Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikation af Inverted Kolloid Crystal Poly (ethylenglycol) Stillads: En Tre-dimensionel Cell Culture Platform for levervæv Engineering

Published: August 27, 2016 doi: 10.3791/54331
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Abstract

Evnen til at opretholde hepatocyt funktion in vitro, med det formål at teste xenobiotika 'cytotoksicitet, studerer virusinfektion og udvikling af lægemidler rettet mod leveren, kræver en platform, hvor celler modtager passende biokemiske og mekaniske signaler. Nylige levervæv tekniske systemer har ansat tre-dimensionelle (3D) stilladser sammensat af syntetiske eller naturlige hydrogeler, da deres høje væskeophobning og deres evne til at levere de mekaniske stimuli nødvendige for cellerne. Der har været en stigende interesse for den omvendte kolloide krystal (ICC) stillads, en ny udvikling, der giver høj rumlig organisation, homotypisk og heterotypisk celle interaktion, samt celle-ekstracellulær matrix (ECM) interaktion. Heri beskriver vi en protokol til fremstilling ICC stillads anvendelse af poly (ethylenglycol) diacrylat (PEGDA) og partiklen udvaskning metode. Kort fortalt et gitter fremstillet af mikrokugle-partikler, hvorefter en præ-polymetilsættes r opløsning, korrekt polymeriseret, og partiklerne fjernes derefter, eller udvaskes, anvendelse af et organisk opløsningsmiddel (f.eks tetrahydrofuran). Opløsningen af ​​gitter resulterer i en meget porøs scaffold med kontrollerede porestørrelser og interconnectivities der tillader medier til at nå celler lettere. Denne unikke struktur muliggør højt overfladeareal for at cellerne kan klæbe til samt nem kommunikation mellem porerne, og evnen til at belægge PEGDA ICC stillads med proteiner viser også en markant virkning på celle ydeevne. Vi analyserer morfologien af ​​stilladset samt leverkarcinom celle (Huh-7,5) adfærd med hensyn til levedygtighed og funktion at udforske effekten af ​​ICC struktur og ECM overtræk. Samlet set dette papir giver en detaljeret protokol af en spirende stillads, der har brede anvendelser i tissue engineering, især levervæv engineering.

Introduction

Leveren er et stærkt vaskulariseret organ med et væld af funktioner, herunder afgiftning af blod, metabolisme af xenobiotika, og produktionen af ​​serumproteiner. Levervæv har en kompleks tredimensional (3D) mikrostruktur, bestående af flere celletyper, galde-canaliculi, sinuskurver, og zoner med forskellig biomatrix sammensætning og forskellige oxygenkoncentrationer. I betragtning af denne omfattende struktur, har det været vanskeligt at skabe en ordentlig liver model in vitro 1. Der er imidlertid en stigende efterspørgsel efter funktionelle in vitro-modeller hosting humane hepatocytter som platforme for testning lægemiddeltoksicitet 2 og studere sygdomme forbundet med leveren 3.

Nuværende liver tissue engineering platforme har forenklet kompleksiteten af leveren ved at isolere én eller fokusere på et par, af leverens parametre, nemlig co-dyrkning af celler 4, biokemiske sammensætning af zonal mikromiljøer 5, strømningsdynamik 6,7 og konfigurationen af biomatrix 8. Konfiguration af biomatrix kan opdeles i parametre som stillads materialer, sammensætning af ekstracellulær matrix (ECM) proteiner, matrix stivhed samt konstruktion og struktur af stilladset. Der har været en stigning i vævsmanipulation studier under anvendelse af syntetiske hydrogeler, især poly (ethylenglycol) (PEG) hydrogeler 9, får mulighed for at tune hydrogelens mekaniske egenskaber, bioaktivitet, og nedbrydningshastighed. Med hensyn til lever-relateret forskning, blev biokompatible hydrogel ansøgt om virusinfektion undersøgelse af leversygdom 3. Som en hepatocyt platform design, har talrige undersøgelser udnyttet hepatocyt sandwich kulturer 10,11 og celleindkapsling inden en hydrogel 12,13 til tilvejebringelse af 3D-miljø og celle-ECM og celle-celle-interaktion, som er væsentlige for at efterligne in vivo mikromiljø. However, behøver disse platforme ikke besidder en høj grad af kontrol og rumlig organisation, hvilket fører til ikke-ensartede egenskaber gennem stilladset 14.

Den omvendte krystal kolloid (ICC) 14 stillads er et velorganiseret 3D stillads for cellekultur, som først blev introduceret i begyndelsen af 2000'erne. Stilladset unikke struktur kan tilskrives den enkle fremstillingsproces ved anvendelse af en kolloid krystal, en ordnet gitter af kolloide partikler med variabel diameter. Kort fortalt, for at opsummere processen, partikler pænt arrangeret og udglødet ved anvendelse af varme til dannelse af et gitter. Udvaskningen af dette gitter, som et organisk opløsningsmiddel, i en polymeriseret hydrogel resulterer i Hexagonal pakket sfæriske hulrum 15 med stort overfladeareal. Denne yderst ordnet stillads er tidligere blevet fremstillet med både syntetiske og naturlige materialer, herunder, men ikke begrænset til poly (acrylamid) 16-21, poly (mælke-co-glycolsyre) 15,22-30, Poly (ethylenglycol) 31,32, poly (2-hydroxyethylmethacrylat) 21,33-35, og chitosan 36-39. ICC stilladser fremstillet af ikke-fouling materialer har en tendens til at fremme cellulære sfæroider inde i hulrummene 14,23,40. Flere celletyper har vist sig at kunne formere sig, differentiere og funktion inden denne konfiguration, herunder chondrocytter 41, stromale knoglemarvsceller 42, og stamceller 43,44. Med hensyn hepatocyt, har undersøgelserne været udført med ICC stilladser lavet af Na 2 SiO 3 og poly (acrylamid), men ikke PEG. Med enkle bioconjugation strategier (dvs. aminkobling gennem EDC / NHS), kan ECM-proteiner-konjugerede PEG-baserede scaffolds skal fremstilles, der kan vise sig mere cellebindende sider for at være en mere in vivo lignende miljø og forbedre leverfunktion.

