Introduction
Дендритные клетки (ДК) являются важными медиаторами врожденной и адаптивной системы иммунитета. Они действуют, чтобы вызвать первичные иммунные реакции и способствуют развитию иммунологической памяти. Эти клетки в первую очередь ответственны за захват антигена, миграции и стимуляции Т - клеток и, следовательно , называют профессиональных антиген - представляющих клеток (АРС) 1 .Manipulation ДК могут быть использованы в самых различных областях исследований и в клинических условиях для лечения различных воспалительных заболеваний , таких как ВИЧ , 6,7, рак 8, аутоиммунные заболевания 9, а также аллергические реакции 10. Контроллеры домена также используются для исследования злоупотреблением вещества для того , чтобы решить неизвестные механизмы и пути , такие как те , которые связаны с алкогольной зависимостью 11-14 наркотической зависимости 13,15, и сочетание инфекции и наркомании ВИЧ 16-19. Эти текущие исследования и будущие научные исследования Iп области иммунологии делают в пробирке поколения РС чрезвычайно важны для исследования. Тем не менее, существуют некоторые трудности , связанные с выделением контроллеров домена из крови человека , поскольку они составляют лишь 0,1 - 1% от общего количества мононуклеарных клеток крови 20.
На сегодняшний день некоторые из хорошо известных методов для генерации РС экстракорпорального состоит из пластика или стекла адгезии моноцитов 21,22, центрифугирования в градиенте плотности 23, удельная разделения на основе маркеров , таких как магнитная активированной сортировки клеток 22, флуоресцентная сортировка клеток 24, положительный выбор CD14 + моноцитов с использованием декстрана покрытием магнитных наночастиц 25 и быстрое выделение высокоочищенных моноцитов с использованием полностью автоматизированной негативной селекции 26 клеток. Тем не менее, лучшим методом выбора остается спорным. Таким образом, для улучшения методов генерации постоянного тока, несколько методов были разработаны, в которыхЧистота этих клеток может быть значительно увеличена путем дифференцировки из очищенных CD34 + клеток - предшественников и моноцитов , выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) 27. Как упоминалось до, широко используемый и популярный метод для генерации моноцитов дендритных клеток (MDDCs) заключается в изучении способности моноцитов придерживаться стекла или пластика (метод спаек) 21,22,27. Метод прилипание является быстрым и простым способом, который не требует использования сложного оборудования. Тем не менее, некоторые недостатки этого процесса включают загрязнение лимфоцит, низкую гибкость и моноцитов переходную манипуляцию 28. Альтернативный метод метода прилипание магнитная изоляция моноцитов от общего МНПК, в частности , с использованием человеческого набора обогащения моноцитов, который предназначен для выделения моноцитов МНПК путем негативного отбора 26. Во время этой процедуры нежелательные клетки предназначены для удаления с тетрамернойантитело и магнитные частицы, покрытой декстраном. Преимущество этого способа выделения является то, что нежелательные меченые клетки отделяются с помощью магнита в то время как клетки-мишени могут быть свободно слили в новую пробирку без необходимости колонн. На сегодняшний день, при наличии специфических моноклональных антител, которые могут маркируют уникальные клеточные популяции, метод магнитной сепарации становится не просто дополнительный метод, а необходимость для выделения редких клеток в области иммунологии. Например, методы , такие как магнитно сортировки клеток с коммерчески доступными парамагнитных MACS-наночастиц способствовали разработке новых подходов для проведения исследований и клинических применений 22,29. Кроме того, последние научные исследования , сравнивающие поколение постоянного тока от прилипания моноцитов и технологии MACS методы продемонстрировали более высокую чистоту и жизнеспособность DC с использованием MACS разделенных моноциты 22,30.
Настоящее исследование представляетсравнение между двумя методами генерации человеческих моноцитов из ГЦ, выделенных из МНПК: 1) моноцитов изоляции путем присоединения и 2) моноцитов изоляции путем негативной селекции с использованием коммерческого набора обогащения моноцитов человека. Это исследование свидетельствует о том, чтобы показать, что отрицательная магнитная процедура разделения выбора для выделения моноцитов генерирует наибольший выход моноцитов без каких-либо существенных различий в жизнеспособности моноцитов по сравнению с моноцитами, выделенных методом прилипания. В свою очередь, через семь дней, моноциты, выделенные магнитной сепарации дифференцировались в MDDCs со значительно более высоким пролиферативным потенциалом и более высоким количеством клеток, экспрессирующих дважды положительных (CD11c + / CD14 +) фенотипа, не затрагивая жизнеспособность MDDC. В целом, данное исследование отличается от предыдущих исследований, упоминаемых выше, так как он демонстрирует способность обоих методов, чтобы одновременно генерировать моноциты, которые способны пролиферировать и дифференцироваться в CD11c +MDDCs (> 70%) после семи дней в культуре без ущерба для их жизнеспособности. Кроме того, в настоящее время подход предусматривает впервые характеристики различных популяций CD11c / CD14 MDDCs методом проточной цитометрии изображений.
Таким образом, так как контроллеры домена играют роль фокусного отношении проведения исследований в области иммунологии, различные параметры должны быть приняты во внимание при рассмотрении вопроса о том , как они получены , и какие методы используются для выделения и культуры их в пробирке. Таким образом, данное исследование направлено на дать представление о двух различных методов выделения моноцитов и как эти методы дифференцированно влияют на жизнеспособность моноцитов и выход в конечном счете, затрагивающего дендритных жизнеспособность клеток, пролиферации и фенотип. Эти результаты будут в значительной степени способствовать области иммунологии и предоставит подробный протокол постоянного выделения, очистки и характеристики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В целом исследования крови человека были рассмотрены и одобрены Советом по институциональному (IRB) ПФР, IRB протокол утверждения # IRB-13-0440. Человеческие leukopaks были приобретены у банковского сообщества крови в Майами, штат Флорида.
1. Выделение МКПК с помощью стандартной плотности Gradient Technique
- Выполните 1: 1 разбавление крови с 1х-фосфатно-буферном солевом растворе в колбе Т75.
- Пипетка 15 мл раствора градиента плотности в 50 мл центрифужные пробирки и тщательно слой (25 - 30 мл / трубка) разведенной крови над этим градиентом.
- Центрифуга в течение 20 мин при 1200 х г с ускорением 1 и замедления 0.
- После центрифугирования собирают граничный слой (белых кровяных телец) в новый 50 мл центрифужную пробирку и промыть клетки дважды в PBS (3 мин при 1,080 мкг). Удалите супернатант каждый раз.
- Лечить клеток с (ACK) буфера аммоний хлорид калия лизировать (лизировать эритроциты). Добавьте 10 мл буфера и вcubate в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
- Промыть клетки дважды PBS, центрифуга в течение 3 мин при 1,080 мкг и отбросить супернатант каждый раз.
- Сохранить осадок, который будет содержать МНПК.
- Продолжайте метод очистки моноцитов выбора.
2. моноцитов Очистка с помощью метода ПРИСОЕДИНЕНИЯ
- Подготовить всю клеточную культуральную среду, содержащую L-глутамина (300 мг / мл) и добавлением пенициллина (50 ед / мл) -streptomycin (50 мкг / мл) и 10% фетальной телячьей сыворотки.
- Разрешить МНПК придерживаться в течение примерно 2 ч при культивировании их в Т75 колбы при концентрации 5 × 10 7 клеток на 10 мл полной среды при 37 ° С и 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
- После инкубации удалить неадгезированных плавающих клеток из культуральной колбы и осторожно промыть прилипшие клетки дважды PBS.
- Выдержите адгезивных клеток в полной среде для культивирования клеток, дополненной 2 мкл / мл человеческого гранулоцитарного MACRophage колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и интерлейкин 4 (IL-4), хранящегося в наличии концентрации 10 мкг / мл.
- Изменение половины среды и пополнения цитокины каждые 48 ч.
- Разрешить 5 - 7 дней для дифференциации моноцитов в MDDCs.
3. моноцитов Очистка с помощью магнитного метода разделения
- Сбор МНПК от стандартной методики в градиенте плотности, влить в полистирола пробирку объемом 5 мл и повторно приостанавливать в буфере PBS при концентрации клеток / мл.
- Добавьте человеческий коктейль обогащения моноцитов с использованием клеток / мл 50 мкл, хорошо перемешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 10 мин.
- После инкубации, добавьте магнитные частицы, используя / мл клеток 50 мкл, хорошо перемешивают и инкубируют при 4 ° С в течение 5 мин.
- Принесите клеточной суспензии до общего объема 2,5 мл, добавляя PBS буфера, хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз 2 - 3 раза.
- Поместите трубку из полистирола без колпачка в магнитное устройство и отложите в сторону при комнатной температуре в течение 2.5 мин.
- После инкубации и в одном непрерывном движении, поднимите магнит и вылить желаемый очищенный фракции моноцитов в чистую 50 мл центрифужную пробирку.
- Выдержите адгезивных клеток в полной среде для культивирования клеток, дополненной 2 мкл / мл человеческого гранулоцитов-макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и интерлейкин-4 (ИЛ-4), хранящегося в наличии концентрации 10 мкг / мл.
- Каждый 48 ч, менять половину среды, спином вниз на 1,080 мкг в течение 5 минут и повторно приостанавливать осадок с новыми медиа (CRPMI) и цитокинов.
- Разрешить 5 - 7 дней для дифференциации моноцитов в MDDCs.
4. трипанового синего Жизнеспособность Пробирной
Примечание: Используйте эту технику , чтобы получить выход клеток и жизнеспособность РВМС, моноцитов и MDDCs.
- Клетки Harvest с использованием стандартного трипсин-ЭДТА и выполняют промывками колбы и осадок клеток с использованием PBS. В зависимости от размера гранул, повторноприостанавливать в 5 до 10 мл PBS, чтобы растворить осадок.
- В микро-центрифуге трубки, выполнить разбавление 1: 1 трипанового синего реагента с разбавленным осадку клеток.
- Из этой смеси, аликвоты 10 мкл в ячейку подсчета слайд и чтения результатов с использованием автоматического счетчика клеток в соответствии с протоколом производителя. Если автоматизированный счетчик клеток не доступен, аналогичное количество клеток можно с помощью гемоцитометра или ручного счетчика.
5. МТТ
- Пластина клеток при концентрации 4 х 10 4/100 мкл полной среды в каждую лунку в 96-луночный планшет. Разрешить 24 ч для клеток, чтобы приспособиться к культуре.
- Выдержите и выполнять показания при 0 (0 день), 36 (3-й день) и 84 (7-й день) ч соответственно.
- По завершении желаемого инкубации удалить средства массовой информации и заменить 100 мкл PBS в одиночку.
- Готовят 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил раствор тетразолия (МТТ) (5 мг / мл) путем добавления 10 мл dimethил сульфоксид (ДМСО) до 1 г додецилсульфата натрия (SDS).
- Добавляют 10 мкл (5 мг / мл) раствора МТТ в каждую лунку и инкубировали при 37 ° С в течение 2-х дополнительных часов.
- После инкубации удалить супернатанты, содержащие PBS и не превращенный МТТ (смесь желтого цвета раствора).
- Добавляют 100 мкл раствора SDS-ДМСО в каждую лунку и инкубировать в течение одного дополнительного часа.
- Измерить оптическую плотность при 540 нм с использованием микропланшет-ридера.
6. Окрашивание поверхности клеток Анализ изображений проточной цитометрии
- Через 7 дней дифференцировки из очищенных моноцитов, дозировать 1x10 6 клеток аликвоты моноцитов дендритные клетки в соответствующее число 1,5 мл пробирки.
- Начало клеточной поверхности окрашивания путем блокирования клеток с использованием 50 мкл инактивированной нагреванием (HI), сыворотка крови человека, инкубируют при 4 ° С в течение 10 мин.
- После инкубации клетки центрифугированием при 720 х г в течение 5 мин, отбросить супернатант.
- Для клеток Pelleт, добавить соответствующие Флуорохром-конъюгированные антитела (например, анти-CD11c или анти-CD14) и инкубируют при 4 ° С в течение 20 мин в защищенном от света. В отдельных трубок, готовят одиночные Флуорохром окрашенных образцов / мл), так как они необходимы для компенсации.
- После инкубации, мыть клетки дважды в 1 мл PBS буфера и центрифуге каждый раз при 720 мкг в течение 5 мин.
- Поддержание клеток в защищенном от света, повторно приостанавливать в буфере PBS при концентрации клеток / 100 мкл для анализа потока цитометрии.
- Для того, чтобы ворота на жизнеспособных клеток, добавить 1 мкл DAPI в каждую пробирку до приобретения клеток на едином потоке визуализации клеток цитометрии прибор в соответствии с инструкциями изготовителя.
7. Статистический анализ
- Ввод всех данных в электронную таблицу.
- Сравните результаты с помощью Т-теста студента и / или одностороннюю ANOVA в зависимости от обстоятельств.
- Рассмотрим различия статистически значимыми, если р <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Моноцитов Выход магнитной сепарацией выше по сравнению с моноцитов Выход по методу ПРИСОЕДИНЕНИЯ
Данные , представленные на рисунке 1 отображения РВМС и подсчета клеток моноцитов с помощью трипанового синего методом исключения в день изоляции МНПК и разделения моноцитов. В среднем, моноциты, выделенные методом прилипания составляли примерно 6,2 процента от общего объема МНПК в то время как моноциты, выделенные магнитной сепарации приходится до 25 процентов от МНПК. Статистический анализ показал, что процент моноцитов, полученных в результате магнитной сепарации были значительно выше (≥ 4 раза). Данные выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение по меньшей мере, в трех независимых экспериментах. Статистический анализ с использованием т студента -test показал значительную разницу доходности моноцитов при сравнении двух методов (р ≤ 0,0005).
_content "ВОК: Keep-together.within-страницу =" 1 "> моноцитов Изоляция приверженностью и магнитной сепарации не влияют моноцитов ЖизнеспособностьПосле выделения моноцитов двумя различными способами, описанными выше, жизнеспособность анализы проводили, чтобы гарантировать, что методы, используемые не были цитотоксические и влияющих на жизнеспособность клеток. Данные , представленные на рисунке 2 дисплея в среднем процент жизнеспособных моноцитов , выделенных либо методом прилипания или путем магнитной сепарации. Жизнеспособные клетки подсчитывали с использованием трипанового синего метод исключения в день изоляции. Сравнение процента жизнеспособности моноцитов между двумя методами выделения показало, что разница между обеими группами не было статистически значимым. Кроме того, среднее значение процента жизнеспособных моноцитов, выделенных спайки 91,75% ± 1,66 и среднее значение процента жизнеспособных моноциты выделяют MAGNэтический разделение было 87,4% ± 2,75. Эти данные жизнеспособность были оценены по крайней мере из трех независимых экспериментов. Статистическая значимость была определена с использованием Т-теста студента.
Клетки , полученные из моноцитов , изолированных с помощью магнитной сепарации Показать значительное увеличение пролиферации клеток по сравнению с клетками , выделенных из моноцитов , приобретаемые методом ПРИСОЕДИНЕНИЯ
МТТ был использован в качестве колориметрического анализа для измерения пролиферации клеток. В живых клетках, желтый цвет тетразол МТТ снижается до фиолетового формазана, который легко измерить с помощью спектрофотометра. Данные , представленные на рисунке 3 , показывают , что оба процесса выделения моноцитов приводит к более высокой клеточной пролиферации в течение 7 дней , как измерено увеличением оптической плотности в 0 день (метод прилипания: 0,22 ± 0,02 по сравнению с магнитным методом: 0,38 ± 0+0,02), День Метод 3 (присоединение: 0,28 ± 0,02, магнитный метод: метод 0,55 ± 0,05) и 7-й день (присоединение: 0,36 ± 0,01, магнитная = 0,66 ± 0,006). Тем не менее, в отличие от анализа ХТТ (данные не показаны), МТТ-анализе показал значительное увеличение пролиферации клеток MDDCs из моноцитов, выделенных магнитной сепарации по сравнению с MDDCs из моноцитов, полученных методом прилипания на 0-й день (p = 0,003), 3-й день (р = 0,006), и 7-й день (р = 0,002). пролиферации клеток было также установлено, существенно различаются между днями 0 и 3 (р = 0,003), а между днями 0 и 7 (р <0,001) в группе MDDCs из моноцитов очищают с помощью магнитной сепарации. Кроме того, наблюдалось значительное различие в клеточной пролиферации между 0-й день и 7-й день в MDDCs из моноцитов очищают с помощью адгезии (р = 0,008). МТТ анализ проводили с использованием MDDCs, полученных из трех различных экспериментов. Статистическая значимость определяли с помощью ANOVA и трет-Стьюдента, р ≤ 0,05 Вт, как считается значимым, и р значения отмечены на графике, если нет статистической значимости не было найдено.
Характеристика MDDCs по CD11c и CD14 клеточной поверхности Окрашивание
После культивирования моноциты в течение семи дней с IL-4 и GM-CSF, MDDCs , полученный из моноцитов , выделенных за счет присоединения и магнитной изоляции методами были охарактеризованы на рисунке 4. Характеристику показали низкий сингл CD14 + / CD11c- фенотип или чисто моноцитарного населения в обоих методах, прилипание = 1% ± 1,0 по сравнению с магнитным = 1% ± 0,0 и высокой общей CD11c + фенотипа, присоединение = 72% ± 11 в сравнении с магнитным = 79% ± 19. Тем не менее, когда общая CD14 + популяция анализировалась далее, существует высокий выход клетки дважды положительных для CD11c и CD14 в обоих методах с магнитной сепарации дает большее количество CD11c и CD14 двойной положительнойнаселения по сравнению с методом прилипания, присоединение = 49% ± 7 по сравнению с магнитным = 73% ± 15. Несмотря на то, был более высокий выход MDDCs с двойной положительной фенотипа посредством магнитной сепарации, в CD11c положительного и отрицательного CD14 населения MDDCs была выше в способе присоединения; присоединение = 23% ± 7 по сравнению с магнитным = 6% ± 7. На фиг.4В, средняя интенсивность флуоресценции (MFI) каждого отдельного маркера смотрят в закрытом населения и показал высокую интенсивность CD14 в CD14 + популяции, эквивалентная интенсивность обоих CD11c и CD14 в двойной положительной населения и высокой интенсивности CD11c в CD11c + и CD14- населения. Таким образом, даже если магнитная изоляция дает более высокий процент CD11c + / CD14 + клеток, что может быть на ранней стадии развития дифференцируются MDDCs, которые еще не выронил моноцитарный маркер (CD14), метод присоединение дает более высокий процент CD11c + / CD14-, которая может быть поздняя стадия дифференцированы MDDC населения. В Additион, DAPI окрашивание проводили для подтверждения результатов жизнеспособности и для обеспечения характеристик проводили на живых MDDCs. Процент DAPI отрицательного / живые клетки (соблюдение = 76 ± 7 по сравнению с магнитным = 67 ± 1) значимо не отличаются между этими двумя методами, подтверждающих оба метода не влияют на жизнеспособность MDDCs после семи дней в культуре.
Рисунок 1. моноцитов Выход магнитной сепарацией выше по сравнению с моноцитов Выход методом ПРИСОЕДИНЕНИЯ. О 6,2% моноцитов были выделены из МНПК с использованием метода примыкания в то время как ~ 25% моноцитов были получены с использованием метода магнитной сепарации. Данные выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение по меньшей мере, в трех независимых экспериментах. Т-тест статистический анализ с использованием студента показал значительную разницу доходности моноцитов при сравнении двух методов(р = 0. 00005). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Выделение моноцитов приверженностью и магнитной сепарации не влияют моноцитов жизнеспособностью. Среднее значение процента жизнеспособных моноцитов , выделенных за счет присоединения была 91,75% ± 1,66 и в среднем процент жизнеспособных моноцитов , выделенных магнитной сепарации была 87,4% ± 2.75. Данные выражены в виде среднего значения ± SD процент жизнеспособных клеток по крайней мере, в трех независимых экспериментах. Никаких существенных различий не наблюдалось в жизнеспособности клеток при сравнении двух методов очистки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. клетки , полученные из моноцитов Выделен магнитной сепарации Показать значительное увеличение пролиферации клеток по сравнению с клетками , выделенных из моноцитов , приобретаемые методом ПРИСОЕДИНЕНИЯ. Значительное увеличение оптической плотности наблюдалось для обоих методов в обоих 3 -й день и 7 -й день при сравнении значений против ее соответствующих управлений день 0. Кроме того, ANOVA и критерий Стьюдента также показал значительную разницу в оптической плотности поглощения МТТ при сравнении двух методов (р ≤ 0,05). Данные выражены в виде среднего значения ± SD трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
96 / 54296fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Характеристика MDDCs по CD11c и CD14 поверхности клеток окрашиванию. А) Бар графа , представляющих различные группы населения (% закрытого типа из отдельных клеток). Во-первых, DAPI- (живые) клетки закрытого типа от общего количества одиночных клеток. Тогда, CD14 + / CD11c-, CD11c +, CD11c + / CD14 + и CD11c + / CD14- были закрытого типа от DAPI- (живой) населения. CD11c + население является суммирование двух областей CD11c + / CD14 + и CD11c + / CD14-. B) Типичные графики , показывающие средней интенсивности флуоресценции (MFI) значения для обоих CD11c и CD14 в каждой субпопуляции клеток. C) представитель разброс участков клеток маркированы с CD11c-APC и CD14-APCcy7 закрытого типа на DAPI отрицательной (живой) популяции клеток для обоих магнитных и соблюдение методов. Представитель галереи изображений отдельных клеток (выбирается синим цветом в разброс участков), принадлежащих к каждому субпопуляции клеток, CD11c + / CD14- (закрытого типа в оранжевый цвет), CD11c + / CD14 + (закрытого типав красном цвете), и CD14 + (закрытого типа в фиолетовый цвет). В галерее изображений отдельных клеток, красный цвет представляет CD11c метили APC и желтый цвет представляет собой CD14, меченного APCcy7. В разброс участков, цвета , выбранные для ворот популяции являются случайными и не коррелируют с реальными изображениями клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
На основании известных трудностей выделения и генерации MDDCs из человеческой крови, настоящее исследование с целью обеспечить всестороннее сравнение двух хорошо известных методов для генерации MDDCs. Первый способ по сравнению является хорошо установленный традиционный способ генерации MDDCs за счет использования способности моноцитов прилипать к стеклу или пластмассы (метод спаек) 21,22,27. Метод прилипание является быстрым и экономически эффективным, и не требует использования сложного оборудования. Тем не менее, некоторые недостатки этого процесса включают загрязнение лимфоцит, низкая гибкость, моноцитов переходные манипуляции 22,30,31. Второй альтернативный способ по сравнению магнитная изоляция моноцитов от общего количества мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) с использованием человеческого набора обогащения моноцитов 26, который предназначен для выделения моноцитов из МНПК путем негативной селекции. Преимущество этого способа выделения является то, что нежелательные клеткипомечены и разделены с помощью магнита в то время как клетки-мишени свободно слили в новую пробирку без необходимости колонн и без непосредственного нацеливание клеток с антителами. Вне зависимости от способа выделения моноцитов (прилипший против магнитной сепарации), после того, как обе процедуры, но одним из важных этапов в протоколе является стимулирование ин витро моноцитов с гранулоцитарно - макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и интерлейкин-4 ( IL-4), которые необходимы для создания MDDCs. Это обычная и хорошо создан протокол для генерации MDDCs из мононуклеарных клеток крови без ущерба для антигена захвата и перерабатывающих мощностей характеристику незрелых MDDCs 32. Одним из основных недостатков методов , обычно используемых для генерации ин витро ГЦ является низкий выход клеток - предшественников , таких , как моноциты. Как отмечалось выше, моноциты, выделенные методом прилипания составляли примерно 6,2 процента от общего числа PКонтроллеров BMC, в то время как моноциты, выделенные магнитной сепарации приходится до 25 процентов от МНПК. Согласно данным литературы, колеблется для дифференциального лейкоцитов в крови у здоровых взрослых для моноцитов составляет от 2 - 10% 31 в то время как контроллеры домена только составляют 0,1 - 1% от общего количества мононуклеарных клеток крови 20. Таким образом, высокий выход моноцитов (~ 25%), полученные после того, как магнитной изоляции может быть из-за загрязненности популяции клеток и отсутствие антител и / или магнитной частицы связывания с нежелательными клетками.
Для достижения высокого выхода и чистоты выделенных моноцитов, все критические шаги в протоколе должны быть тщательно соблюдены. Во время выделения РВМС из крови с помощью стандартного центрифугирования в градиенте плотности, существует несколько важных шагов. Во-первых, пипеткой и тщательно наслоение крови над раствором с градиентом плотности в 50 мл центрифужные пробирки, это шаг, который требует практики, так как пипеткой резко может привести к перемешиванию этого раствора и крови,что может привести к слабому слою РВМС, который трудно изолировать, или это может привести к полной смеси красных кровяных клеток с МНПК. На этом этапе, важно поддерживать постоянный и относительно медленный поток пипеткой, чтобы иметь четко определенный слой крови и отдельного слоя МКПК. Во-вторых, центрифугирование в следующей стадии с ускорением и замедлением 1 0 имеет очень важное значение. Если эти параметры не используются для первой стадии центрифугирования, это приведет к смешению крови с раствором с градиентом плотности хаотично и не отделит МНПК от остальных компонентов крови. В-третьих, важно, чтобы инкубировать МНПК с аммонием-хлоридно-калия (ACK) лизирующий буфер не более чем оптимизированного времени (10 - 15 мин) с более длинному инкубации с ACK может привести к уменьшению жизнеспособных МНПК наряду с эритроцитами , Кроме того, важно также, чтобы осуществлять Промывки PBS после ACK инкубации. Тем не менее, если эритроциты не лизируют с первымACK шаг, и они по-прежнему продолжают появляться после стирок, еще один раунд ACK лизису настоятельно рекомендуется.
После выделения белых кровяных клеток, есть несколько важных шагов, чтобы иметь в виду при выполнении способа примыкания генерировать моноциты. Во-первых, смывания плавучие лимфоциты после двух часов инкубации РВМС очень важно, так как наличие плавающих лимфоцитов может привести к менее моноциты придерживаться и может также привести к снижению чистоты MDDC. Хотя эти шаги являются критическими для мытья, чрезмерное и суровые моющие (более , чем рекомендуется, то есть, в два раза) может привести к смывания прилипшие моноциты тоже, что приводит к более низкому выходу моноцитов. Во-вторых, инкубирование клеток с полной средой и цитокинов имеет решающее значение, так как цитокины ответственны за дифференциацию моноцитов в MDDCs. К тому же, средства массовой информации и изменение пополнении Цитокины каждые 48 ч имеет важное значение для дифференциации и выживания клеток, При изменении средств массовой информации, он также имеет решающее значение для сохранения плавающих MDDCs и вернуть их обратно в культуру вместе со свежей средой и цитокинов, так как есть некоторые MDDCs, которые могут отделяться от поверхности в процессе дифференцировки. Кроме того, важно, чтобы убедиться, что моноциты высевают в рекомендуемой концентрации, смежный и близко друг к другу, потому что они нуждаются в клетки к клетке контакт для того, чтобы расти. При осуществлении способа магнитной сепарации для создания моноцитов, существует несколько важных шагов для того, чтобы получить хороший выход и высокую степень чистоты, моноцитов. Во-первых, это очень важно для поддержания концентрации клеток, рекомендованные производителем. Кроме того, важно, чтобы не нарушать полистирольный трубку при нахождении в магните, поскольку это может привести к меньшей урожайности и в меньшей степени чистоты. Как показано выше, эта методика приводит к значительно более высокому выходу моноцитов (рисунок 1) по сравнению с методом , спайка, которая может быть связана с наличием других Cгезов. Более того, когда клетки были охарактеризованы с помощью проточной цитометрии, магнитный метод показывает более высокий процент двойных положительных клеток (CD11c + / CD14 +), который может коррелировать с наличием других клеток или может быть также связано с наличием различных стадий MDDC дифференциация.
Другим важным аспектом MDDC поколения в пробирке , вне зависимости от выхода и чистоты является способность генерировать жизнеспособные и пролиферативные MDDCs. Настоящее исследование свидетельствует о том, чтобы продемонстрировать , что оба метода очистки вызывают пролиферацию MDDCs (рисунок 3) , как показано увеличением клеточной метаболической активности в течение семи дней в культуре. Кроме того, генерация MDDCs из моноцитов , очищенных магнитной сепарации показали значительно более высокую скорость пролиферации по сравнению с MDDCs , генерируемых из моноцитов , очищенных адгезии (рисунок 3). Эти данные находятся в соответствии с предыдущей литературы демонстрирует, что гeneration ГЦ из CD34 + клеток является пролиферативный процесс в связи с наличием пролиферативных клеток - предшественников DC в крови человека 27, 33. Тем не менее, существуют противоречивые выводы , указывающие , что моноциты также могут дифференцироваться в РС без каких - либо признаков пролиферации 34,35. Здесь уместно отметить, что существует много споров по поводу генерации в пробирке и контроллеры домена относительно того , контроллеры домена генерируются из пролиферирующих предшественников или дифференцировки моноцитов. Например, производство постоянного тока из адгезивных клеток периферической крови в пробирке , как было показано , также обогащают для клеток - предшественников, которые способны к пролиферации после воздействия GM-CSF , 27 и есть также доказательства , свидетельствующие о том , что выход ГЦ происходит в присутствии GM-CSF , и IL-4 не может выходить за пределы числа , начиная моноциты 33. В целом, данное исследование демонстрирует увеличение пролиферации монocytic клетки в культуре, что семь дней привести к полному MDDCs населения с> 70% CD11c + фенотипа (соблюдение = 72% ± 11 по сравнению с магнитным = 79% ± 19). Уместно заметить, что при дальнейшем фенотипический анализ проводили, хотя и не имеет существенного значения, моноциты, выделенные методом магнитной сепарации приводит к MDDCs с более высоким двойным положительным фенотипом (приверженность = 49% ± 7 CD11c + / CD14 + по сравнению с магнитным = 73% ± 15 CD11c + / CD14 +), тогда как моноциты, выделенные адгезией привело к MDDCs с более высоким единственным положительным фенотипа (соблюдение = 23% ± 7 CD11c + / CD14- по сравнению с магнитной = 6% ± 7 CD11c + / CD14-). MDDCs с более высоким двойным положительным фенотипом (CD11c + / CD14 +) может быть под ранних стадиях дифференцировки в то время как MDDCs с более высоким единственным положительным фенотипа может быть под поздних стадиях дифференцировки.
Таким образом, данное исследование предоставляет доказательства, подтверждающие, что отрицательного отбора магнитной сепарации procedurе изолировать моноциты генерирует максимальный выход моноцитов без каких-либо существенных различий в жизнеспособности моноцитов по сравнению с моноцитами, выделенных методом прилипания. В свою очередь, через семь дней, моноциты, выделенные магнитной сепарации дифференцировались в MDDCs со значительно более высоким пролиферативным потенциалом и более высоким количеством клеток, экспрессирующих дважды положительных (CD11c + / CD14 +) фенотипа, не затрагивая жизнеспособность MDDC. При сравнении обоих методов, результаты продемонстрировали способность обоих методов одновременно генерировать моноциты, способные пролиферирующих (рисунок 3) и дифференциации (рисунок 4) в CD11c + MDDCs через семь дней в культуре , так как оба метода дали> 70% CD11c + MDDCs , Однако дальнейший анализ, глядя на маркеров созревания может оказаться полезным, чтобы полностью охарактеризовать функциональное население MDDC. В заключение, оба метода являются предпочтительными альтернативы для выделения CD11c + MDDCs и провIde адекватный выход для исследовательских целей и даже может быть полезным для будущих клинических применений. В лаборатории сейчас сосредоточена на генерации MDDCs для изучения последствий злоупотребления алкоголем и другими веществами злоупотребления на врожденной иммунной системы, в частности, способности этих веществ для изменения MDDC фенотип и функции. Таким образом, данное исследование обеспечит базовую MDDC характеристики и расширить возможности приступить к дальнейшим экспериментам, чтобы выяснить молекулярные механизмы, опосредующие моноцитов функцию дендритных клеток в контексте злоупотребления наркотическими веществами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at RT |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
References
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al.
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O.
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
