Abstract
Pancreatic cancer förblir en av de cancerformer som överlevnad inte har förbättrats avsevärt under de senaste decennierna. Endast 7% av de diagnostiserade patienterna överlever längre än fem år. För att förstå och efterlikna mikromiljön av pankreatiska tumörer, använde vi en murin orthotopic modell för cancer i bukspottskörteln som tillåter icke-invasiv avbildning av tumörprogression i realtid. Pankreatiska cancerceller som uttrycker grönt fluorescerande protein (PANC-1 GFP) suspenderades i basalmembranmatrisen, hög koncentration, (t.ex., Matrigel HC) med serumfritt medium och sedan injiceras i svansen i bukspottkörteln via laparotomi. Cellsuspensionen i den höga koncentrationen basalmembranmatrisen blir en gel-liknande substans när den når rumstemperatur; därför, gelar den när den kommer i kontakt med bukspottkörteln, vilket skapar en tätning vid injektionsstället och förhindra någon cell läckage. Tumörtillväxt och metastas till andra organ övervakas i levandedjur genom användning av fluorescens. Det är kritiskt att använda lämpliga filter för excitation och emission av GFP. Stegen för orthotopic implantation beskrivs i den här artikeln så forskarna lätt kan replikera proceduren i nakna möss. De viktigaste stegen i detta protokoll är beredning av cellsuspensionen, kirurgisk implantation, och hela kroppen fluorescerande in vivo imaging. Detta orthotopic modellen är utformad för att undersöka effekten av nya läkemedel på primära och metastatiska tumörer.
Introduction
Cancer i bukspottskörteln är diagnostiseras med ökad frekvens jämfört med andra cancerformer och är den 4: e vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i USA. Från tiden för diagnos, över 90% av patienterna dör inom fem år 1,2. För närvarande är kirurgiskt tumör avlägsnande det enda botemedlet för bukspottkörtelcancer, men mindre än 20% av patienterna är berättigade att opereras främst på grund vid tidpunkten för diagnos av sjukdomen är i ett framskridet stadium och har spridit 3,4. Avsaknaden av specifika symtom gör pankreascancer en tyst sjukdom; några av de symtom är buksmärtor, ryggsmärtor, aptitlöshet, gulsot och illamående; som lätt kan tolkas som vanliga matsmältningssjukdomar 4. Av denna anledning är det viktigt att utveckla nya farmakologiska verktyg för att hjälpa till vid diagnos och behandling av cancer i bukspottskörteln.
Användningen av djurmodeller tillåter oss att förstå biologi pancrematiska cancer och ger en inblick i tillämpningen av denna kunskap till människor. Xenograft orthotopic modeller av cancer i bukspottskörteln är realistiska, eftersom tumörer växer i det organ i ursprungs 5. I motsats till heterotopiska modeller, där cellinjer eller tumörfragment implanteras subkutant tillåter orthotopic modellering för rekreation av tumören mikro och härmar interaktionen av tumörceller med sin omgivning 6. Xenograft-modellen beskrivs här härleder tumörer från den humana pankreascancer-cellinjen PANC-1 GFP, som är genetiskt manipulerade för att uttrycka det grönt fluorescerande protein (GFP). GFP upptäckt möjliggör för en icke-invasiv avbildning och övervakning av tumörtillväxt och metastas 7. Tumörutveckling sker snabbt, spontant, och liknar den för primärtumörer i patienter med pankreas 8 humana cancer. Orthotopic modeller ger en mer exakt förutsäga läkemedlets effektivitet som svar på terapeutiska medel, medanmimicking tumörens mikromiljö.
Såsom nämnts ovan, gör det möjligt för denna djurmodell fluorescerande detektion av tumörtillväxt och metastas i realtid. Fluorescerande detektering möjliggör en mer direkt / Bildproduktion jämfört med luminiscens. Med fluorescens det emitterade ljuset är ett resultat av en excitation av ett annat ljus med en kortare våglängd; medan det i luminescens, är det emitterade ljuset är resultatet av en kemisk reaktion och kanske inte har stark emission 9. Dessutom är hela kroppen in vivo fluorescerande imaging inte skadar djuret och tillåter forskare att övervaka tumörtillväxt över tiden som svar på terapeutiska behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet som beskrivs nedan utförs under ledning och godkännande av Western University Animal Care och användning kommittén. Alla experiment utförs i enlighet med alla relevanta riktlinjer, reglering och tillsynsmyndigheter.