I dette manuskript og den tilhørende video, we detaljer fremstillingen af ​​ICC stilladsanvendelse af poly (ethylenglycol) diacrylat (PEGDA) hydrogel og en polystyren mikrosfære gitter, optimeret til leverkarcinom (Huh-7,5) kultur. Vi demonstrerer forskellene mellem de generelt ikke-klæbende nøgne PEGDA ICC stilladser og collagen-coatede PEGDA ICC stillads i form af stillads topologi og celleydelsen. Cellernes levedygtighed og funktion måles kvalitativt og kvantitativt at vurdere Huh-7.5 celle adfærd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ICC Stillads Fabrication (figur 1)

  1. Forbered polystyren (PS) gitre (diameter = 6 mm, 8-13 lag af perler).
    1. For at forberede formen, skæres de tips af fra 0,2 ml koge-bevis mikrocentrifugerør på 40 pi niveau. Overhold toppen af cut-rør til 24 x 60 mm 2 mikroskop dække glas glider med vandtæt lim.
    2. Sæt PS kugler (diameter = 140 um) indeholdt i en vandsuspension i et 20 ml hætteglas, omhyggeligt pipette vandet ud suspensionen, og der tilsættes 18 ml 70% ethanol-opløsning i hætteglasset. Sæt kuglen opløsningen i et ultralydsbad at løsne aggregerede sfærer. Denne vaskeproces gentages trin flere gange for at fjerne vand og vandopløselige komponenter fuldstændigt.
    3. Tilsæt 100 pi ethanol i formene.
    4. Skær toppen af ​​en 200 pi mikropipettespids med 4 mm. Pipetter 25 pi af kuglerne i formen to gange under anvendelse af 200 pi mikropipette for at opnå entotalt volumen på 50 pi i hver form.
    5. Placer formene på en vippende rysteapparat ved 120 rpm natten over.
    6. Kontroller arrangement af kuglerne i hver form under et optisk mikroskop. Hvis kuglerne ikke bestilles Hexagonal, tilsættes 50 ul 70% ethanol og ryst manuelt i længderetningen og sideværts akse retning for at korrigere arrangementet.
    7. Lad ethanol fordampe ved stuetemperatur (RT) i to nætter. Placer støbeformen og perle-kompleks i en 130 ° C ovn i 6 timer til at anneale PS perler.
  2. Forberedelse nøgne og ECM-coatede PEGDA stilladser.
    1. Syntetisere PEGDA makromere anvendelse af etablerede protokoller 45,46 til acrylating lineære PEG makromere (Mw = 4,6 kDa).
    2. Forbered 50% (vægt / volumen) PEGDA opløsning i deioniseret (DI) vand og lad den makromere til korrekt opløses ved centrifugering ved 4713 xg, indtil den er helt opløst.
      1. For ECM konjugeret ICC stilladser, opløse en ekstra10% (vægt / volumen) acryloyl-PEG-NHS (Mw = 3,4 kDa) i 50% PEGDA opløsning.
    3. Der fremstilles en 20% (vægt / volumen) stamopløsning af 2-hydroxy-4 '- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenon (PI) i 70% ethanol.
    4. Tilsæt 50 pi 20% (vægt / volumen) PI stamopløsning per 1 ml 50% (vægt / volumen) af PEGDA. Juster nødvendige mængde PI stamopløsning baseret på molekylvægten af ​​PEGDA.
    5. Vortex blandingen i centrifugeglasset i 1 min for at nå en homogen opløsning.
    6. Peel formene fra objektglasset (fra trin 1.1.7), fjerne limen fra formene, skubbe gitrene ud forsigtigt med en spatel og placere hver af dem i et 1,5 ml rør. Pipette 300 ul af PEGDA opløsningen og centrifugeres ved 845 xg i 5 min for at muliggøre ordentlig PEGDA løsning infiltration i gitter.
    7. Fjern gitteret fra røret med en pincet og omhyggeligt tørres overskydende PEGDA løsning på handsker. Placer gitter på en paraffin film-dækket glas med den flade cirCULAR opad.
    8. Udsætte PEGDA opløsning infiltreret stillads til 365 nm ultraviolet (UV) lys (10.84 mW / cm2) i 5 minutter under anvendelse af en UV-plet lampe.
    9. Placer PEGDA-polymeriserede krystalgitre i nye hætteglas (omkring 10 gitre pr hætteglas) og tilsættes 20 ml tetrahydrofuran (THF). Ryst hætteglassene på en orbitalryster ved 300 rpm. Skift THF mindst 3 gange med et interval på 1-2 timer.
      Bemærk: Fjern ikke THF helt, når du ændrer THF for at forhindre bobler i at komme ind stilladserne, hvilket igen kan forårsage ufuldstændig fjernelse af PS. Lad nok løsning til at dække gitre og tilføje nye THF.
      Forsigtig: THF er toksisk. Brug handsker, en kittel og beskyttelsesbriller. Undgå indånding ved at arbejde under stinkskabet.
    10. Kontroller, om PS kugler opløses ved at sætte vand ind i brugte THF-opløsningen og observere løsningen farve. Gentag trin 1.2.9, hvis PS kugler ikke er ordentligt opløst.
      Bemærk: Løsningen farve vil skifte tilhvid, hvis der foreligger overskydende PS sfærer.
  3. Rengør stilladser i biosikkerhed kabinet (BSC).
    1. At sterilisere stilladser, fremstille en 50 ml centrifugerør med 2 ml 70% ethanol pr stillads og placere stilladser i røret ved anvendelse af en spatel. Lad stilladser i blød i ethanol i 1 time. Fra denne skridt fremad, udføre alle procedurerne i BSC.
    2. Hæld forsigtigt ethanolen ud og erstatte med phosphatbuffer saltvand (PBS) (2 ml pr stillads) og centrifugeres ved 524 xg i 3 min for at fjerne bobler. Opbevar den i køleskabet og ændre PBS et par gange med et interval på 1-2 timer.
      1. For Collagen type I-belagte scaffolds, forberede yderligere 50 ml centrifugerør indeholdende collagen type 1 stamopløsning (1 ml pr stillads), overføre de steriliserede stilladser til dette rør under anvendelse af en spatel, og der centrifugeres ved 524 xg i 3 min. Ryst stilladser ved 400 rpm på en orbital ryster i 30 minutter og holde røret i køleanlægeller natten over.
      2. Vask stilladser med PBS to gange før brug ved at nedsænke stilladser i frisk PBS og derefter opsugning PBS.
        Bemærk: Andre ECM-proteiner kan også anvendes i stedet for collagen type I, fordi NHS-kemi kræver en amingruppe til dannelse af binding (figur 2).

figur 1
Figur 1. Oversigt over ICC fabrikation. PEG-baserede ICC scaffolds er fremstillet ved hjælp microfabrication teknikker med og uden ECM-funktionalisering. ECM-coatede ICC scaffolds kræver PEG-NHS samt PEGDA (som beskrevet i figur 2). PS gitter har en diameter på 6 mm og en højde på 8-13 perle lag. PS, polystyren; PEGDA, poly (ethylenglycol) diacrylat; UV, ultraviolet; THF, tetrahydrofuran; ECM, ekstracellulære matrix. Dette tal er blevet ændret og anvendes med tilladelse fra Wiley 47. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. ICC Struktur Karakterisering

  1. For at analysere ICC struktur med eller uden konjugerede proteiner, bruge scanningselektronmikroskopi (SEM) 47.
    1. Fastgør stilladser med 4% paraformaldehyd (PFA), serielt dehydrere dem i 25, 50, 75, 95 og 100% ethanolopløsninger, og opbevar dem ved -80 ° C, indtil ethanol er fordampet helt.
    2. Tørre prøver i en fastfrysning tørrere for 48 timer.
    3. Klæb prøven på prøveholderen hjælp kulstof tape og sted i en pådampningsbelægningsmaskinen.
    4. Efter automatisk støvsugning, belægge den med en Pt-folie på 10 nm tykkelse ved forstøvning i 60 sekunder ved 20 mA.
    5. Billede ICC scaffolds ved anvendelse af SEM ved en spænding på 5 kV (figur 3A, figur 4A).
  2. For at måle pore ogdiameter sammenkobling af hulrum, analysere SEM-mikrografer anvendelse af billedanalyse-software 48 (f.eks ImageJ, figur 3B, C).
  3. At visualisere det konjugerede kollagen til stilladset uden celler, fluorescens tag kollagen anvendelse af antistoffer (1: 100) mod collagen type I og billede med konfokal laserscanningsmikroskopi 47 (CLSM, figur 4B).

3. Huh-7,5 Cell Culture og såning

  1. Kultur Huh-7,5-celler ved en seeding tæthed på 2-2,5 x 10 6 celler / ml i 100 mm cellekulturskåle med 10 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U / ml penicillin-streptomycin (vækstmedier) ved 37 ° C og 5% CO 2. Skift medierne hver tredje dag i BSC, indtil de har nået 75-80% sammenflydning.
  2. Forbered scaffolds for cellepodning i BSC.
    1. Placer forsigtigt scaffårige i en 24-brønds plade med den flade opad.
    2. At vaske stilladset, pipette 2 ml PBS til hver brønd indeholdende et stillads. Aspirer PBS og pipette 2 ml frisk PBS i hver brønd.
    3. Aspirer PBS og pipette 2 ml vækstmedie (se trin 3.1) og lad i 30 minutter. Aspireres medierne og tillade stilladset tørre i 1 time.
  3. Frigør sammenflydende Huh-7.5-celler (fra trin 3.1) fra kulturen pladen i BSC ved hjælp af den trypsin fordøjelse metoden.
    1. Aspirer medier fra pladen, tilsæt 4 ml PBS for at vaske adhærente celler og derefter aspireres PBS.
    2. Pipette 0,75-1 ml 0,25% trypsin og sted i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 min.
    3. Fjern pladen fra inkubatoren og pipette 5 ml medium for at standse trypsin reaktionen. Pipette medier, løsnede celler, og trypsin blandingen i et 15 ml rør.
    4. Centrifuger ved 524 xg i 3 min, supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 5 ml medier.
  4. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og beregne volumenet af cellesuspensionen, der indeholder celler ved destinationsnummer, N 0, pr 25 pi (for standard eksperiment, N 0 er 1 x 10 6 celler).
    Volumen af ​​cellesuspension = (target antal celler) / (koncentration af cellesuspension)
  5. Langsomt pipettere 25 pi cellesuspension (indeholdende N 0-celler) direkte på toppen af hver stillads (fra trin 3.1.4). Placer plade med 24 brønde i inkubatoren.
  6. Efter 12 timer, overføre stilladser omhyggeligt med anvendelse af en spatel til en ny 24-brønds plade og pipette 2 ml medium i hver brønd. Placer plade med 24 brønde i inkubatoren.
  7. Skift medierne hver 3 dage eller, afhængigt af hvornår medier indsamles for proteinsekretion analyse (se trin 5.1).

4. cellelevedygtighed

  1. At kvalitativt analysere cellernes levedygtighed, bruge fluorescerende levende / døde farvning kits at farve cellerne og billede ved hjælp af CLSM.
    1. Efter kit instruktion, udarbejde en løsning med 4 pM calcein AM og 8 uM ethidium homo-dimer-1 i medier (se trin 3.1.3).
      Bemærk: Optimer afhængigt af celleantal. Brug dobbelt så meget reagens, hvis celler formere og dobbelt i antal (ca. 2 millioner).
    2. I BSC, aspiratprøver medier i hver brønd med et stillads (trin 3.7) og pipette 500 pi den fremstillede opløsning. Inkuber prøver i et 37 ° C inkubator i 1 time.
    3. Dække pladerne i folie for at beskytte prøver fra lys, når fjernelse af pladen ud af inkubatoren. prøver billede ved hjælp CLSM49.
  2. Til kvantitative vurderinger cellelevedygtighed, måle enzymatisk aktivitet (i levende celler) ved anvendelse af kolorimetriske assays 50 (dvs. 2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium (mononatrium-salt-reagens)).
    1. Opret en standardkurve for ICC-platformen (dvs. en graf af absorbans (OD) versus given celle nummer).
      Bemærk: Cell seeding er ikke 100% effektiv i forhold til andre platforme, eftersom cellerne kan passere gennem hulrummene af stilladser.
      1. Bestem cellepodning numre, N 0 der vil blive anvendt til at gøre standardkurven.
        Bemærk: Vælg et område, der omfatter celle numre, der vurderes i eksperimentet. For eksempel, hvis den oprindelige celletal er 5 x 10 5 celler, og der er en anslået ~ 3 gange stigning af den sidste dag af forsøget, vælge 2,5 x 10 5, 5 x 10 5 og 1 x 10 6, og 2 x 10 6 celler såsom N 0.
      2. Udfør cellepodning i ICC stilladser (en N 0 pr stillads med podning volumen på 25 pi) som beskrevet i trin 3,1-3,6.
      3. Efter 6 timer, overføre stilladser til en anden 24-brønds plade brønd. Vælge et tidspunkt, der tillader celleadhærens men ikke celleproliferation.
      4. Udfør celletælling på den overførte ICC stilladset.
        1. Fortynd 10x mononatrium-salt reagens (MSR) løsning til 1x med medier i BSC og pipette 500 pi 1x MSR opløsningen i hver brønd med et stillads. Inkubér 24-brønds plade ved 37 ° C i 1 time.
        2. Fra hver brønd, overføre 100 pi i en 96-brønds plade brønd. Som en blank, pipette 100 pi frisk 1x mononatrium-salt reagensopløsning i forskellige brønde på 96-brønds plade. Manuelt at fjerne eventuelle tilstedeværende bobler med en tør pipettespids og dække 96-brønds plade i folie for at beskytte den mod lys.
        3. Mål OD ved λ = 450 nm læsning anvendelse af et spektrofotometer. Træk den tomme OD fra andre værdier for at finde den præcise OD 51.
      5. Tæl antallet af celler (N L) tilbage i brønden efter overførsel stilladset (trin 4.2.1.3) under anvendelse af et hæmocytometer.
        Bemærk: Brug 300 pi trypsin at Trypsinisér cellerne.
      6. Beregne den aktuelle celle nummer, N A.
        faktiske =indledende - venstre i godt
        N A = N 0 N L
      7. Gør standardkurve ved at afbilde OD opnået i trin 4.2.1.4.3 vs. faktiske celleantal (N A) og bruge denne til at estimere celletallet i eksperimenterne.
        Bemærk: Lav en ny standardkurve hvis nogen ICC parametre (dvs. porogen størrelse, dimensioner stilladset, ECM protein etc.) ændres.

5. cellefunktion

  1. Analyser proteinsekretion af Huh-7,5-celler (dvs. albumin, urinstof) fra de indsamlede medier (fra trin 3.7) ved enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) 52.
    Bemærk: Fortynd mediet, afhængigt af antallet af celler podes og mængden af ​​mediet opsamlet. For 5 x 10 5 celler seedet i ICC, bruge et ~ 1: 25-forhold, før der indføres den til antistof-præ-belagte brønde.
  2. Til kvalitativt analysere cellefunktion, immunfarvning specifikke intracellulære proteiner(Dvs. albumin), enzymer (dvs. CYP450), bejdse strukturelle komponenter (dvs. cellulære actin) samt kernerne og billede ved hjælp CLSM 49.
    1. Aspirer medier (fra trin 3.7) og pipette 2 ml PBS for at vaske celle-laden ICC stilladser.
    2. Afpipetteres 1 ml 4% PFA og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur til fiksering.
    3. Vask 3 x med 2 ml PBS.
    4. Permeabilisere membraner ved inkubering stilladserne i 1 ml 0,1% 4- (1,1,3,3-tetramethy) phenyl-polyethylenglycol (overfladeaktivt middel) i 30 min.
    5. Vask 3x med 2 ml PBS for at fjerne eventuelle utætte proteiner.
    6. Pipetter 500 pi 1% bovint serumalbumin (BSA) og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time for at blokere ikke-specifik binding.
    7. Forbered fortyndet primært antistof (dvs. albumin, CYP450) opløsning.
      1. Pipetter 500 pi 1% BSA-opløsning i et 15 ml rør, og der tilsættes 4,5 ml 0,1% opløsning af overfladeaktivt middel til fremstilling af et i alt 5 ml 0,1% BSA-opløsning.
      2. Pipetter 98 pi af 0,1% BSA opløsning i en 200 pi mikrocentrifugerør og 2 pi af det primære antistof til at producere en 01:50 (primært antistof: 0,1% BSA) primære antistofopløsning.
    8. Pipetten 40 pi af det primære antistof løsning på stilladset og dække substratet med paraffin film. Wrap 24 brønds plade med aluminiumfolie og opbevares skålen ved 4 ° C natten over.
    9. Vask 3x med 2 ml PBS og ryst pladen forsigtigt i mellem vask.
    10. Forbered fortyndet biotinyleret sekundært antistof (dvs. anti-muse-antistof) stamopløsning.
      1. Pipetter 198 pi 0,1% BSA-opløsning og 2 pi andet antistof til frembringelse af et 1: 100 (sekundært antistof: 0,1% BSA) sekundær antistofopløsning.
      2. Forbered en 0,1% stamopløsning af rhodamin eller fluorescein mærket phalloidin (at farve de cellulære actinfilamenter) i 0,1% BSA løsning.
      3. Pipetter 25 pi af hver opløsning i et rør og bland well.
    11. Pipetter 50 pi af det sekundære antistof-stamopløsning på stilladset. Dæk stillads med paraffin film, pak fadet med alufolie og opbevares ved stuetemperatur i 2 timer.
    12. Vask 3 x med 2 ml PBS.
    13. Pipetter 200 pi 0,2% 4'-6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; en kerne farvning) opløsning på stilladset og holde ved stuetemperatur i 2-3 min. Dæk pladen med aluminiumsfolie.
    14. Vask 2x med 2 ml PBS.
    15. Ved hjælp af en pipette, placere en dråbe monteringsmedium på substratet.
    16. Sæt forsigtigt skafottet på et objektglas og billedet ved hjælp CLSM 47.
  3. Vurdere genekspression ved real-time polymerase chain reaction (qPCR). Brug standard kits til revers transkriptase PCR (RT-PCR) 53 og qPCR 54 i henhold til producentens anvisninger. Ekstrahere RNA fra cellerne som beskrevet nedenfor.
    1. Placer stilladset (fra trin 3.7) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    2. Pipette 200 pi af chloroform til hver mikrocentrifugerør og ryste røret kraftigt i hånden i 15-20 sek. Hold rørene ved stuetemperatur i ~ 3 min, indtil faserne adskilt.
    3. Centrifugeres prøven ved 13.000 xg, 4 ° C i 15 minutter og fjernes glassene omhyggeligt, så faser ikke blandes.
    4. omhyggelig pipettering 500-600 pi af den øvre vandige fase fra det første rør i et andet mikrocentrifugerør.
    5. Tilføj et ækvivalent volumen (500-600 pi) isopropanol til dette andet rør.
    6. Vend røret 3-5 gange og efterlade røret stående ved stuetemperatur i 10 min.
    7. Centrifugeres prøven ved 13.000 xg, 4 ° C i 15 min.
      1. Hvis en pellet ikke er synlig ved bunden af ​​røret, centrifugeres igen i 5 minutter.
        Bemærk: Hvis der stadig ingen synlig pellet, kan mængden af ​​RNA være utilstrækkelig.
    8. jegnvert rør med hætten åben for at kassere supernatanten og pipette i 1 ml 70% ethanol fortyndet i DEPC vand i røret.
    9. Lidt vortexes røret, så pelleten løsner fra væggen af ​​røret og derefter lade røret lufttørre.
    10. Der tilsættes 50 pi DPEC vand for at resuspendere pelleten.
    11. Hold pipettering indtil pellet opløses.
    12. Holde i 10 minutter ved 55 ° C for at denaturere den dobbeltstrengede RNA til enkeltstrenget RNA.
    13. Let tromle fingre på tuben bunden og centrifugeres kortvarigt på rørene (7.500 xg, 4 min, 4 ° C).
    14. Hold rørene i is indtil udførelse revers transkriptase 55 og real-time PCR som beskrevet i 56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De repræsentative resultater for den strukturelle karakterisering af ICC stillads og sammenligningen af ​​hver ICC stillads tilstand s effekt i dyrkning hepatocytter er vist og forklaret nedenfor. ICC stillads betingelser anvendt i disse resultater er kollagen belægninger af 0 ug / ml (Bare), 20 ug / ml (Collagen 20), 200 ug / ml (Collagen 200) og 400 ug / ml (Kollagen 400) og den første huh-7.5 celle seeding nummer er 1x10 6.

Karakterisering af ICC poreforbindelser og stillads topologi.

SEM billeddannelse, efter fiksering og frysetørring af ICC stilladser, blev første gang brugt til at afgøre, om ordentlige forbindelser mellem ICC porer blev dannet og for at se effekten af ​​konjugering af varierede kollagen koncentrationer på stilladset topologi. Kvantitativ analyse af to-dimensional nøgne ICC SEM billeder (figur 3A) ved hjælp ImageJ software, afslørede en gennemsnitlig porediameter på 102,3 ± 9,3 um og en gennemsnitlig diameter sammenkobling af 38,6 ± 4,3 um (figur 3B, C). Denne sammenkobling mellem porerne spiller en væsentlig rolle i korrekt diffusion af næringsstoffer til celler såvel som celle-celle-interaktion i hele stilladset. Belægningen af kollagen resulterede i en fiber mesh netværk, der blev mere defineret ved højere koncentrationer af kollagen konjugering (figur 4A). Konfokal billeder afslører endda lag af collagen på hulrum overflader og højere overfladeareal dækning med stigninger i kollagen koncentrationen (figur 4B).

Effekt af ICC platform betingelser Huh-7.5 cellelevedygtighed og funktion.

Huh-7,5-celler blev underkastet den fluorescerende live / dead pleting assay (4 uM calcein AM og 8 uM EthD-1) og afbildes under anvendelse CLSM, som vist i figur 5. Celler podet i nøgne, ikke-klæbende ICC scaffolds havde tendens til at aggregere i centrum af pore og celle-celle-sammenkobling mellem porer blev set i senere tider (dag 7 og 10). Tilstedeværelsen af ​​et collagen coating på ICC stilladser tilladt celler til at adhærere til stilladset overflade samt en inter-pore celle-celle interaktion så tidligt som dag 1. Cellelevedygtighed, fremgår af det grønne pletter, steg med tiden og var generelt højere i collagenovertrukne scaffolds, som angivet ved højere grøn fluorescens. Figur 6 viser de kvantitative MSR resultater for yderligere undersøgelse af virkningen af koncentrationen ICC 3D-struktur og protein på celleviabilitet. En kolorimetrisk celleviabilitetstest blev udført på celler dyrket i ICC stillads forhold samt på en 2D polystyren kulturplade og absorbansdata (målt ved 450 nm) blev normaliseret til than kontrol (dag 1). Celler dyrket på 2D plader opretholdt cellelevedygtigheden, men der observeredes ingen stigning i celleproliferation. 3D nøgne ICC stillads stærkt forbedret celleproliferation sammenlignet med 2D tilstand, hvilket indikerer vigtigheden af ​​3D matrix. Med tilføjelsen af collagen coating, celleproliferation forøget med tiden på alle kollagen koncentrationer og den maksimale proliferation blev fundet i 200 ug / ml overtrukket ICC stillads på dag 14. Dette bekræfter kvalitative observationer i figur 5.

Hepatocyt funktion blev bedømt ved at overvåge ændringer i albuminsekretion samt genekspressionsprofilen af tre adhæsionsproteiner i de forskellige ICC stillads betingelser. Figur 7 illustrerer den positive sammenhæng mellem serumalbumin udskilles, som kvantificeret ved albumin ELISA, og kollagen koncentration konjugeret til stilladset. På dag 14, Huh-7.5 celler dyrket i400 pg / ml belagt ICC stilladser udskilles mere end tre gange den mængde albumin som dem dyrket i den nøgne stillads. Resultater for genekspressionsprofilerne af E-cadherin, N-cadherin, og integrin p1 proteiner i de forskellige ICC stillads betingelser vises i figur 8. Hastigheden af E-cadherin-mRNA-ekspression i 400 ug / ml overtrukne ICC stilladser steg med mere end 4 folder i forhold til de øvrige coating betingelser (figur 8A). Den gange ændring i N-cadherin-genekspression var større i de højere koncentrationer af kollagen belægning. Imidlertid integrin β1 genekspression forblev relativt konstant eller faldet i alle ICC scaffolds betingelser, bortset 200 ug / ml overtrukne ICC stilladser.

Figur 32
Figur 2. Konjugation af kollagen til PEGDA stillads via NHS kemi. Bioaktive stilladser bruge PEG-NHS, der har en amin-reaktiv succinimidyl (NHS) -ester, som reagerer på amingruppen i collagen tillader konjugation til stilladset. PEG, poly (ethylenglycol); NHS, N-hydroxysuccinimid; UV, ultraviolet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Analyse af størrelsen af ICC hulrum og sammenkoblinger. (A) SEM-mikrografer af ICC stillads (skala bar = 100 um) blev analyseret under anvendelse ImageJ software og kvantitativt repræsenteret som histogrammer af (B) porediameter og (C) diameter samtrafik. Dette tal er blevet ændret og anvendes med tilladelse fra Wiley 47."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54331/54331fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Indflydelse af kollagen belægning på ICC stillads topologi. (A) SEM billeder og (B) konfokale billeder blev taget til kvalitativ evaluering overfladen topologi af stilladser overtrukket med 20 ug / ml, 200 pg / ml, og 400 ug / ml af kollagen. Røde kasser omgiver hulrummet vist i højere forstørrelse billeder nedenfor. Scale barer er (A) 5 um, (B) 200 um og 100 um (højere forstørrelse). Dette tal er blevet ændret og anvendes med tilladelse fra Wiley 47. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 5. Virkning af ICC platform betingelser på cellelevedygtighed og morfologi ved hjælp kvalitativ Levende / Dead assay. Konfokale billeder af den levende / Dead farvede Huh-7.5-celler podet i ICC stilladser med forskellige kollagenkoncentration belægninger (0, 20, 200, og 400 ug / ml) blev taget 1, 4, 7 og 10 dage efter podning. Grøn plet (calcein) angiver levende celler og rød plet (ethidiumhomodimer-1) indikerer celledød. Scale søjler indikerer 200 um. [Dette tal er blevet ændret og anvendes med tilladelse fra Wiley 47] Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. EffektLadet type og ICC platform betingelser på celleviabilitet bruger kvantitativ kolorimetrisk celleviabilitetstest. Huh-7.5-celler podet på en 2D polystyren kultur plade og i ICC stilladser med forskellige collagen koncentration belægninger (0, 20, 200 og 400 ug / ml ) blev underkastet den kolorimetriske MSR levedygtighedsassayet 1, 4, 7, 10 og 14 dage efter podning. Absorbans blev målt ved 450 nm, og dataene blev normaliseret til dag 1 absorbansværdier. (n = 3, gennemsnit ± SD, ***: P <0,001 sammenlignet med MSR løsning absorbans læsning for dag 1 i hver gruppe.) [Dette tal er blevet ændret og anvendes med tilladelse fra Wiley 47] Klik her for et større version af denne figur.

Figur 7
Figur 7. Virkning af ICC platform tilstand på Huh-7,5 funktion ved hjælp secerneret albuminkoncentration ELISA-analyse. Albumin ELISA blev anvendt til at kvantificere serumalbumin sekretion i medier indsamlet fra celle-laden ICC stilladser med forskellige collagen koncentration belægninger (0, 20, 200 og 400 ug / ml) på dag 1, 4, 7, 10 og 14 efter podning. Hvert datapunkt repræsenterer et gennemsnit af 3 prøver og normaliseres til antallet af celler fundet ved hjælp af den kolorimetriske MSR celleviabilitetstest og skabte standardkurve (n = 3, gennemsnit ± SD). [Dette tal er blevet ændret og anvendes med tilladelse fra Wiley 47] Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8
Figur 8. Virkning af ICC platform tilstand på Huh-7.5funktion ved hjælp af geners aktivitet. Real-time kvantitativ PCR blev anvendt til at profilere genekspression af celler dyrket i ICC stilladser med forskellige collagen koncentration belægninger (0, 20, 200, og 400 ug / ml) på dag 1, 4, og 7 efter podning. Tre junction proteiner blev valgt, nemlig (A) E-cadherin, (B) N-cadherin, og (C) Integrin Beta 1. mRNA ekspressionsniveauer blev normaliseret ved GAPDH. (n = 3, gennemsnit ± SD *:. P <0,05 **:.. P <0,01 i forhold til genekspression af Dag 1 hver gruppe) [Dette tal er blevet ændret og anvendes med tilladelse fra Wiley 47] Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tissue engineering stilladser er i rivende udvikling til at give alle de fysiske og biokemiske signaler, der er nødvendige for at regenerere, vedligeholde eller reparere væv for anvendelsen af orgel udskiftning, studere sygdom, at udvikle lægemidler, og mange andre 57. I levervæv engineering, primære, humane hepatocytter hurtigt mister deres metaboliske funktioner gang isoleret fra kroppen, hvilket skaber et stort behov for engineering scaffolds og udvikle platforme til at opretholde den leverfunktion. Den nuværende in vitro hepatocyt kultur platforme har udnyttet forskellige biomaterialer. Forskningen på dette område har været centreret om at efterligne forskellige funktioner i in vivo hepatisk mikromiljø, såsom ECM protein konfiguration 58,59, co-kultur 60,61, og micropatterning 62. Imidlertid har der været mangel på stilladser med kontrolleret porøsitet og høj rumlig organisation. I denne forbindelse er beskrevet ICC cellekultur bækken nedenorm, med sine isotrope egenskaber og høj organisering, behandler dette tomrum. Vi demonstrerer ICC PEGDA stillads er en egnet platform til dyrkning hepatocarcinoma celler, en model celletype for hepatocytter, og at yderligere collagen belægning forbedrer celle adfærd 47.

I praksis kan hulrummet størrelse ICC stillads indstilles ved størrelsen af ​​PS mikrosfærer. Desuden kan det sammenkoblede størrelse stilladset styres af tid og temperatur annealing proces; højere annealingstemperatur eller længere annealing tidspunkt bevirker større sammenkoblingspunkter diametre. Derfor bør disse parametre vælges omhyggeligt som større samtrafik diametre vil kompromittere den mekaniske stabilitet af stilladset. I dette arbejde blev PS-kugler 140 um valgt til hepatocyt cellekultur at begrænse størrelsen af ​​de resulterende hepatospheres i de nøgne ICC scaffolds for at forhindre nekrose af cellen i midten af ​​hanpatocyte klumpformet. 63 Som det fremgår af repræsentative resultater, 3D arkitektur ICC stillads tillader højere Huh-7.5 celledeling i forhold til 2D polystyren plade cellekultur. Resultaterne antyder, at de sammenkoblede ensartede hulrum ICC stillads tillade effektiv celle-celle interaktion og krydstale mellem hulrummene.

Koncentrationen af ​​collagen type I overtrækning påvirkede cellemorfologi, levedygtighed og funktion. Collagen type I er en vigtig ECM protein, der findes i rum for These, et område støder op til hepatocytter 64. Ikke-klæbende, nøgne PEGDA ICC scaffolds fremmet hepatocyt kugleformet dannelse henviser, et collagen coating afsmeltet stilladset bioaktive og Huh-7.5-celler adhæreret til overfladen af ​​stilladset, benytter det store overfladeareal til stede. ECM protein-coatede ICC scaffolds forbedret både celle-celle-interaktion samt celle-ECM interaktion, som indikeret ved opreguleret E-cadherin, N-cadheRin og Integrin p1 genekspressioner, som spiller en rolle i reguleringen af ​​celle adfærd. Collagen type I koncentrationer på 200 pg / ml og 400 ug / ml var egnede til Huh-7,5 kultur, forbedre både celleproliferation og albumin sekretion.

Den væsentligste begrænsning udgøres af ICC fabrikation er kontrol over PS sfære tilpasning og nummer, når de foretager de gitre. Hurtig fordampning af ethanol under indlæsning sfærerne i formene kan forårsage forskellige sfære densiteter, hvilket resulterer i et forskelligt antal lag af kugler i gitre. Men brugen af ​​mindre flygtige opløsning som vand har også ulemper. Det føre til mindre ordnede CCS i flydende samlesystem 65, og der er en stor mulighed for en yderst krum stillads overflade på grund af menisken formation. En anden begrænsning er den korrekte opretning af kugler i formene for at sikre den højeste effektivitet af sammenkoblinger. Det ryster trin (trin 1.1.5 og 1.1.6) er derfor critical til ICC fabrikation teknik. Hvis en god ordning ikke overholdes ved mikroskopi, gentag trin 1.1.6.

Samlet set ICC PEGDA stillads, med sin enkle fabrikation protokol, kan bruges bekvemt som en platform for 3D-cellekultur-applikationer. Bioaktivering af den nøgne stillads med proteiner yderligere øger sin funktionelle egenskaber 14. I dette manuskript, vi skræddersyet fabrikation protokollen til og valgte vurdering celle analyser til levervæv engineering ansøgning. Imidlertid kan en række celletyper dyrkes inden denne unikke stillads og hver celletype kan kræve ændring af visse parametre. kan alle også tilføjet lag af kompleksitet i form af flere ECM protein typer, co-kultur, og dynamisk kultur ved hjælp af en bioreaktor at øge celle ydeevne yderligere. Denne platform har potentiale til at støtte i vævsregenerering og udvikling af lægemidler, for at studere leversygdomme, og som skal anvendes til transplantation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra en Grundforskningsfonden Fellowship (NRF -NRFF2011-01) og konkurrencedygtig forskning program (NRF-CRP10-2012-07).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 ml PCR tube Axygen Scientific PCR-02D-C Boil-proof
Gorilla Glue Gorilla Glue, Inc. Depends on vendor. This was purchased from a local store.
Glass slides VWR 631-1575 Dimensions: 24×60 mm2
Polystyrene spheres Fisher Scientific TSS#4314A Diameter = 140 µm; 3x104 particles per milliliter and 1.4% size distribution
Ethanol Merck 1.00983.1011 absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water
Ultrasonic Bath Elma S10H Equiment
Furnace Nabertherm N7/H Equipment
200 µl pipette tip Axygen Scientific T-210-Y-R-S
Rocking shaker VWR 444-0142
Polyethylene Glycol (PEG) Merck 1.09727.0100 Mw= 4 kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6 kDa
Centrifuge Beckman Coulter 392932 Equipment
Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate Laysan Bio ACRL-PEG-SVA-3400-1g Mw = 3.4 kDa
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma Aldrich 410896
Vortex VWR 58816-123 Equipment
Microcentrifuge Eppendorf 5404 000.413
Paraffin Film Parafilm M  #PM996 Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm2
Bluewave 200 UV spotlight Blaze Technology  120008, 122300
Tetrahydrofuran (THF) Merck 107025
Orbital shaker Heidolph 543-123120-00-5
Collagen Type I Sigma Aldrich C3867-1VL From rat. 1x, w/o CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 20012-027 16% W/V AQ. 10 x 10 ml
Paraformaldehyde VWR 43368.9M Equipment
Freezone 4.5 freeze drier Labconco 7750020 Equipment
Sputter coater Jeol Ltd. JFC-1600 Equipment
Scanning Electron Microscope Jeol Ltd. JSM 5310
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I Abcam ab6308
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Life Technologies A21121
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon)  Bio-Rev PTE LTD 3820-024
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)
2.5 g/L Glucose w/ L-Gln		 Lonza 12-604F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco A15-151
Penicillin-Streptomycin (P/S) Life Tchnologies 15140-122 E
100 mm Corning non-treated culture dishes Sigma Aldrich CLS430591
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Equipment; 37 °C, 5% Humidity
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators Thermofisher Scientific 371
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer Thermofisher Scientific 02-671-6
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells Life Technologies L3224 
CCK-8 Assay Dojindo Laboratories CK04-11 Monosodium-salt reagent (MSR)
Infinite 200 PRO microplate reader  Tecan
Albumin Human ELISA kit Abcam ab108788
Triton X-100 Bio-Rad #1610407
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) Santa Cruz Biotechnology sc-53850; sc-271605
DAPI Life Technologies D3571
Alexa Fluor 555 labeled Phalloidin Life Technologies A34055
Trizol Life Technologies 15596-026
Chloroform VWR 22706.326
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
DPEC water Thermofisher Scientific AM9916
Nanodrop 2000c Spectrophotometer Thermofisher Scientific ND-2000
iScript Reverse Transcription Supermix  Bio-Rad Laboratories 1708840
SYBR select Master Mix for CFX Life Technology 4472937
Primers (to be chosen)
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler Bio Rad Laboratories SOFT-CFX-31-PATCH 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
  2. Abboud, G., Kaplowitz, N. Drug-induced liver injury. Drug Safety. 30 (4), 277-294 (2007).
  3. Cho, N. J., et al. Viral infection of human progenitor and liver-derived cells encapsulated in three-dimensional PEG-based hydrogel. Biomed Mater. 4 (1), (2009).
  4. Revzin, A., et al. Designing a hepatocellular microenvironment with protein microarraying and poly (ethylene glycol) photolithography. Langmuir. 20 (8), 2999-3005 (2004).
  5. Sato, A., Kadokura, K., Uchida, H., Tsukada, K. An in vitro hepatic zonation model with a continuous oxygen gradient in a microdevice. Biochem Bioph Res Com. 453 (4), 767-771 (2014).
  6. Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).
  7. Hegde, M., et al. Dynamic interplay of flow and collagen stabilizes primary hepatocytes culture in a microfluidic platform. Lab Chip. 14 (12), 2033-2039 (2014).
  8. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  9. Underhill, G. H., Chen, A. A., Albrecht, D. R., Bhatia, S. N. Assessment of hepatocellular function within PEG hydrogels. Biomaterials. 28 (2), 256-270 (2007).
  10. Dunn, J., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J cell biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
  11. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol progr. 7 (3), 237-245 (1991).
  12. Ling, Y., et al. A cell-laden microfluidic hydrogel. Lab Chip. 7 (6), 756-762 (2007).
  13. Kim, M., Lee, J. Y., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31 (13), 3596-3603 (2010).
  14. Kotov, N. A., et al. Inverted Colloidal Crystals as Three-Dimensional Cell Scaffolds. Langmuir. 20 (19), 7887-7892 (2004).
  15. Shanbhag, S., Woo Lee, J., Kotov, N. Diffusion in three-dimensionally ordered scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Biomaterials. 26 (27), 5581-5585 (2005).
  16. Lee, Y. H., Huang, J. R., Wang, Y. K., Lin, K. H. Three-dimensional fibroblast morphology on compliant substrates of controlled negative curvature. Integr Biol. 5, 1447-1455 (2013).
  17. da Silva, J., Lautenschlager, F., Kuo, C. H. R., Guck, J., Sivaniah, E. 3D inverted colloidal crystals in realistic cell migration assays for drug screening applications. Integr Biol. 3, 1202-1206 (2011).
  18. da Silva, J., Lautenschlager, F., Sivaniah, E., Guck, J. R. The cavity-to-cavity migration of leukaemic cells through 3D honey-combed hydrogels with adjustable internal dimension and stiffness. Biomaterials. 31, 2201-2208 (2010).
  19. Lee, J., Lilly, G. D., Doty, R. C., Podsiadlo, P., Kotov, N. A. In vitro toxicity testing of nanoparticles in 3D cell culture. Small. 5, 1213-1221 (2009).
  20. Lee, J., Kotov, N. A. Notch ligand presenting acellular 3D microenvironments for ex vivo human hematopoietic stem-cell culture made by layer-by-layer assembly. Small. 5, 1008-1013 (2009).
  21. Liu, Y., et al. Rapid aqueous photo-polymerization route to polymer and polymer-composite hydrogel 3D inverted colloidal crystal scaffolds. J Biomed Mater Res. Part A. 83, 1-9 (2007).
  22. Ma, P. X., Choi, J. W. Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnected spherical pore network. Tissue Eng. 7, 23-33 (2001).
  23. Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Poly (lactic-co-glycolic acid) bone scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Tissue Eng Part A. 14, 1639-1649 (2008).
  24. Choi, S. W., Zhang, Y., Xia, Y. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering: the importance of uniformity in pore size and structure. Langmuir. 26, 19001-19006 (2010).
  25. Choi, S. W., Zhang, Y., Thomopoulos, S., Xia, Y. In vitro mineralization by preosteoblasts in poly(DL-lactide-co-glycolide) inverse opal scaffolds reinforced with hydroxyapatite nanoparticles. Langmuir. 26, 12126-12131 (2010).
  26. Choi, S. W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in biodegradable inverse opal scaffolds with uniform and precisely controlled pore sizes. Adv Healthc Mater. 2, 145-154 (2013).
  27. Zhang, Y., Choi, S. W., Xia, Y. Modifying the Pores of an Inverse Opal Scaffold With Chitosan Microstructures for Truly Three-Dimensional Cell Culture. Macromol Rapid Commun. 33, 296-301 (2012).
  28. Cai, X., et al. Investigation of neovascularization in three-dimensional porous scaffolds in vivo by a combination of multiscale photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Tissue Eng. Part C, Meth. 19, 196-204 (2013).
  29. Zhang, Y. S., Yao, J., Wang, L. V., Xia, Y. Fabrication of Cell Patches Using Biodegradable Scaffolds with a Hexagonal Array of Interconnected Pores (SHAIPs). Polymer. 55, 445-452 (2014).
  30. Zhang, Y. S., Regan, K. P., Xia, Y. Controlling the Pore Sizes and Related Properties of Inverse Opal Scaffolds for Tissue Engineering Applications. Macromol Rapid Commun. 34, 485-491 (2013).
  31. Stachowiak, A. N., Bershteyn, A., Tzatzalos, E., Irvine, D. J. Bioactive Hydrogels with an Ordered Cellular Structure Combine Interconnected Macroporosity and Robust Mechanical Properties. Adv Mater. 17, 399-403 (2005).
  32. Stachowiak, A. N., Irvine, D. J. Inverse opal hydrogel-collagen composite scaffolds as a supportive microenvironment for immune cell migration. J Biomed Mater Res. Part A. 85, 815-828 (2008).
  33. Liu, Y., Wang, S. 3D inverted opal hydrogel scaffolds with oxygen sensing capability. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 58, 8-13 (2007).
  34. Bryant, S. J., Cuy, J. L., Hauch, K. D., Ratner, B. D. Photo-patterning of porous hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 28, 2978-2986 (2007).
  35. Bhrany, A. D., Irvin, C. A., Fujitani, K., Liu, Z., Ratner, B. D. Evaluation of a sphere-templated polymeric scaffold as a subcutaneous implant. JAMA facial plastic surgery. 15, 29-33 (2013).
  36. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32 (3), 819-831 (2011).
  37. Yang, J. T., Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Peptide-modified inverted colloidal crystal scaffolds with bone marrow stromal cells in the treatment for spinal cord injury. Colloids Surf. B, Biointerfaces. 84, 198-205 (2011).
  38. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  39. Choi, S. W., Xie, J., Xia, Y. Chitosan-Based Inverse Opals: Three-Dimensional Scaffolds with Uniform Pore Structures for Cell Culture. Adv Mater. 21, 2997-3001 (2009).
  40. Long, T. J., Sprenger, C. C., Plymate, S. R., Ratner, B. D. Prostate cancer xenografts engineered from 3D precision-porous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels as models for tumorigenesis and dormancy escape. Biomaterials. 35, 8164-8174 (2014).
  41. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  42. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32, 819-831 (2011).
  43. Lee, J., Cuddihy, M. J., Cater, G. M., Kotov, N. A. Engineering liver tissue spheroids with inverted colloidal crystal scaffolds. Biomaterials. 30 (27), 4687-4694 (2009).
  44. Galperin, A., et al. Integrated bi-layered scaffold for osteochondral tissue engineering. Adv Healthc Mater. 2, 872-883 (2013).
  45. Waters, D. J., et al. Morphology of Photopolymerized End-linked Poly(ethylene glycol) Hydrogels by Small Angle X-ray Scattering. Macromolecules. 43 (16), 6861-6870 (2010).
  46. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Conjugate addition reactions combined with free-radical cross-linking for the design of materials for tissue engineering. Biomacromolecules. 2 (2), 430-441 (2001).
  47. Kim, M. H., et al. Biofunctionalized Hydrogel Microscaffolds Promote Three-Dimensional Hepatic Sheet Morphology. Macromol Biosci. , (2015).
  48. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.1 (2012).
  49. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  50. Tominaga, H., et al. A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay. Anal Commun. 36 (2), 47-50 (1999).
  51. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to the Microplate Reader. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  52. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  53. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
  54. JoVE Science Education Database. Essentials of Environmental Microbiology. RNA Analysis of Environmental Samples Using RT-PCR. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  55. JoVE Science Education. Essentials of Environmental Microbiology. , JoVE. (2015).
  56. Jeong, S., et al. The evolution of gene regulation underlies a morphological difference between two Drosophila sister species. Cell. 132 (5), 783-793 (2008).
  57. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering--current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), 1009-1014 (2002).
  58. Hegde, M., et al. Dynamic Interplay of Flow and Collagen Stabilizes Primary Hepatocytes Culture in a Microfluidic Platform. Lab Chip. 14, 2033-2039 (2014).
  59. Kim, Y., Lasher, C. D., Milford, L. M., Murali, T., Rajagopalan, P. A comparative study of genome-wide transcriptional profiles of primary hepatocytes in collagen sandwich and monolayer cultures. Tissue Eng Pt C. 16 (6), 1449-1460 (2010).
  60. Baimakhanov, Z., et al. Efficacy of multi-layered hepatocyte sheet transplantation for radiation-induced liver damage and partial hepatectomy in a rat model. Cell Transplant. , (2015).
  61. Li, C. Y., et al. Micropatterned Cell-Cell Interactions Enable Functional Encapsulation of Primary Hepatocytes in Hydrogel Microtissues. Tissue Eng Pt A. 20 (15-16), 2200-2212 (2014).
  62. Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. P Natl A Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
  63. Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
  64. Martinez-Hernandez, A., Amenta, P. The hepatic extracellular matrix. Vichows Archiv A Pathol Anat. 423, 1-11 (1993).
  65. Liu, Y., Wang, S., Lee, J. W., Kotov, N. A. A Floating Self-Assembly Route to Colloidal Crystal Templates for 3D Cell Scaffolds. Chem Mater. 17 (20), 4918-4924 (2005).

Tags

Bioengineering Lever vævsmanipulering poly (ethylenglycol) hydrogel inverteret kolloidt krystal hepatocyt cellekultur biofunctionalization
Fabrikation af Inverted Kolloid Crystal Poly (ethylenglycol) Stillads: En Tre-dimensionel Cell Culture Platform for levervæv Engineering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shirahama, H., Kumar, S. K., Jeon,… More

Shirahama, H., Kumar, S. K., Jeon, W. Y., Kim, M. H., Lee, J. H., Ng, S. S., Tabaei, S. R., Cho, N. J. Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (114), e54331, doi:10.3791/54331 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter