Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

توصيف الخلايا الجذعية البشرية الوحيدات المستمدة من التصوير التدفق الخلوي: مقارنة بين اثنين من بروتوكولات الوحيدات عزل

Published: October 18, 2016 doi: 10.3791/54296
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

Introduction

الخلايا الجذعية (DCS) هي سطاء الأساسية للأنظمة المناعة الفطرية والتكيفية. أنها تعمل على إحداث الاستجابة المناعية الأولية وتسهيل تطوير الذاكرة المناعية. هذه الخلايا هي المسؤولة في المقام الأول عن القبض على مستضد والهجرة وتحفيز الخلايا التائية، وبالتالي يشار إلى مستضد الخلايا كما المهنية (ناقلات الجنود المدرعة) 1 .Manipulation من البلدان النامية يمكن استخدامها عبر مجموعة واسعة من المجالات البحثية وفي إعداد سريرية لعلاج مختلفة الأمراض الالتهابية مثل فيروس نقص المناعة البشرية 6،7، سرطان 8، 9 أمراض المناعة الذاتية، والاستجابات التحسسية 10. كما تستخدم البلدان النامية للبحث تعاطي المخدرات من أجل حل آليات ومسارات مجهولة مثل تلك المرتبطة إدمان الكحول 11-14، إدمان المخدرات 13،15، والجمع بين العدوى وتعاطي المخدرات فيروس نقص المناعة البشرية 16-19. هذه الدراسات الجارية والدراسات البحثية المستقبلية طن مجال علم المناعة تجعل في الجيل المختبر من البلدان النامية في غاية الأهمية للبحث. ومع ذلك، هناك العديد من الصعوبات المرتبطة عزل البلدان النامية من الدم البشري لأنها تشكل فقط 0،1-1٪ من مجموع خلايا الدم وحيدات النوى 20.

حتى الآن، بعض الطرق الراسخة لتوليد البلدان النامية في المختبر يتكون من البلاستيك أو الزجاج التزام حيدات 21،22، والكثافة الطرد المركزي التدرج 23، محددا الفصل على علامة مثل خلية تنشيط المغناطيسية فرز 22، فلوري خلية تنشيط الفرز 24، واختيار إيجابية من وحيدات CD14 + باستخدام المغلفة ديكستران النانوية المغناطيسية 25، والعزلة السريع لحيدات العالية النقاء باستخدام مؤتمتة بالكامل السلبية تحديد الخلية 26. ومع ذلك، فإن أفضل طريقة لاختيار ما زال مثيرا للجدل. لذلك، لتحسين تقنيات الجيل العاصمة، وقد وضعت العديد من الطرق التينقاء هذه الخلايا يمكن أن يزيد بشكل كبير من التمايز من CD34 + السلف الخلايا وحيدات تنقية معزولة من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) 27. كما ذكر قبل، وهي طريقة تستخدم على نطاق واسع وشعبية لتوليد الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية (MDDCs) هو استكشاف قدرة حيدات التمسك الزجاج أو البلاستيك (طريقة الالتزام) 21،22،27. طريقة الالتزام هو طريقة سريعة ومباشرة التي لا تتطلب استخدام معدات معقدة. ومع ذلك، بعض مساوئ هذه العملية تشمل تلوث اللمفاويات، مرونة منخفضة، والوحيدات التلاعب عابر 28. طريقة بديلة لطريقة الالتزام هو العزلة المغناطيسية للحيدات من إجمالي PBMCs، خصوصا مع استخدام عدة تخصيب الوحيدات الإنسان، الذي يهدف إلى عزل حيدات من PBMCs عن طريق الانتقاء السلبية 26. خلال هذا الإجراء، يتم استهداف الخلايا غير المرغوبة لإزالة مع رباعي القسيماتمجمعات الأجسام المضادة والجسيمات المغناطيسية المغلفة ديكستران. وميزة هذه الطريقة العزلة هي أن الخلايا المسمى غير المرغوب فيها يتم فصل باستخدام مغناطيس في حين أن الخلايا المستهدفة يمكن سكب بحرية قبالة في أنبوب جديد دون الحاجة للأعمدة. حتى الآن، مع توافر الاجسام المضادة المحددة التي يمكن تسمية السكان الخلية فريدة من نوعها، أصبحت تقنية الفصل المغناطيسي ليس مجرد وسيلة إضافية، بل ضرورة لعزل خلايا نادرة في مجال علم المناعة. على سبيل المثال، تقنيات مثل خلية الفرز المغناطيسي مع المتاحة تجاريا ممغطس أجهزة ماكينتوش-النانوية سهلت تطوير مناهج جديدة للبحوث والتطبيقات السريرية 22،29. وعلاوة على ذلك، وقد أثبتت الدراسات والأبحاث الحديثة مقارنة الجيل العاصمة من أساليب الالتزام الوحيدات والتكنولوجيا بالاعمال نقاء العاصمة العالي وقابلية استخدام أجهزة ماكينتوش فصل حيدات 22،30.