1. Cellodling
- Framställning av Komplett Medium
- Med användning av en klass II biologiskt säkerhetsskåp, förbereda fullständigt medium genom att aseptiskt tillsätta fetalt bovint serum (FBS) och penicillin streptomycin (P / S) till en 500 ml flaska RPMI-medium. Blanda försiktigt genom att snurra. Den slutliga koncentrationen av varje tillägg är 10% FBS och 1% P / S (v / v). Till exempel komplettera 500 ml media med 56 ml FBS och 6 ml P / S.
- Placera komplett medium i ett vattenbad vid 37 ° C.
- Upptining och sprida celler
- Hämta PANC-1 GFP celler från flytande kväve. Tina flaskan genom försiktig omrörning i ett vattenbad vid 37 ° C.
Notera:Upptining bör vara snabb (ca 2-3 min). - Etikett T-75-kolvar att användas med (a) cell-linje namn, (b) antal passager, (c) datum, och (d) forskarens initialer.
- Torka av injektionsflaska med 70% etanol och överföringsflaskan till en biosäkerhet skåp.
- Att propagera cellerna, tillsätt 9,0 ml av komplett medium till ett 15 ml koniskt rör. Med hjälp av en 1,0 ml pipett försiktigt överföra cellsuspensionen och suspendera det i 9 ml komplett medium.
- Centrifugera vid 125 xg under 8 minuter vid RT. Överför koniska flaskan till en biosäkerhet skåp och aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
- Suspendera pelleten i 10 ml färskt fullständigt medium genom att försiktigt pipettera suspensionen upp och ned.
- Räkna cellerna med en hemocytometer och plattan dem i T-75-kolvar vid en densitet av 2,1 x 10 6 celler / kolv. Placera kolven i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Övervaka cellerna dagligen av ögat och under mikroskop. Om influensaid förnyelse behövs aseptiskt aspirera komplett odlingsmedium från kolven och kasta. Lägga lika stor volym av färskt fullständigt medium.
- Hämta PANC-1 GFP celler från flytande kväve. Tina flaskan genom försiktig omrörning i ett vattenbad vid 37 ° C.
- föröknings Celler
- Aseptiskt avlägsna mediet från kolven. Tillsätt 5 ml Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) för att skölja celler och kasta.
- Lösgöra cellerna från kolven genom tillsats av 3 ml av 0,25% trypsin. Inkubera kolv innehållande trypsin vid 37 ° C och 5% CO2 under 5 till 10 min.
- Observera celler under mikroskop (10X förstoring) och se till att de är runda och rubbas.
- Neutralisera trypsin genom tillsats av en lika stor volym av fullständigt medium och bryta upp klumpar genom att försiktigt pipettera upp och ner.
- Räkna celler med hjälp av en hemocytometer och överföra den lämpliga cellsuspensionsvolymen till nya flaskor vid celldensiteten anges i 1.2.7; tillsätt tillräckligt färskt medium så att den slutliga volymen är 10 ml per kolv.
- cell Suspension Förberedelse för injektion
Obs! Eftersom basalmembranet matris, hög koncentration, stelnar vid RT, hålla alla material på is. Placera alla sterila pipettspetsar och flaskor i frysen över natten, och hålla på is medan du arbetar på suspensionen.- Håll en flaska RPMI media utan några tillsatser på is. Tina basalmembranet matris, hög koncentration, genom att följa tillverkarens instruktioner. Företrädesvis prov i mindre flaskor undvika flera frys-tö cykler 10.
- Aspirera media från alla kolvar och skölj med 5 ml DPBS. Upprepa alla steg på föregående avsnitt upp till steg 1.3.4.
- Överför innehållet till en 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 125 xg under 8 minuter vid RT. Överför konisk flaska på biosäkerhet skåp och återsuspendera pelleten med hjälp av 10 ml DPBS.
- pipett försiktigt suspensionen upp och ned för att bryta upp pelleten. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
- Centrifugera igen som det beskrivs i sTep 1.4.3. Aspirera supernatanten och beroende på antalet celler, tillsätt lämplig spädningsmedel för att ge 3 x 10 6 celler i en volym av 50 | il. Utspädningsmedlet kommer att vara en blandning av serumfritt medium och hög koncentration basalmatrisen membran i en 1: 1 (volym / volym) förhållande.
- Vortex suspensionen försiktigt och hålla på is hela tiden. Suspensionen är nu färdig för injektion.
- kirurgisk implantation
Observera: Se till att alla kirurgiska material och instrument är sterila. Öva aseptiska tekniker vid alla tidpunkter.- Placera en värmedyna på bordet och täck med en steril duk. Ställ in anestesiapparaten och se till att alla leveranser är inom räckhåll.
- Placera djurets nos in i anestesimask och ställa in anestesi till en L / min av syre och 2,5% isofluran.
- skrubba försiktigt flanken hos djuret med jod, och skölj med 70% etanol. Upprepa tre gånger.
- bekräftadjuret är helt bedövad genom att klämma baktassen. Djuret är fullt bedövad och redo för operation om inget svar observeras. Men om djuret flinches, se till att det finns tillräckligt med anestesi i förångaren och tillåta djuret mer tid att gå helt under anestesi.
- Belastning ca 200 pl av cellsuspensionen i en 1,0 ml TB spruta med en 18 G nål (tidigare kyld). Byt ut nålen med en 27 G nål och återgå till is tills den ska användas.
- Leta det allmänna området av mjälte (övre vänstra kvadranten av buken) och använder pincett nypa huden ovanpå denna region. Med kirurgiska saxar gör ett snitt på ca 1,0 cm för att skapa en ficka. På liknande sätt nypa den glatta muskulaturen på toppen av mjälten och skär igenom för att komma åt bukhålan.
- ta försiktigt den bakre änden av mjälten och dra ut det ur kroppen. Bukspottkörteln kommer att knytas till mjälten. Sprid bukspottkörteln med hjälp av en våt sterile Q-tip och lokalisera svansen av pankreas.
- Leverera 50 pl injektion i svansen av bukspottkörteln, lämna nålen inne i 10 sekunder och vrid långsamt ut nålen i bukspottkörteln. En framgångsrik implantation kommer att se ut en ytlig bubbla utan läckor.
- Återvända bukspottkörteln och mjälten till peritonealkaviteten. Först bifoga muskler och sedan bifoga huden separat. Använd en 6-0 sutur eller stapelvara för att stänga snittet. För att undvika smärta i djuret, administrera ketoprofen subkutant (SC) (5 mg / kg) under 24 h. Alternativt, administrera buprenorfin fm (0,05 till 0,1 mg / kg) var 12 timmar under en 36 timmarsperiod.
- Återskapa djuret från anestesi och återlämna den till sin bur. Också övervaka smärta. Djur skall förses med smärtlindring vid tidpunkten för (eller ens före - förebyggande) kirurgi. Ytterligare smärtlindring måste ges till djur som upplever smärta enligt IACCUC-protokoll eller som ordinerats av åtmintenderar veterinär eller utsedd.
- In vivo Imaging
Notera: Bildinsamling utfördes med användning av ett kommersiellt avbildningssystem utrustat med en mörk kammare och de lämpliga filtren för GFP avbildning. Bildtagning åstadkoms med hjälp av en CCD-kamera och ett optiskt system som består av utbytbara excitation / emissions linser (excitation: 455-495 nm, utsläpp: 513-557 nm). Ljusa fält bilder fångades utan ett filter vid 1 x 1 binning för varje tidpunkt. Excitering av GFP utnyttjade en xenon multispektral ljuskälla. Djuren hölls under anestesi under hela avbildningsprocessen genom att ansluta anestesiapparaten till en gas anestesi förgreningsrör integrerat i den mörka kammaren av avbildningssystemet.- Söva djuret som beskrivs i 1.5.2. En anestesimask är i det inre av det kommersiella avbildningssystemets mörk kammare för att hålla djuret under anestesi under avbildningBehandla.
- Ställ in rätt excitations- och emissionsfilter.
- Börja med att erhålla en initial bild med enbart vitt ljus. Hålla samma position av djuret under hela avbildning session och växla till GFP filter för att ta en andra bild.
- För bästa resultat lagra båda bilderna. Analysera bilden för lysrörs område och intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod beskriver en kirurgisk orthotopic implantation av fluorescerande humana pankreascancerceller, med fokus på förberedelserna av cellinjektionsvätska, suspension, lämplig anestesi för gnagare, leverans av cellsuspensionen via laparotomi, och användningen av fluorescerande in vivo litet djur avbildning. Detektering av en grön fluorescenssignal (GFP signal) mellan två och tre veckor efter implantation, ger forskarna en visuell för att bekräfta närvaron av en cancer i bukspottskörteln tumör (figur 1). Figur 1 består av tre bilder av en mus med PANC-1 GFP fluorescent tumör. Den första tas under vitt ljus (Figur 1A); den andra bilden är tagen i blått fluorescerande ljus (excitation: 455-495 nm, emission: 513-557 nm) för att avbilda den gröna fluorescens som emitteras från PANC-1 pankreastumör (Figur 1B); den tredje är en komposit avde två första och visar platsen för tumören inuti kroppen av musen (Figur 1C). Djur som inte utvecklar tumörer inte visar GFP signal (Figur 2). Vidare kan representativa bilder av tumörprogression över tid vara ett icke-invasivt övervakas genom registrering av GFP-signal vid olika tidpunkter (figur 3). Figur 3 visar flera kompositer av GFP-signaler över tiden. Som tiden fortskrider, och tumörstorleken ökar, signalen ökar GFP. Tjugo dagar efter implantationen visas tumören som en liten grön prick, och 50 dagar efter implantation, ökar tumörstorleken betydligt. Figur 4A visar metastaser till mjälten, levern och mag-tarmkanalen, vilket kan bekräftas efter det att djuret har avlivas och organen tas bort för ex vivo fluorescerande imaging (Figur 4B).
Figur 2: implantation Felsökning Bristande Fluorescence representation av en mus i en tid då tumören ännu inte hade utvecklats. (A) Bild erhölls medvitt ljus och inget filter. (B) Bild erhölls med användning av blått ljus och särskilda filter för GFP. (C) En sammansatt bild av A och B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: In vivo Realtid Fluorescent Imaging att spåra Primär tumörtillväxt. In vivo avbildning av PANC-1 GFP bukspottkörtelcancer progression vid olika tidpunkter efter implantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver ett orthotopic musmodell för cancer i bukspottskörteln som uttrycker GFP, vilket möjliggör icke-invasiv övervakning av tumörtillväxt med hjälp av hela kroppen in vivo fluorescerande imaging (Figur 1). Denna teknik tillåter oss att övervaka tumörutveckling i realtid (figur 3); det kan vara ett viktigt verktyg för forskare att studera den terapeutiska effekten av nya medel mot cancer i bukspottkörteln. En annan viktig aspekt av denna modell är att GFP-fluorescens ger en visuell kö indikerar lyckad implantation och tillväxt av cancer i bukspottskörteln; som annars skulle vara svårt att bedöma med levande djur. I överensstämmelse med den kliniska situationen, ger denna modell en insikt om metastaser. Den visar metastaser till de omgivande organ: mjälte, mesenteriska lymfknutor, lever och mag-tarmkanalen (figur 4). Vi observerade metastaser så tidigt som 7 veckor efter transplantation. PANC-1 metastaser har varit reported i intervallet 10 - 18 veckor 11. Den tidpunkt vid vilken metastas observeras kan bero på antalet implanterade celler, implantation och visualiseringstekniker. I den aktuella studien, valde vi ett grönt fluorescerande cellinje, PANC-1 GFP, som är kommersiellt tillgänglig. Den modell som beskrivs här är reproducerbar och metastaserna kan enkelt visualiseras eftersom de har ljusa fluorescens. En begränsning hos xenograft nude musmodeller framställda från etablerade cancercellinjer är möjligheten till reducerad tumör heterogenitet jämfört med en ursprunglig human tumör 12; ändå modellen är reproducerbar, lätt att utveckla och följa sina framsteg i levande djur. Dessutom xenograft musmodeller fortsätta att användas i stor utsträckning inom cancerforskningen.
De fluorescensmärkta celler skall pelletiseras och åter suspenderades i iskall serumfritt medium blandades med lika stor volym av iskall basalmembranet 8. Cellsuspensionen måste vara maintained på is hela tiden för att förhindra gelning eller stelning. Det är viktigt att ladda de sprutor med en 18 gauge nål för att undvika lysering av cellerna. Om cellerna lyseras, är cellsuspensionen oanvändbart, och ingen tumörtillväxt kommer att uppnås (Figur 2). Omedelbart efter injektion, tillåter ca 10 sek för cellsuspensionen att stelna före avlägsnande av nålen från injektionsstället. De stelningsegenskaperna hos suspensionen tillät oss att injicera cellerna utan läckage från injektionsstället. Läckage av celler kan leda till metastaser som en artefakt snarare än från cellspridning. Vi har optimerat denna orthotopic implantation av PANC-1 GFP cellinje med 3 x 10 6 celler per 50 pl injektion; andra cellinje implantationer måste bestämmas empiriskt. Högre volymer injektion upp till 100 pl innehållande 500.000 celler har rapporterats i litteraturen 12. De huvudsakliga optimeringsparametrarna TAken hänsyn lyckades orthotopic tumörtillväxt och positiv tumöravbildning via GFP fluorescens inom tre veckor efter implantation.
Tumörtillväxt och utveckling är inte bara påverkas av antalet celler som injicerats, utan även vid en ålder av mössen som används. Vi har använt atymiska nakna möss och fastställt att användning av unga möss i åldrarna sex till åtta veckor ger mer reproducerbara resultat jämfört med äldre möss. Eftersom dessa möss ålder, börjar de att återfå viss immunitet, vilket kan resultera i avstötning av de humana pankreasceller. De avbildningstekniker som beskrivs här är inte begränsade till orthotopic användning; de kan också användas för heterotopisk implantering av tumörer. Man måste vara försiktig för att undvika auto-fluorescens som kan skymma tumören GFP-signal. Vissa plaster som används för anestesi slang kan producera auto-fluorescerande artefakter.
Fluorescerande hela kroppen avbildning möjliggör snabb analys av tumörtillväxt och progression 13. En stor fördel med att använda fluorescens är möjligheten att spåra cancer utan de traditionella besvärliga förfaranden för histopatologisk undersökning eller immunohistokemi 14. Denna modell har stark fluorescens och möjliggör bilden förvärvet utan behov av hud flikar eller andra manipulationer. Fluorescens skiljer sig från mareld i att det inte skapar ljus baserad på en kemisk reaktion; det absorberar bara ljus och reemits den på en lägre frekvens. Orthotopic xenograft-modeller ge ovärderlig kunskap och förståelse för pankreastumörbiologi som kan översättas till nya terapier för humant bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-077 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC basement membrane, high concentration | Corning | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare or Foamed Antiseptic Handrub | Steris | 639680 | |
| DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB Syringe 27 G 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Surgical Scissors, 5.5" straight mayo | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP cell line | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. Upland, CA. | Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals |
References
- Siegel, R. Pancreatic Cancer Stats: American Cancer Society: Cancer Facts & Figures. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/acspc-042151.pdf (2014).
- Smyth, E., Cunningham, D. Harrison's Principles of Internal Medicine. Kasper, D., et al. , 19th edn, McGraw-Hill Education. (2015).
- Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Kim, R. Management of borderline resectable pancreatic cancer. World J Gastrointest Oncol. 7, 241-249 (2015).
- De La Cruz, M. S., Young, A. P., Ruffin, M. T. Diagnosis and management of pancreatic cancer. Am Fam Physician. 89, 626-632 (2014).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A.
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nat Rev Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nat Rev Cancer. 5, 796-806 (2005).
- Jiang, Y. J. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: cells suspended and injected in Matrigel. World J Gastroenterol. 20, 9476-9485 (2014).
- Arranz, A., Ripoll, J. Advances in optical imaging for pharmacological studies. Front Pharmacol. 6, 189 (2015).
- Corning. Corning Matrigel Matrix: Frequently Asked Questions. , Available from: http://csmedia2.corning.com/LifeSciences/media/pdf/faq_DL_026_Corning_Matrigel_Matrix.pdf (2013).
- Metildi, C. A., Kaushal, S., Hoffman, R. M., Bouvet, M. In vivo serial selection of human pancreatic cancer cells in orthotopic mouse models produces high metastatic variants irrespective of Kras status. J Surg Res. 184, 290-298 (2013).
- Kim, M. P. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Katz, M. H. Survival efficacy of adjuvant cytosine-analogue CS-682 in a fluorescent orthotopic model of human pancreatic cancer. Cancer Res. 64, 1828-1833 (2004).
- Bouvet, M. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Res. 62, 1534-1540 (2002).
