Quando un pixel dei file di immagini CT corrisponde a 0,053 mm, usare 'Analisi> Imposta scala' per inserire '1', '0,053', e 'mm' per 'distanza in pixel', 'distanza nota', e 'Unità di lunghezza 'rispettivamente.
- Quando (solo) una barra di scala è disponibile,utilizzando lo strumento 'Linea Retta' disegnare una linea con la sua lunghezza uguale a quella della barra di scala. Quindi, utilizzare 'Analisi> Imposta scala' per inserire la lunghezza della barra di scala in millimetri.
- Sottrazione del fondo (Figura 5B)
- Con posto con 'Modifica> Selezione> Specifica' una regione circolare o rettangolare di interesse (ROI) in una zona del parenchima cerebrale, senza trombo o regioni iperdense ossee legate. Poiché il ROI specificato vale per ogni fetta della pila, controllare per essere sicuri, se non si sovrappone con le regioni iperdense in ogni fetta.
- Scegliere 'Plugin> ROI> BG sottrazione dal ROI' e immettere 2,0 per il 'Numero di stdev dalla media'.
- Segmentazione di tromboembolie legate iperdensa lesioni (Figura 5C)
- Scegliere 'Immagine> Regola> Soglia', e inserire i valori di 'Lower Livello soglia 'e' Livello soglia superiore 'come, rispettivamente, 22 e 255,. Seleziona 'Over / Under' per visualizzare pixel al di sotto del valore di soglia inferiore in blu, pixel thresholded in scala di grigi, e pixel al di sopra del valore di soglia superiore in verde.
- Utilizzare la 'Selezione a mano libera Tool' per disegnare ROI che circondano lesioni iperdense tromboembolie legate senza includere zone ossee. Durante il disegno, tenere premuto uno dei due [shift] o [Alt] per aggiungere o rimuovere una regione, rispettivamente.
Nota: Se le lesioni tromboemboliche iperdense sono distanti da strutture ossee, al posto della 'Selezione a mano libera Tool', 'bacchetta' può essere tranquillamente utilizzato senza cambiare il suo livello di 'tolleranza'.
- La quantificazione delle lesioni segmentati (Figura 5D)
- Utilizzare 'Analisi> Imposta Misure' da scegliere 'Area', 'medio grigio Valore', e 'densità integrata (Area X Media)9 ;. Controllare le seguenti opzioni: 'Limite di Soglia' e 'Display Etichetta'. Utilizzare 'Analizza> Measure' per ottenere i dati quantificati. Poi, salvare i risultati in un file ".xls".
- Salvare il file di stack in formato TIFF. Inoltre, usare 'Analizza> Strumenti> ROI manager' per salvare le ROI.
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Representative Results
Immagini Baseline microCT, ottenuti in vivo dopo somministrazione FIB-GC-AUNP (10 mg / ml, 300 ml) in 1 ora dopo ictus embolico, chiaramente visualizzato trombo cerebrale nel MCA - ACA zona biforcazione distale dell'arteria carotide interna (Figura 6 ). Follow-up di immagini microCT non ha mostrato alcun cambiamento nel trombo mucca con trattamento salino. Tuttavia, il trattamento con tPA mostrato una graduale dissoluzione del trombo COW (frecce blu in Figura 6). Questo risultato dimostra che l'imaging microCT trombo può consentire il monitoraggio terapeutico della trombolisi. Vi è un eccellente corrispondenza tra la densità in vivo CT ed ex vivo NIRF per tromboembolie residuo al 24 hr. Si noti che le aree iperdensa microCT a causa endogena trombo-marcatura con AuNPs fibrina-targeting ben co-localizzati con NIRF zone con segnale a causa esogena trombo-marcatura, che è stata eseguita prima EMBOlic tratto utilizzando una sonda fluorescente Cy5.5 sensibili al fattore della coagulazione XIIIa-mediata fibrina-reticolazione attività nel processo di maturazione del coagulo preformato (figura 6). La tecnica combinata di immagini trombo diretta a dimostrare l'effetto trombolitico tPA-mediata riflette esito istologico corsa come misurato mediante colorazione TTC. TTC colorazione ha mostrato una netta riduzione della quantità di danno ischemico cerebrale (aree biancastre in figura 6) per l'animale ricevere tPA trombolisi.
Figura 1:. Panoramica della preparazione di coaguli di sangue fluorescente (A) mescolanza di sangue intero fresco con Cy5.5 fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) sonda (C15) che è legato in modo covalente i filamenti di fibrina del trombo dal fibrina -crosslinking azione enzimatica di coagu attivatolamento fattore XIIIa durante il processo di maturazione del coagulo. Il sangue miscelato viene iniettato in un polietilene (PE) -50 tubo e lasciato per 24 ore per permettere la formazione di coaguli e maturazione. (B) di imaging NIRF per confermare l'etichettatura ottica del trombo con la sonda C15. Nota la fluorescenza persistente dopo lavaggio del trombo che è stato rimosso dal tubo PE. (C) PE-10 tubo trombo-caricato con un tubo in PE-50 modificato per avere una estremità rastremata (200 micron di diametro) di tromboembolia nel dell'arteria cerebrale media - cerebrale anteriore dell'arteria zona biforcazione della carotide interna nei topi. Barre di scala:. 2 millimetri Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica dei Modellazione un modello murino di Thromboembolic infarto cerebrale. (A) controllo Laser Doppler del flusso sanguigno cerebrale (CBF) prima e dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCA), con l'estremità distale della fibra ottica del misuratore laser Doppler incollato alla superficie dell'osso temporale sinistro (1 mm e 4 mm sinistra sotto dal bregma). Nota la diminuzione post-occlusione Doppler CBF, che dovrebbe essere abbassata del 30% o inferiore rispetto al basale. (B) Inserimento del catetere trombo contenente (cioè, il distale rastremata polietilene-50 tubo in Figura 1C) nel foro nella carotide esterna (ECA), seguita (eventualmente) facendo avanzare il catetere circa 9 mm nella MCA - zona arteria cerebrale anteriore (ACA) biforcazione della carotide interna distale (ICA). CCA, comune carotide; PPA, arteria pterigopalatino. Clicca qui per vedereuna versione più grande di questa figura.
Figura 3: Panoramica dei in vivo microCT basata diretto trombo Imaging utilizzando fibrina mirati oro Nanoparticelle di visualizzare cerebrale tromboembolie e Monitor attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) mediata Effetti trombolitici (A) L'iniezione endovenosa di nanoparticelle d'oro glicole-chitosano fibrina mirati. (FIB-GC-AuNPs) in un mouse con ictus tromboembolico. (B) Il mouse è posizionato sul letto di un imager microCT. (C) Acquisire le immagini microCT a 5 minuti dopo l'iniezione di fib-GC-AuNPs. (D) ricostruzione delle immagini per trasformare i dati di immagine grezzi in Digital Imaging e delle comunicazioni in formato Medicina (DICOM) utilizzando installato sullo scanner microCT un pacchetto software. (E) Analisi delle immagini e la preparazione del assiale / cimmagini oronal reso ad avere 2 mm di spessore utilizzando la modalità di proiezione di intensità massima. Trombolisi (F) per via endovenosa del tPA-mediata, che può essere monitorato e analizzato utilizzando il metodo di imaging trombo diretta microCT-based. (C - E) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Panoramica dei Ex Vivo Near-Infrared fluorescente (NIRF) Imaging di Cerebral tromboembolie (A e B) Un tessuto cerebrale rappresentante rimosso da un mouse con ictus tromboembolico.. Prendere precauzioni per non perdere tromboembolie (freccia rossa) a livello dell'arteria cerebrale media (MCA) - anteriore zona arteria cerebrale (ACA) biforcazione del distale dell'arteria carotide interna (ICA,frecce blu) durante la rimozione del cervello. (C e D) ex vivo NIRF immagini trombo. Il tessuto cerebrale è posto all'interno della camera a tenuta di luce di un imager NIRF (C) per la visualizzazione del trombo (freccia rossa in D) pre-marcato con fluorescente C15 marcatore Cy5.5 prima dell'occlusione embolica del MCA - ACA biforcazione la zona. Confronto alla figura 5 per la comparsa CT. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Panoramica di quantificare trombo volume utilizzando immagini MicroCT e ImageJ (1.49d) (A) Importazione di immagini in un nuovo file di stack, la conversione del formato di file in scala di grigi a 8 bit, e cambiando l'unità.mm. (B) la sottrazione di sfondo. (C) Divisione di lesioni tromboembolici disegnando la regione di interesse (ROI) intorno alle aree iperdensi escludendo strutture ossee. (D) L'acquisizione dei dati quantitativi per il ROI utilizzando il menu 'Analizza> Misura'. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6:. Rappresentante diretto cerebrale trombo Imaging dati acquisiti prima e dopo aver trattato topi Stroked con Saline vs attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) immagini (A) microCT (MCT) trombo per consentire il monitoraggio terapeutico di attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) trombolisi -mediata . (B e
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Discussion
Abbiamo dimostrato l'uso di due complementari molecolari tecniche di imaging per l'imaging trombo diretta in modelli sperimentali di ictus embolico: un fibrina mirata nanoparticelle d'oro (FIB-GC-AUNP) per l'imaging microCT-based in vivo, e un FXIIIa mirato sonda di imaging ottico per ex vivo per immagini a fluorescenza.
Dopo somministrazione endovenosa di fib-GC-AuNPs, trombi divenne visibile alla TC come strutture dense, causata dalle particelle diventando intrappolata nel trombi dall'azione dei peptidi fibrina-targeting (sulla superficie delle particelle), dopo concentrazione-gradient- diffusione dipendente nella struttura porosa, cioè, trombi. Questo processo sembrava verificarsi in una sola direzione, e rapidamente causato relativamente basse concentrazioni di nanoparticelle nel sangue a concentrarsi nel coagulo, e cambiando la sua densità CT sufficientemente per consentire il rilevamento. Il vivo l'imaging finale microCT a 24 oreben correlata con post-mortem di imaging NIRF del cervello ex vivo, mostrando post-tPA residui del trombi iniziale era stato fluorescente con la sonda ottica riconoscendo l'attività di fibrina-reticolazione di FXIIIa prima di essere immessi in arteria cerebrale. In questo modo, due sonde di imaging molecolare, utilizzando diversi meccanismi di azione e diverse modalità di imaging, ogni rapporto e cross-verificare i risultati degli altri.
L'evoluzione di trombi potrebbe essere seguito utilizzando lo stesso metodo; in particolare, la terapia trombolitica con tPA potrebbe essere seguita in vivo, consentendo una lettura rapida e tempestiva del successo della trombolisi sia effettuata per CT. Questo ha profonde implicazioni per la trombolisi clinica, e ha anche applicazioni di ricerca per lo sviluppo di nuove terapie anti-trombotici o trombolitici.
In precedenza, il nostro gruppo era in grado di rilevare una complicazione comune nella terapia tratto, la re-trombosi 3 spesso si verificano intorno a un coagulo parzialmente trattate, con conseguente ri-occlusione e risultati peggioramento. Re-trombosi è stato modellato mediante l'applicazione di 1 millimetro FeCl 3 -soaked carte da filtro (grado 42) in sequenza su 4 posizioni differenti (sinistra distale CCA, prossimale sinistra CCA, destra distale CCA, e poi a destra prossimale CCA) in tempi diversi negli stessi animali . In tutti i casi, che circola FIB-GC-AUNP sono state dimostrate accumulando nel trombi e il rendering questi visibile per l'imaging con TC. Questa durata di questo effetto sembra essere limitato solo al emivita biologica del fib-GC-AUNP, che è attualmente nota, ed è stato osservato per un tempo prolungato (fino a 3 settimane) dopo l'iniezione iniziale di fib- GC-AUNP. Questo è di grande interesse clinico, perché una singola dose di agente di nanoparticelle potrebbe rivelarsi efficace per l'osservazione sia il successo e fallimenti di regimi di trattamento clinico. Sono necessari ulteriori studi per valutare la farmacocinetica e biodistribuzione di FIB-GC-AUNP.
La sintesi chimica di fib-GC-AuNPs è stata precedentemente descritta in dettaglio 4. Brevemente, peptidi fibrina-targeting (tirosina-D-glutammina-cisteina-idrossiprolina-L-3-chlorotyrosine-glicina-leucina-cisteina-tirosina-isoleucina-glutammina) utilizzati nella risonanza magnetica EP-2104R (MRI) agente 8 sono sintetizzato dalla norma in fase solida Fmoc chimica dei peptidi, e coniugata alla superficie di AuNPs GC rivestite utilizzando 1-etil-3 (3-dimetilaminopropil) carbodiimide e n-idrossi succinimmide. I prodotti finali, purificati FIB-GC-AuNPs sono raccolti per centrifugazione.
La sonda C15 NIRF per l'etichettatura ottica di trombi preformato è un peptide di 15 aminoacidi, riconosciuto da FXIIIa ed etichettati sui gruppi amino ε di residui di lisina 9,10 con colorante fluorescente Cy5.5. L'agente di imaging ottico è covalentemente legata ai filamenti di fibrina del trombo dall'azione enzimatica dell'attoivated fattore di coagulazione, quando si reticola filamenti di fibrina durante il processo di coagulo di maturazione 11,12. La sintesi chimica del marcatore trombo C15 NIRF è anche stata precedentemente descritta in dettaglio 4. Brevemente, peptidi FXIIIa affinità (glicina-asparagina-alanina-glutammato-glutammina-valina-serina-prolina-leucina-treonina-leucina-leucina-lisina-triptofano) sulla base del N-terminale di alph-2-antiplasmina sono sintetizzati dal solido sintesi -phase peptide e quindi marcato con fluorocromi Cy5.5 tramite la catena laterale cisteina. Usando cromatografia liquida ad alta prestazione, il prodotto viene purificato e il composto finale viene raccolto.
Il successo di entrambi i NIRF e gli agenti di nanoparticelle d'oro è probabilmente a causa delle forti caratteristiche di design biologiche di questi agenti. FXIIIa 11 è una fondamentale importanza transglutaminasi tetrameric trombina-attivato, l'enzima di coagulazione che media la resistenza fibrinolitica. L'attività di questoenzima è considerato come un segno distintivo di trombi di nuova formazione. Entrambi i nostri agenti interagiscono fortemente con questo fondamentale enzima coagulazione del sangue (dal FXIIIa-sensing agente ottica C15) o il suo substrato (dall'agente fib-GC-AUNP CT fibrina-targeting).
Studi co-localizzazione hanno dimostrato che vi è stato un eccellente corrispondenza tra ex vivo di fluorescenza (marcatore trombo esogena) e in vivo microCT densità (marcatore trombo endogena) per trombi cerebrale ripreso con le nanoparticelle di fibrina vincolante, che si prevede, a causa della vicenda relativi meccanismi di intrappolamento biologici sia per gli agenti.
Ci sono diverse cose da considerare quando si utilizza la tecnica di imaging trombo diretta dual-modale. In primo luogo, per evitare FIB-GC-AuNPs da aggregazione e di ottenere la biocompatibilità, glicole chitosano è utilizzato per il rivestimento di superficie 13. Prima dell'iniezione endovenosa tuttavia, l'agente di imaging trombo dovrebbe essere resuspended in PBS, e sonicato per garantire dissoluzione e dispersione delle nanoparticelle. Inoltre, la stabilità di nanoparticelle può essere valutata mediante spettroscopia di assorbimento ultravioletto-visibile (UV-Vis) per confrontare superficie picchi di risonanza plasmonica di vs. freschi vecchie scorte di FIB-GC-AuNPs, entrambi i quali dovrebbero essere a circa 519 nm.
In secondo luogo, la risoluzione delle immagini trombo microCT può essere migliorata modificando i parametri di scansione: come l'aumento del 'Numero Scan' da 600 a 1.200 fette o aumentando la 'media' da 1 a 3, che però aumentare il tempo richiesto per completare la scansione.
Terzo, sangue e agente di imaging C15 NIRF sono stati mescolati nel rapporto di 7: 3 5 per la marcatura fluorescente di trombi in questo studio. Secondo la nostra esperienza, un volume di sangue relativamente basso potrebbe ostacolare la formazione di trombi, mentre un volume di sangue relativamente elevato potrebbe ridurre la rilevabilità del tromboa causa della attenuazione del segnale fluorescente ex vivo emette dal trombo. Inoltre, è da notare che diversi approcci possono essere utilizzati per la visualizzazione fluorescente dei vari componenti di un trombo 14.
Quarto, rispetto al FeCl 3 mediata in situ modello trombosi dove l'arteria bersaglio è solo parzialmente occluso, visualizzazione microCT di tromboembolie cerebrale che occlude completamente la nave richiede relativamente alte dosi di fib-GC-AuNPs 4. Così, ci potrebbero essere problemi di tossicità, anche se colloidi oro sono considerati biocompatibili e fib-GC-AuNPs non ha mostrato notevole tossicità sistemica / neurocomportamentale in un precedente studio 4.
In quinto luogo, gli studi clinici hanno dimostrato che le piastrine mirati o agenti MRI fibrina mirati gadolinio (Gd) -based potrebbe aumentare la iperintensità della trombi nelle camere cardiache, arterie carotidi, e arco aortico sulle immagini pesate in T1 15. Sebbene la RM ha un eccellente contrasto tessuti molli e una risoluzione spaziale elevata, MRI è un test che richiede tempo. CT soffre relativamente scarso contrasto dei tessuti molli, ma scansioni CT possono essere eseguite rapidamente. Pertanto, CT rimane la tecnica di imaging più utilizzata nel trattamento acuto di ictus 16. Inoltre, i sistemi microCT per piccoli animali di imaging non richiedono schermatura contro le radiazioni architettonico da installare, e offrono immagini ad alta risoluzione. Così, microCT combinato con ex vivo riflettanza imaging di fluorescenza o in vivo fluorescenza tomografia 17 è molto utile per le piccole ricerca sugli animali. In alternativa, MRI / CT dual-modale di imaging con Au-Fe nanoparticelle 18-20 può essere anche una piattaforma potente per l'imaging trombo sia negli animali e negli esseri umani; RM e TC possano completarsi a vicenda e, a differenza di imaging ottico, non soffrono il basso problema penetrazione nei tessuti.
content "> In conclusione, CT combinato e di imaging a fluorescenza per la visualizzazione di trombi diretta è un potente strumento di ricerca per lo studio di ictus ischemico, promettendo di migliorare l'individuazione di trombi, il monitoraggio della terapia, e l'individuazione di riocclusioni complicare la terapia. Inoltre, vi è un potenziale significativo per applicazioni cliniche di queste tecniche.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DE.K., JY.K, CH.A, e KK sono i titolari di brevetti di nanoparticelle d'oro di fibrina mirati (10-1474063-0000, coreano Intellectual Property Office). I restanti autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Corea Healthcare Technology R & S del progetto, Ministero della Salute e del Welfare (HI12C1847, HI12C0066), il Programma di Bio & Medical Technology Development (2.010-0.019.862) e programma di Global Research Lab (GRL) (NRF-2015K1A1A2028228) del Fondazione nazionale delle Ricerche, finanziato dal governo coreano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 ml |
References
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