ويعرض الدراسة الحاليةمقارنة بين طريقتين لتوليد البلدان النامية الإنسان من وحيدات معزولة عن PBMCs: 1) عزل الوحيدات من الالتزام و2) عزل الوحيدات عن طريق الانتقاء السلبية باستخدام طقم تخصيب الوحيدات الإنسان التجارية. وتقدم هذه الدراسة أدلة تثبت أن اختيار الإجراء والفصل المغناطيسي السلبي لعزل حيدات يولد أعلى عائد من وحيدات مع عدم وجود اختلافات كبيرة في جدوى الوحيدات بالمقارنة مع حيدات معزولة بسبب طريقة الالتزام. في المقابل، وبعد سبعة أيام، وحيدات معزولة بواسطة مغناطيس متباينة في MDDCs مع قدرة التكاثري أعلى بكثير وأعلى كمية من الخلايا معربا عن إيجابية مزدوج (CD11c و+ / CD14 +) النمط الظاهري دون التأثير على قابلية MDDC. وعموما، تختلف الدراسة الحالية من الدراسات السابقة المشار إليها أعلاه لأنه يدل على قدرة كل من تقنيات لتوليد في وقت واحد وحيدات القادرة على التكاثر والتفريق في CD11c و+MDDCs (> 70٪) بعد سبعة أيام في الثقافة دون المساس حيويتها. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر النهج الحالي لتوصيف أول مرة من CD11c ومختلف / السكان CD14 MDDCs عن طريق التدفق الخلوي التصوير.

وخلاصة القول، منذ البلدان النامية تلعب دور أساسي فيما يتعلق البحوث في مجال علم المناعة، يجب أن تؤخذ العوامل المختلفة في الاعتبار عند النظر في كيفية تشتق منها وما هي الأساليب المستخدمة لعزل والثقافة لهم في المختبر. ولذلك، تهدف هذه الدراسة إلى تقديم رؤى على طريقتين مختلفتين من العزلة الوحيدات وكيف أن هذه الأساليب تؤثر بشكل مختلف الجدوى الوحيدات والعائد تؤثر في نهاية المطاف شجيري بقاء الخلية، والانتشار، والنمط الظاهري. وسوف تسهم هذه النتائج إلى حد كبير في مجال علم المناعة، وسوف توفر بروتوكول مفصلة من العاصمة العزلة، وتنقية، والتوصيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تم استعراض الدراسات الدم البشرية الشاملة والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) من وحدة الاستخبارات المالية، بروتوكول الاتحاد الدولي للرجبي موافقة الاتحاد الدولي للرجبي # 13-0440. تم شراؤها leukopaks الإنسان من بنك الدم المجتمع في ميامي، فلوريدا.

1. عزل PBMCs من قبل ستاندرد تقنية التدرج الكثافة

  1. إجراء التخفيف 1: 1 من الدم مع مخزنة المالحة 1X الفوسفات في قارورة T75.
  2. ماصة 15 مل من كثافة حل التدرج إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي وبعناية طبقة (25-30 مل / أنبوب) من الدم المخفف على هذا التدرج.
  3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 1200 x ج مع تسارع وتباطؤ 1 0.
  4. بعد الطرد المركزي، وجمع طبقة واجهة (خلايا الدم البيضاء) في جديد 50 مل أنبوب الطرد المركزي وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني (3 دقائق في 1080 x ج). تجاهل طاف في كل مرة.
  5. علاج الخلايا مع عازلة الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم الناشر (ACK) (ليز خلايا الدم الحمراء). إضافة 10 مل من العازلة وفيcubate لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 1080 x ج وتجاهل طاف في كل مرة.
  7. حفظ بيليه، والتي سوف تحتوي على PBMCs.
  8. المضي قدما مع طريقة تنقية الوحيدات في الاختيار.

2. الوحيدات تنقية بواسطة أسلوب الالتزام

  1. إعداد كامل مستنبت الخلية التي تحتوي L-الجلوتامين (300 ملغ / مل)، وتستكمل مع البنسلين (50 U / مل) -streptomycin (50 ميكروغرام / مل) و 10٪ مصل بقري جنيني.
  2. السماح PBMCs على الانضمام لحوالي 2 ساعة قبل زرع لهم في قارورة T75 بتركيز 5 × 10 7 خلايا في 10 مل من المتوسط كاملة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ في حاضنة مرطب.
  3. بعد الحضانة، وإزالة الخلايا العائمة غير ملتصقة من قارورة الثقافة وبلطف غسل الخلايا الملتصقة مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  4. احتضان الخلايا الملتصقة في كامل خلية ثقافة المتوسط ​​تستكمل مع 2 ميكرولتر / مل من البشر محببة-السن الدنياتحفيز مستعمرة ophage عامل (GM-CSF) وانترلوكين 4 (IL-4) المخزنة في تركيز الأسهم من 10 ميكروغرام / مل.
  5. تغيير نصف المتوسط ​​وتجديد السيتوكينات كل 48 ساعة.
  6. السماح 5-7 أيام للتمايز وحيدات في MDDCs.

3. الوحيدات تنقية بواسطة طريقة الفصل المغناطيسي

  1. جمع PBMCs من تقنية التدرج الكثافة القياسية، وتصب في أنبوب البوليسترين 5 مل وإعادة تعليق في برنامج تلفزيوني عازلة في تركيز خلية / مل.
  2. إضافة كوكتيل تخصيب الوحيدات البشري باستخدام 50 ميكرولتر / خلايا مل، وتخلط جيدا واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. بعد الحضانة، إضافة الجزيئات المغناطيسية باستخدام 50 ميكرولتر / خلايا مل، وتخلط جيدا واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. جلب تعليق خلية تصل إلى الحجم الكلي 2.5 مل بإضافة العازلة في برنامج تلفزيوني، مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 2-3 مرات.
  5. وضع أنبوب البوليسترين دون غطاء في الجهاز المغناطيسي وتوضع جانبا في RT لمدة 2.5 دقائق.
  6. بعد مرور فترة الحضانة وفي حركة واحدة متواصلة، والتقاط المغناطيس وتصب المطلوب جزء الوحيدات تنقيته في أنبوب الطرد المركزي 50 مل نظيفة.
  7. احتضان الخلايا الملتصقة في كامل خلية ثقافة المتوسط ​​تستكمل مع 2 ميكرولتر / مل من البشر ومحببة بلعم عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF) وانترلوكين 4 (IL-4) المخزنة في تركيز الأسهم من 10 ميكروغرام / مل.
  8. كل 48 ساعة، وتغير نصف المتوسط، وتدور باستمرار في 1080 x ج لمدة 5 دقائق واعادة تعليق بيليه مع وسائل الإعلام الجديدة (CRPMI) والسيتوكينات.
  9. السماح 5-7 أيام للتمايز وحيدات في MDDCs.

4. التريبان الأزرق الاستبعاد الجدوى الفحص

ملاحظة: استخدام هذا الأسلوب للحصول على العائد الخلية وسلامة PBMCs، وحيدات، وMDDCs.

  1. حصاد الخلايا باستخدام معيار التربسين- EDTA وتنفيذ يغسل من القوارير وبيليه الخلية باستخدام برنامج تلفزيوني. اعتمادا على حجم بيليه، وإعادةتعليق في 5 إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني بحل بيليه.
  2. في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة، نفذ التخفيف 1: 1 من كاشف الأزرق التريبان مع بيليه خلية المخفف.
  3. من هذا المزيج، قسامة 10 ميكرولتر في خلية العد شريحة وقراءة النتائج باستخدام عداد الخلايا الآلي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. إذا عداد الخلايا الآلية غير متوفرة، وعدد خلايا مشابهة من الممكن استخدام عدادة الكريات أو عداد دليل.

5. MTT الفحص

  1. لوحة الخلايا بتركيز 4 × 10 4/100 ميكرولتر من وسائل الإعلام كاملة في كل بئر في لوحة 96-جيدا. اسمحوا 24 ساعة لخلايا للتكيف مع الثقافة.
  2. احتضان وتنفيذ قراءات في 0 (يوم 0)، 36 (يوم 3) و 84 ساعة (يوم 7) على التوالي.
  3. في الانتهاء من الحضانة المطلوب، وإزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وحدها.
  4. إعداد 3- (4،5-dimethylthiazol-2-YL) -2،5-ثنائي الفينيل حل بروميد نتروبلو (الإنتقالي العسكري) (5 ملغ / مل) وذلك بإضافة 10 مل من dimethسلفوكسيد YL ([دمس]) إلى 1 غرام من كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS).
  5. إضافة 10 ميكرولتر (5 ملغ / مل) من محلول MTT إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة إضافية.
  6. بعد الحضانة، وإزالة supernatants التي تحتوي على برنامج تلفزيوني وخليط الإنتقالي العسكري غير محول (حل أصفر اللون).
  7. إضافة 100 ميكرولتر من محلول SDS-DMSO إلى كل بئر واحتضان لمدة ساعة إضافية واحدة.
  8. قراءة الامتصاصية في 540 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة.

6. سطح الخلية تحليل تلطيخ بواسطة التصوير التدفق الخلوي

  1. بعد 7 أيام من التمايز من وحيدات تنقيته، الاستغناء 1X10 6 قسامات خلية من الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات إلى العدد المناسب من 1.5 مل أنابيب.
  2. بدء تلوين سطح الخلية من قبل خلايا منع استخدام 50 ميكرولتر من الحرارة المعطل (مرحبا) في مصل الدم البشري، في احتضان 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. بعد مرور فترة الحضانة، والخلايا الطرد المركزي في 720 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل طاف.
  4. إلى الخلية بيلير، إضافة الأجسام المضادة تألقي مترافق منها (على سبيل المثال، ومكافحة CD11c وأو مكافحة CD14)، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة محمية من الضوء. في أنابيب منفصلة، ​​وإعداد واحدة الملطخة تألقي عينات / مل) منذ تكون هناك حاجة إليها للحصول على تعويض.
  5. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل خلايا مرتين في 1 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في كل مرة في 720 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. حفظ الخلايا محمية من الضوء، وإعادة تعليق في برنامج تلفزيوني عازلة في تركيز خلية / 100 ميكرولتر لتحليل التدفق الخلوي.
  7. من أجل بوابة على خلايا قابلة للحياة، إضافة 1 ميكرولتر من دابي إلى كل أنبوب قبل الحصول على الخلايا على تدفق التصوير خلية واحدة الخلوي أداة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

7. التحليل الإحصائي

  1. إدخال جميع البيانات في جدول بيانات.
  2. مقارنة النتائج باستخدام اختبار (ت) للطالب و / أو في اتجاه واحد أنوفا حسب الاقتضاء.
  3. النظر في الخلافات لتكون ذات دلالة إحصائية إذا ف <0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الوحيدات العائد من الفصل المغناطيسي والعالي بالمقارنة مع الوحيدات الغلة عن طريق أسلوب الالتزام

البيانات الواردة في الشكل 1 عرض PBMC وعدد خلايا الوحيدات من خلال طريقة الاستبعاد التريبان الأزرق في يوم من عزل PBMCs وفصل حيدات. في المتوسط، شكلت حيدات معزولة بسبب طريقة الالتزام لنحو 6.2 في المئة من إجمالي PBMCs في حين شكلت حيدات معزولة بواسطة مغناطيس لمدة تصل إلى 25 في المئة من PBMCs. وكشف التحليل الإحصائي أن نسبة حيدات أسفرت بواسطة مغناطيس كانت أعلى بكثير (≥ 4 أضعاف). يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SD لا يقل عن ثلاثة تجارب مستقلة. التحليل الإحصائي باستخدام ر الطالب -test أظهرت اختلاف كبير في العائد الوحيدات عند المقارنة بين الطريقتين (ص ≤ 0.0005).

_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الوحيدات عزل من الالتزام والفصل المغناطيسي لا تؤثر الوحيدات الجدوى

بعد عزل الوحيدات من قبل اثنين من التقنيات المختلفة المذكورة أعلاه، أجريت فحوصات قابلية للتأكد من أن الأساليب المستخدمة ليست سامة للخلايا والتي تؤثر على سلامة الخلايا. قدمت البيانات في الشكل 2 متوسط في المئة من وحيدات قابلة للحياة معزولة من قبل أي أسلوب الالتزام أو بواسطة مغناطيس. احصي خلايا قابلة للحياة باستخدام طريقة الاستبعاد التريبان الأزرق في يوم من العزلة. وكشفت مقارنة الجدوى في المئة من وحيدات بين أساليب العزلة اللذين الفرق بين المجموعتين لم يكن كبيرا من الناحية الإحصائية. بالإضافة إلى ذلك، كان متوسط ​​في المئة من وحيدات قابلة للحياة معزولة بسبب تمسك 91.75٪ ± 1.66 ومتوسط ​​في المئة من وحيدات قابلة للحياة معزولة من قبل magnكان فصل ETIC 87.4٪ ± 2.75. تم تقييم هذه البيانات الجدوى من ثلاثة على الأقل تجارب مستقلة. تم تحديد إحصائيا باستخدام اختبار (ت) طالب.

الخلايا المشتقة من الخلايا وحيدة النواة المعزولة من الفصل المغناطيسي أظهر زيادة كبيرة في تكاثر الخلايا بالمقارنة مع الخلايا المشتقة من الخلايا وحيدة النواة حصل عليها أسلوب الالتزام

وقد استخدم الإنتقالي العسكري كما مقايسة اللونية لقياس تكاثر الخلايا. في الخلايا الحية، يتم تقليل اللون الأصفر tetrazole من الإنتقالي العسكري لformazan الأرجواني، والتي تقاس بسهولة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. البيانات المقدمة في الشكل (3) تدل على أن كلتا العمليتين من العزلة الوحيدات تؤدي إلى ارتفاع تكاثر الخلايا على مدى 7 أيام كما تم قياسها زيادة في الامتصاصية في اليوم 0 (طريقة الانضمام: 0.22 ± 0.02 مقابل طريقة المغناطيسي: 0.38 ± 0.02)، اليوم طريقة 3 (الالتزام: 0.28 ± 0.02، طريقة المغناطيسي: طريقة 0.55 ± 0.05) ويوم 7 (الالتزام: 0.36 ± 0.01، والمغناطيسية = 0.66 ± 0.006). ومع ذلك، خلافا للفحص XTT (لا تظهر البيانات)، وكشف الفحص الإنتقالي العسكري زيادة كبيرة في تكاثر الخلايا من MDDCs من وحيدات معزولة بواسطة مغناطيس مقارنة MDDCs من وحيدات التي حصل عليها طريقة الالتزام في اليوم 0 (ع = 0.003)، يوم 3 (ع = 0.006)، ويوم 7 (ع = 0.002). تم العثور على تكاثر الخلايا أيضا أن تكون مختلفة بشكل كبير بين أيام 0 و 3 (ع = 0.003)، وبين أيام 0 و 7 (ع <0.001) ضمن مجموعة من MDDCs من وحيدات تنقيته من خلال الفصل المغناطيسي. وعلاوة على ذلك، لوحظ وجود اختلاف كبير في تكاثر الخلايا بين يوم 0 ويوم 7 في MDDCs من وحيدات تنقيته من التصاق (ع = 0.008). وقد أجريت MTT الفحص باستخدام MDDCs تم الحصول عليها من ثلاث تجارب مختلفة. تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام أنوفا واختبار t الطالب، ص ≤ 0.05 ثكما تعتبر كبيرة، وأشار القيم ص على الرسم البياني إلا إذا لم يوجد دلالة إحصائية.

توصيف MDDCs التي كتبها CD11c ووCD14 سطح الخلية تلطيخ

بعد زراعة حيدات لمدة سبعة أيام مع IL-4 و GM-CSF، MDDCs الحصول عليها من وحيدات معزولة بسبب أساليب الالتزام والعزلة المغناطيسية تميزت في الشكل (4). وكشف توصيف منخفضة CD14 واحد + / CD11c- النمط الظاهري أو السكان الوحيدات بحتة في كلتا الطريقتين، التزام = 1٪ ± 1.0 مقابل المغناطيسية = 1٪ ± 0.0 وارتفاع إجمالي CD11c و+ النمط الظاهري، والتقيد = 72٪ ± 11 مقابل المغناطيسي = 79٪ ± 19. ومع ذلك، عندما تم تحليل CD14 الكلي + السكان أبعد من ذلك، كان هناك ارتفاع العائد من خلايا مزدوجة إيجابية لCD11c ووCD14 في كلتا الطريقتين مع الفصل المغناطيسي إعطاء أكبر عدد من CD11c ووCD14 ضعف إيجابيالسكان بالمقارنة مع أسلوب الالتزام والتمسك = 49٪ ± 7 مقابل المغناطيسي = 73٪ ± 15. وعلى الرغم من وجود عائدات أعلى من MDDCs مع النمط الظاهري إيجابي مزدوج عبر الفصل المغناطيسي، وCD11c وإيجابي وCD14 السكان السلبية للMDDCs كان أعلى في طريقة الالتزام. التزام = 23٪ ± 7 مقابل المغناطيسي = 6٪ ± 7. في الشكل 4B، وشدة متوسط مضان (MFI) من كل علامة الفردية ونظرت في عدد السكان بوابات وأظهرت كثافة عالية من CD14 في CD14 + السكان، كثافة تعادل كل من CD11c ووCD14 في عدد السكان إيجابي مزدوج وارتفاع كثافة CD11c وفي CD11c و+ والسكان CD14-. وباختصار، على الرغم من العزلة المغناطيسي يعطي نسبة أعلى من CD11c و+ / CD14 + الخلايا، والتي قد تكون مرحلة متباينة MDDCs المبكر التي لم تراجع بعد علامة الوحيدات (CD14)، وطريقة الالتزام يعطي نسبة أعلى من CD11c و+ / CD14-، التي قد تكون مرحلة متأخرة متباينة السكان MDDC. في المضافاتأيون، تم تنفيذ تلطيخ دابي لتأكيد النتائج الجدوى وضمان أجريت التوصيف على MDDCs الحية. النسبة المئوية للدابي سلبي / الخلايا الحية (التزام = 76 ± 7 مقابل المغناطيسي = 67 ± 1) لا تختلف بشكل كبير بين الطريقتين تؤكد كلتا الطريقتين لا تؤثر على صلاحية MDDCs بعد سبعة أيام في الثقافة.

شكل 1
الشكل 1. الوحيدات العائد من الفصل المغناطيسي وبالمقارنة العالي إلى الوحيدات الغلة عن طريق أسلوب الالتزام. وقد تم عزل عن 6.2٪ من وحيدات من PBMCs باستخدام طريقة الالتزام في حين ~ تم الحصول على 25٪ من وحيدات باستخدام طريقة الفصل المغناطيسي. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SD لا يقل عن ثلاثة تجارب مستقلة. أظهر اختبار (ت) الإحصائي التحليل باستخدام الطالب لاختلاف كبير في العائد الوحيدات عند المقارنة بين الطريقتين(ص = 0. 00005). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الوحيدات عزل من الالتزام والفصل المغناطيسي لا تؤثر الوحيدات الجدوى. وكان متوسط في المئة من وحيدات قابلة للحياة معزولة بسبب تمسك 91.75٪ ± 1.66 وكان متوسط في المئة من وحيدات قابلة للحياة معزولة بواسطة مغناطيس 87.4٪ ± 2.75. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SD النسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة لا تقل عن ثلاث تجارب مستقلة. لم يلاحظ وجود اختلاف كبير في بقاء الخلية عند المقارنة بين الطريقتين تنقية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الخلايا المشتقة من الخلايا وحيدة النواة المعزولة من الفصل المغناطيسي أظهر زيادة كبيرة في تكاثر الخلايا بالمقارنة مع الخلايا المشتقة من الخلايا وحيدة النواة التي حصل عليها طريقة الالتزام. ولوحظ وجود زيادة كبيرة في الامتصاصية لكلتا الطريقتين في كل يوم 3 ويوم 7 عند المقارنة بين القيم ضد الضوابط الخاصة به من اليوم 0. وبالإضافة إلى ذلك، كما أظهر ANOVA واختبار (ت) الطالب اختلاف كبير في امتصاص الإنتقالي العسكري امتصاص عند المقارنة بين الطريقتين (ص ≤ 0.05). يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SD من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

96 / 54296fig4.jpg "/>
الشكل 4. توصيف MDDCs التي كتبها CD11c ووCD14 تلطيخ خلية السطح البياني. أ) بار يمثلون مختلف قطاعات السكان (٪ بوابات خارج الخلايا واحدة). أولا، كانت بوابات DAPI- الخلايا (على قيد الحياة) من مجموع الخلايا واحدة. ثم، كانت بوابات CD14 + / CD11c-، CD11c و+، CD11c و+ / CD14 + وCD11c و+ / CD14- من DAPI- (على قيد الحياة) السكان. CD11c و+ السكان هو الجمع من منطقتين CD11c و+ / CD14 + وCD11c و+ / CD14-. ب) الرسوم البيانية الممثل تظهر شدة متوسط مضان (MFI) القيم لكل من CD11c ووCD14 في كل من السكان من الخلايا. C) المؤامرات الممثل مبعثر من الخلايا المسمى مع CD11c و-APC و CD14-APCcy7 بوابات على دابي سلبية (على قيد الحياة) سكان الخلية لكلتا الطريقتين المغناطيسية والالتزام. الممثل معرض الصور من خلايا مفردة (اختيار باللون الأزرق في المؤامرات مبعثر) الذين ينتمون إلى كل السكان من الباطن من الخلايا، CD11c و+ / CD14- (بوابات باللون البرتقالي)، CD11c و+ / CD14 + (بواباتباللون الأحمر)، وCD14 + (مسور في اللون الأرجواني). في معرض صورة من الخلايا واحد، يمثل اللون الأحمر CD11c وصفت مع APC ويمثل اللون الأصفر CD14 المسمى مع APCcy7. في المؤامرات مبعثر، والألوان المختارة لبوابة السكان بشكل عشوائي ولا ترتبط إلى الصور الخلية الفعلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وبناء على الصعوبات المعروفة للعزل وتوليد MDDCs من دم الإنسان، هذه الدراسة تهدف إلى تقديم مقارنة شاملة طريقتين راسخة لتوليد MDDCs. الطريقة الأولى مقارنة هو الطريقة التقليدية الراسخة لتوليد MDDCs من خلال استغلال قدرة حيدات التمسك الزجاج أو البلاستيك (طريقة الالتزام) 21،22،27. طريقة الالتزام بسرعة وفعالية من حيث التكلفة، ولا يتطلب استخدام معدات معقدة. ومع ذلك، بعض مساوئ هذه العملية تشمل تلوث اللمفاويات، مرونة منخفضة، الوحيدات عابرة 22،30،31 التلاعب. الأسلوب البديل الثاني مقارنة هو العزلة المغناطيسية للحيدات من مجموع الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs) باستخدام عدة تخصيب الوحيدات الإنسان 26، والذي يهدف إلى عزل حيدات من PBMCs عن طريق الانتقاء السلبية. وميزة هذه الطريقة العزلة هي أن الخلايا غير المرغوب فيهاوصفت وفصلها باستخدام مغناطيس بينما انهالت الخلايا المستهدفة بحرية قبالة في أنبوب جديد دون الحاجة للأعمدة ودون استهداف مباشر الخلايا مع الأجسام المضادة. بغض النظر عن طريقة الوحيدات العزلة (تمسكا مقابل الفصل المغناطيسي)، بعد كل الإجراءات، واحدة من الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول هو التحفيز في المختبر وحيدات مع محببة عامل تحفيز بلعم مستعمرة (GM-CSF) وانترلوكين 4 ( IL-4)، وهي مطلوبة لتوليد MDDCs. هذا هو بروتوكول مشترك وراسخة لتوليد MDDCs من خلايا الدم وحيدات النوى دون المساس التقاط مستضد ومميزة القدرة على تجهيز MDDCs غير ناضج 32. واحدة من القيود الرئيسية من التقنيات المستخدمة عادة للجيل في المختبر من البلدان النامية هو العائد المنخفض من الخلايا الطليعية مثل وحيدات. كما ذكرت أعلاه، وشكلت حيدات معزولة بسبب طريقة الالتزام لنحو 6.2 في المئة من إجمالي Pخلايا نخاع العظم، في حين شكلت حيدات معزولة بواسطة مغناطيس لمدة تصل إلى 25 في المئة من PBMCs. وفقا للأدب، يتراوح لالتفاضلي عدد خلايا الدم البيضاء في البالغين العادي للحيدات هو 2-10٪ 31 بينما البلدان النامية تشكل فقط 0،1-1٪ من مجموع خلايا الدم وحيدات النوى 20. لذلك، يمكن أن ارتفاع العائد من وحيدات (~ 25٪) تم الحصول عليها بعد عزلة المغناطيسي يكون راجعا إلى النجاسة من سكان الخلية وعدم وجود الأجسام المضادة و / أو الجسيمات المغناطيسية ملزمة لخلايا غير المرغوب فيها.

لتحقيق عائد مرتفع ونقاء حيدات معزولة، يجب أن يتبع بعناية كل الخطوات الحاسمة في البروتوكول. خلال عزل PBMCs من الدم عن طريق معيار الطرد المركزي التدرج الكثافة، هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة. أولا، pipetting لوطبقات بعناية من الدم على مدى كثافة حل التدرج إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي هو خطوة تتطلب الممارسة منذ pipetting لبقسوة يمكن أن يسبب اختلاط هذا الحل والدم،مما قد يؤدي إلى ضعف طبقة PBMC التي يصعب عزل، أو أنها يمكن أن تؤدي إلى خليط كاملة من خلايا الدم الحمراء مع PBMCs. في هذه الخطوة، فمن المهم للحفاظ على تدفق مستمر وبطيئة نسبيا من pipetting للطبقة محددة جيدا من الدم وطبقة PBMC متميزة. ثانيا، الطرد المركزي في الخطوة التالية مع تسارع وتباطؤ 1 0 حرج للغاية. إذا لم يتم استخدام هذه الإعدادات للخطوة الطرد المركزي الأولى، فإنه سوف يؤدي إلى اختلاط الدم مع الحل التدرج الكثافة بطريقة متقطعة ولن فصل PBMCs من بقية مكونات الدم. ثالثا، من المهم أن احتضان PBMCs مع الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) الناشر عازلة لمدة لا تزيد الوقت الأمثل (10-15 دقيقة) منذ حضانة أطول مع ACK يمكن أن يؤدي إلى الحد من PBMCs قابلة للحياة جنبا إلى جنب مع خلايا الدم الحمراء . وبالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أيضا أن تنفيذ يغسل PBS بعد ACK الحضانة. ومع ذلك، إذا لم تكن هي lysed خلايا الدم الحمراء مع أولACK خطوة، وأنها لا تزال مستمرة في الظهور بعد يغسل، وجولة أخرى من الناشر ACK ينصح بشدة.

بعد عزل خلايا الدم البيضاء، وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة أن نأخذ في الاعتبار عند تنفيذ طريقة الالتزام توليد حيدات. لأول مرة، وغسل قبالة الخلايا الليمفاوية العائمة بعد ساعتين من PBMCs حضانة مهم جدا لأن وجود الخلايا الليمفاوية العائمة يمكن أن يسبب أقل حيدات على الانضمام ويمكن أن يؤدي أيضا إلى انخفاض نقاء MDDC. وعلى الرغم من هذه الخطوات غسل حاسمة، والإفراط وغسل قاسية (أكثر من الموصى بها، أي مرتين) يمكن أن يسبب غسل قبالة حيدات ملتصقة جدا، مما أدى إلى انخفاض العائد الوحيدات. ثانيا، احتضان الخلايا مع المتوسطة كاملة والسيتوكينات أمر بالغ الأهمية منذ السيتوكينات هي المسؤولة عن التفريق بين وحيدات في MDDCs. بالإضافة الى، تغيير وسائل الإعلام وتجديد السيتوكينات كل 48 ساعة من المهم بالنسبة للتمايز وبقاء الخلايا. في حين أن تغيير وسائل الإعلام، من الأهمية بمكان أيضا لإنقاذ MDDCs العائمة والعودة إليها مرة أخرى في الثقافة جنبا إلى جنب مع وسائل الإعلام الجديدة والسيتوكينات لأن هناك بعض MDDCs التي يمكن أن تنفصل عن السطح خلال عملية التمايز. من المهم أيضا للتأكد من أن يتم المصنف وحيدات في التركيز الموصى بها، تعلق ومتباعدة عن كثب لأنها تحتاج الخلية إلى خلية الاتصال من أجل أن تنمو. عند تنفيذ طريقة الفصل المغناطيسي لتوليد حيدات، وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة من أجل الحصول على محصول جيد ونقاء عالية وحيدات. أولا، من المهم جدا للحفاظ على تركيز خلية الموصى به من قبل الشركة المصنعة. ومن المهم أيضا أن لا تعكر صفو أنبوب البوليسترين عند وضعها في المغناطيس، لأنها قد تؤدي إلى أقل المحصول ونقاء أقل. كما وردت أعلاه، هذا الأسلوب يؤدي إلى تحقيق عائد أعلى بكثير الوحيدات (الشكل 1) بالمقارنة مع طريقة الالتزام، والتي قد تكون ذات صلة إلى وجود ج أخرىملتعلمي اللغة اإلنكليزية. وعلاوة على ذلك، عندما وصفت الخلايا عن طريق التدفق الخلوي، ويبين طريقة المغناطيسي على نسبة مئوية أعلى من الخلايا إيجابية مزدوجة (CD11c و+ / CD14 +)، والتي قد ترتبط مع وجود خلايا أخرى أو قد يكون أيضا بسبب وجود مراحل مختلفة من MDDC التمايز.

جانب آخر مهم في المختبر الجيل MDDC بغض النظر عن العائد والنقاء هو القدرة على توليد MDDCs قابلة للحياة والتكاثري. وتقدم الدراسة الحالية الأدلة لإثبات أن كل من طرق تنقية تحفز انتشار MDDCs (الشكل 3) كما يتضح من زيادة في الخلايا النشاط الأيضي خلال سبعة أيام في الثقافة. وبالإضافة إلى ذلك، أظهر الجيل من MDDCs من وحيدات تنقيته بواسطة مغناطيس معدل أعلى بكثير من انتشار يقارن MDDCs الناتجة عن حيدات تنقيته من التصاق (الشكل 3). هذه النتائج تتفق مع الدراسات السابقة مما يدل على أن زeneration من البلدان النامية من CD34 + الخلايا هو عملية التكاثري بسبب وجود أسلاف العاصمة التكاثري في الدم البشري 27، 33. ومع ذلك، هناك نتائج مثيرة للجدل مما يدل على أن حيدات يمكن أيضا أن تفرق في البلدان النامية دون أي دليل على انتشار 34،35. ومن المهم أن نشير إلى أن هناك الكثير من الجدل حول الجيل في المختبر من البلدان النامية وبشأن ما إذا كان يتم إنشاؤها البلدان النامية من السلائف انتشارها أو من التفريق بين حيدات. على سبيل المثال، وقد ثبت في المختبر إنتاج العاصمة من خلايا الدم الطرفية ملتصقة إلى إثراء أيضا لخلايا السلف التي هي قادرة على الانتشار بعد التعرض لGM-CSF 27، وهناك أيضا أدلة تثبت أن العائد من البلدان النامية مشتقة في وجود GM-CSF و IL-4 لا يمكن توسيعها وراء عدد من بدء حيدات 33. وعموما، توضح الدراسة الحالية إلى زيادة في انتشار مونخلايا ocytic في الثقافة التي كتبها سبعة أيام يؤدي إلى إجمالي السكان MDDCs مع> 70٪ CD11c و+ النمط الظاهري (التزام = 72٪ ± 11 مقابل المغناطيسي = 79٪ ± 19). ومن المهم أن نشير إلى أنه عندما تم إجراء مزيد من التحليل المظهري، وإن لم يكن كبيرا، وحيدات معزولة بسبب طريقة الفصل المغناطيسي أسفرت MDDCs مع النمط الظاهري إيجابي أعلى مزدوج (التزام = 49٪ ± 7 CD11c و+ / CD14 + مقابل المغناطيسية = 73٪ ± 15 CD11c و+ / CD14 +)، في حين أسفرت حيدات معزولة بسبب التصاق في MDDCs مع النمط الظاهري أعلى واحد إيجابي (التزام = 23٪ ± 7 CD11c و+ / CD14- مقابل المغناطيسي = 6٪ ± 7 CD11c و+ / CD14-). MDDCs مع ارتفاع النمط الظاهري إيجابي مزدوج (CD11c و+ / CD14 +) قد تكون في مراحل مبكرة من التمايز في حين MDDCs مع النمط الظاهري إيجابي واحد أعلى قد يكون في مراحل متأخرة من التمايز.

في الخلاصة، توفر هذه الدراسة أدلة تدعم أن اختيار السلبية الاجراء الفصل المغناطيسيه لعزل حيدات يولد أعلى عائد من وحيدات مع عدم وجود اختلافات كبيرة في جدوى الوحيدات بالمقارنة مع حيدات معزولة بسبب طريقة الالتزام. في المقابل، وبعد سبعة أيام، وحيدات معزولة بواسطة مغناطيس متباينة في MDDCs مع قدرة التكاثري أعلى بكثير وأعلى كمية من الخلايا معربا عن إيجابية مزدوج (CD11c و+ / CD14 +) النمط الظاهري دون التأثير على قابلية MDDC. عند المقارنة بين الطريقتين، وقد أظهرت النتائج قدرة كل من التقنيات لتوليد في وقت واحد وحيدات القادرة على التكاثر (الشكل 3) والتمييز (الشكل 4) في CD11c و+ MDDCs بعد سبعة أيام في الثقافة منذ أثمرت كلتا الطريقتين> 70٪ CD11c و+ MDDCs . ومع ذلك، قد يثبت مزيد من التحليل النظر في علامات النضج مفيد لتوصيف كامل للسكان MDDC وظيفية. في الختام، كلتا الطريقتين هي بدائل مفيدة لعزل CD11c و+ MDDCs والأقليمبيئة تطوير متكاملة عائد كاف لتطبيقات البحوث بل وربما يكون من المفيد للتطبيقات السريرية في المستقبل. المختبر تركز حاليا على توليد MDDCs لدراسة الآثار المترتبة على تعاطي الكحول وغيرها من المواد الاعتداء على نظام المناعة الفطري، في ولا سيما قدرة هذه المواد لتعديل MDDC النمط الظاهري وظيفة. ولذلك، فإن الدراسة الحالية توفر الأساس لتوصيف MDDC وتعزيز القدرة على المضي قدما في مزيد من التجارب من أجل توضيح الآليات الجزيئية التوسط وظيفة الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات في سياق تعاطي المخدرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-5442-03 Must be used at RT
Phosphate-buffered saline (PBS) Life Technologies 10010-023
ACK Lysing buffer Quality Biological 118-156-101
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240-062
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000-044
RoboSep buffer StemCell 20104
EasySep Human monocyte enrichment kit StemCell 19059
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0101
FITC-Dextran Sigma Aldrich FD4-100MG
Trypan blue stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Synergy 2 multi-mode reader Biotek 7131000
XTT Sodium salt bioreagent (XTT) Sigma Aldrich X4626-100MG
Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) Sigma Aldrich D8418-500ML
Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) Sigma Aldrich m5655-500MG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0302
Phenazine Methosulfate (DMSO) Sigma Aldrich P9626-1G
Inactivated (HI) Human Serum Chemicon S1-100ML
Accuri C6 Flow Cytometer BD Accuri 653119
FlowSight Amnis Flow Cytometer EMD Millipore 100300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  3. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  4. Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
  5. Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
  6. Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
  7. Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
  8. Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
  9. Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
  10. Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
  11. Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
  12. Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
  13. Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
  14. Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
  15. Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
  16. Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
  17. Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
  18. Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
  19. Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
  20. Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
  21. Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
  22. Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
  23. Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
  24. Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
  25. Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
  26. Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
  27. Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
  28. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
  29. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
  30. El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
  31. Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
  32. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
  33. Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
  34. Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
  35. Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
  36. Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
  37. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
  38. Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
  39. Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
  40. Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).

Tags

علم المناعة، العدد 116، الإنسان، خلايا الوحيدات المستمدة شجيري، وحيدات، وتقنيات العزل، والجهاز المناعي، والفصل المغناطيسي
توصيف الخلايا الجذعية البشرية الوحيدات المستمدة من التصوير التدفق الخلوي: مقارنة بين اثنين من بروتوكولات الوحيدات عزل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Figueroa, G., Parira, T., Laverde,… More

Figueroa, G., Parira, T., Laverde, A., Casteleiro, G., El-Mabhouh, A., Nair, M., Agudelo, M. Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols. J. Vis. Exp. (116), e54296, doi:10.3791/54296 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter