Introduction
종양 억제 유전자는 p53의는 세포주기 억류, 아폽토시스 및 노화 한 포함한 세포 프로세스의 개수의 필수 레귤레이터이다. 이는 게놈 안정성을 유지할 책임이 있으며, 따라서, 세포 사멸 및 세포 성장의 균형을 유지하는데 중요하다. p53의 돌연변이 암에서 흔히 조절되지 않은 암 세포 증식이 선도 p53의 불 활성화의 주요 원인이다. 흥미롭게도, p53의 돌연변이는 다른 메커니즘은 p53의 기능의 손실에 대해 책임이 있음을 시사 유방암 3의 약 25 %를 차지한다. 최근에 발견 된 p53의 이성체는 인간 암의 다수의 과발현되는 것으로 도시되어 있고, p53의 기능 4,5-를 변조 할 수있다. 우리는 p53의 이성체, Δ40p53는 유방암에서 가장 높은 발현 이성체가 있음을 이전에 도시 한 통상 인접 담배 마는에 비해 상당히 유방암 세포에서 상향 조절된다UE (6). 이것에 따라, 우리는 안정적 레고 IG2 - 순수하지 않아 + 벡터 (GFP의 +)를 이용하여 7 Δ40p53 과발현하는 인간 유방암 세포주 MCF-7 형질. 이들 세포는 높은 Δ40p53 식 유방암 세포에서 세포의 증식 속도가 증가하면 조사 하였다.
시험관 8,9 배양 세포의 세포 증식을 측정하는 다수의 직접 및 간접 방법이있다. 이러한 시간에 따른 연속 측정 또는 종점 분석법 10 중 수행 될 수있다. 기존의 방법은 혈구를 사용하여 세포 계수로, 여전히 유용하다. 이 분석은 낮은 비용과 셀 번호 직접 측정이지만, 계산에서 오류가 큰 표준 편차를 최소화하기 위해 큰 세포 수 및 숙련 된 훈련에 의존 않는다. 고 스루풋 포맷과 호환 측정을 수행 할 필요가 멀티 웰 플레이트 검정의 개발을 유도 하였다. 이 발광 기반 분석은 measu셀 (11, 12)의 대사 활동에 비례하는 발광 신호에 기초하여 세포 수를 재. 최근에, 고 함량의 이미징 플랫폼의 도입 양적 및 질적 표현형 데이터 수집을 제공하는 동안 세포 증식을 모니터링 할 수있는 새로운 도구시키고, 시스템 (13)의 다양한 종류를 포함하고있다. 이들 방법은 모두 연속적인 측정 또는 종점 분석법에 의해 하나, 세포의 성장을 측정하는 길을 제공하며, 각 따라 적절하게 칭량 할 수 모두 감도에 관해서, 시료 번호의 처리량 및 셀 정보 장단점 범위를 가지고 연구 질문에.
이 프로토콜은 감도, 재현성 및 멀티 웰 플레이트 포맷의 다른 범위를 이용하여 각 방법으로 시험관 내에서 세포 증식을 측정하기위한 세 가지 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 혈구 계수 차의 사용과 비교 대상mber 96 시간의 시간 과정을 통해 세포 증식의 측정에 기반 발광 세포 생존력 분석법 및 세포 이미 저. 이를 위해, 벡터 - 형질 도입 된 세포 (MCF-7 LEGO)의 성장은 세 가지 세포 밀도를 사용 Δ40p53 (MCF-7 Δ40p53)를 과발현하는 형질 도입 된 세포와 비교 하였다. 세포 증식은 최대 96 시간 동안 매 24 시간을 측정 하였다. 각 방법은 자체의 장점 및 단점을 갖는 것으로, 상기 실험의 목적에 따라 각 여전히 증식 속도에 대한 정보를 제공하기위한 유용한 방법 하였다.
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Protocol
대량 살상 무기 확산 시험 법 1. 준비 세포
주 : 각각의 방법은 분석 될 수 있도록 동일한 포맷에 동일하게 종자의 두 세포주를 준비한다.
- 사용 T에 MCF-7 레고 및 MCF-7 Δ40p53 75 ㎠로 조직 배양 플라스크 75-80% 합류 7 세포 성장 페놀 레드없는 10 % 소 태아 혈청으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) (FBS) 200 mM의 L- 글루타민, 2 μg의 / ㎖ 인슐린, 5 % CO 2, 37 ℃에서 1 μg의 / ml의 퓨로 마이신. 멸균 바이오 안전성 캐비닛 클래스 II의 셀을 처리합니다.
참고 : 합류로 세포를 성장하는 데 걸리는 시간은 시드 희석에 따라 변한다. 확산 분석을위한 세포를 도금에 대비, 1에서 세포를 시드 : 보충 DMEM 3 희석 및 75~80%의 자랄 때까지 3 일 동안 정상적인 성장 조건에서 유지한다. - 에 미디어를 붓고, 플라스크에서 세포를 제거하려면폐기물 용기. 즉시 예열 배 트립신 2 ㎖의 세포 층을 세척한다. 기음 트립신. 5 % CO 2, 37 ℃에서 5 분 동안 항온 세포층과 장소에 미리 가온 된 트립신의 또이 용액을 추가한다.
- 세포가 분리되면, 신선한 DMEM을 보충 따뜻해진 10 ml의 세포를 씻는다. RT에서 5 분 동안 491 XG에 멸균 15 ml의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. 조심스럽게 기음과 뜨는 폐기하십시오.
- 신선한 보충 된 DMEM 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 96- 웰 플레이트에서 세포를 배정하는 정확한 농도를 결정하기 위해 셀 카운트를 수행한다.
- 900 ㎕의 1X 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)에 세포 현탁액 100 ㎕를 희석. 자동 세포 계수기에 새로운 60 μm의 센서를 배치합니다. 플런저를 누른 상태에서 희석 세포 현탁액에 센서를 잠수함. 천천히 셀 카운터에 플런저를 놓습니다. 셀 COU에서 센서를 제거nter 완료 할 때.
주 : 세포 수는 세포 / ml의 세포 카운터에 표시된다.
- 900 ㎕의 1X 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)에 세포 현탁액 100 ㎕를 희석. 자동 세포 계수기에 새로운 60 μm의 센서를 배치합니다. 플런저를 누른 상태에서 희석 세포 현탁액에 센서를 잠수함. 천천히 셀 카운터에 플런저를 놓습니다. 셀 COU에서 센서를 제거nter 완료 할 때.
- 20 % 컨 플루 ~에서 96 웰 플레이트 (DMEM)에서 100 μL의 최종 부피에서 종자 세포 3~5일 (표 1 참조)를 통해 증식 세포 증식 측정을위한 공간을 허용한다. 세중의 모든 세포 라인을 시드.
주 :이 실험을 위해, 세 가지 세포 밀도는 최적의 세포 밀도를 결정하기 위해 평가 하였다. 필요한 세포 수는 표 1에 요약되어있다. 종자 세포를 낮은 밀도보다 장기 성장의 측정이 필요한 경우.- 혈구 및 발광 기반 분석의 경우 (즉, 분석 당 4 판) 시점 당 한 판을 준비합니다. 셀 메이져 분석의 경우, 실험 지속 기간 동안 하나의 플레이트를 준비한다.
- 24 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 유지한다.
2. 결정 세포는 우리를 카운트혈구를 보내고
- 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C까지 사전 따뜻한 두 매체와 트립신, 오븐 또는 물 목욕. 폐기물 용기에 세포를 대기음 매체는 2 배 트립신 30 μl를 한 번 세척하고, 트립신을 대기음.
- 배 트립신 30 μl를 다시 세포를 씻으, 37 ° C에서 5 분 동안 품어. 부드럽게 판에서 셀을 제거하기 위해 판의 가장자리를 누릅니다. 보충 된 DMEM 50 μl를 첨가하고 세포를 단일 세포 현탁액을 형성 할 때까지 피펫 팅하여 세포를 혼합한다.
- 70 % 에탄올로 표면과 유리 커버를 청소하여 혈구를 준비합니다.
- 계산 챔버 위에 유리 커버 슬립을 놓고 '뉴턴의 굴절 반지'커버 슬립의 가장자리와 혈구 사이에 볼 수있을 때까지 부착합니다.
참고 :이 커버 슬립 올바르게 혈구에 부착 된 것을 나타냅니다. - 부드럽게 모세관 운동에 의해 카운팅 챔버를 채우고, 커버 슬립에 따라 세포 현탁액 20 μL 피펫.현미경의 10 배 배율에서 혈구를 놓고 그리드 레이아웃 계산 실을 시각화.
- 그리드 레이아웃의 4 바깥 쪽 사각형의 세포를 계산합니다. 정확성을 개선하기 위해 추가로 외부 사각형의 반복 계산이 필요하거나 수까지 70에 도달하면 - 100 세포 14, 15입니다.
- 다음과 같이 ml의 당 세포 농도를 계산 : 사각형의 X 희석 계수 당 평균 세포 수를 (사용 된 경우) 10 (4) X
- 반복 2.1-2.8 매 24 시간 96 시간 동안 후 파종 단계를 반복합니다.
3. 발광 기반 분석법을 이용하여 세포 증식을 결정
참고 :이 엔드 포인트의 측정이다. 시약을 세포에 첨가하면, 플레이트 번만 정량화 할 수있다.
- 30 분 동안 22 ℃로 물을 욕조에 해동 발광 시약.
- 부드럽게 균질 혼합물을 얻기 위해 병을 반전시킴으로써 시약을 혼합한다.
- 단계에서 (시드 세포의 한 판 평형1.5)을 실온에서 30 분 동안.
- 각 웰에 발광 시약 100 μl를 추가합니다. 2 분 동안 궤도 통에 내용을 섞는다. 플레이트는 실온에서 10 분 동안 배양 할 수 있습니다.
- 다중 모드 플레이트 판독기 소프트웨어를 사용하여 발광 실험 설정.
- 멀티 모드 플레이트 리더를 켜고 소프트웨어를 엽니 다. '작업 관리자'에서 '실험'을 선택하고 파일 'new'.Select 만드는'측 도구 모음에서, 그리고 아래의 '프로토콜 절차'를 '탭을 선택'.
- 선택 'Grenier의 96 평평한 바닥'플레이트 유형 및 '사용 뚜껑'확인란을 선택합니다. '읽는 방법'상자에서 '읽기'작업을 선택합니다. '발광'검출 방법을 선택합니다. '확인'을 클릭합니다.
- 읽기 단계 상자에서 '전체 판'탭에서 스캔 할 수있는 우물을 선택하고 빈 우물을 행동 우물을 선택합니다.
- (: 구멍, 거울 : 없음 예를 들어, 플러그, 엠) 빈 필터 설정 필터를 설정합니다. 에 게인을 설정135 웰 당 0.5 초 적분 시간과 6.5 mm의 높이를 판독. 발광 읽기 설정을 저장하려면 '확인'을 클릭하십시오.
- 발광 읽기를 수행
- '기기 제어'탭을 선택하여 플레이트 홀더를 꺼내와 '뚜껑을 보장하는 것은 켜져 판 홀더에 96 웰 플레이트를 out'.Place 판을 클릭합니다. 아래 '기기 제어'탭 '에 판'을 클릭하여 판 홀더를 닫습니다. 발광 읽기를 수행하기 위해 도구 모음에서 '지금 읽기'를 클릭합니다.
- 또한 추가 분석을 위해 스프레드 시트에 각각의 상대 발광 장치 (RLU) 측정을 보냅니다.
- 반복 세포를 파종 한 후 증식에게 96 시간에 매일 24 시간 최대를 기록 할 3.1-3.6 단계를 반복합니다.
4. 셀 이미 저를 사용하여 세포 수를 결정
- 다중 모드 셀 메이져 소프트웨어를 사용하여 세포 이미징 실험 설정
- 멀티 모드 셀 이미 저와 오픈 일을 켭니다전자 소프트웨어.
- '작업 관리자'에서 '실험'탭을 선택하고 '도구 모음에서 클릭'파일 'new'.On에게 만들기'프로토콜 '탭을 열고'절차 'tab.Select'설정 온도 '조치를. '에'에 인큐베이터를 설정하고 37 ° C로 온도를 설정하고 다음 단계 '상자를 계속하기 전에'예열 '확인합니다. 설정을 저장하려면 '확인'을 클릭합니다.
- '읽기'작업을 선택합니다. '이미지'검출 방법을 클릭하여 '엔드 포인트 / 운동'읽기 유형과 '필터'광학 유형을 선택합니다. 접시에 전체 판 '탭'에 OK'.Click '를 클릭하고 우물 군데한다. 설정을 저장하려면 '확인'을 클릭합니다.
- '목표'옵션 드롭 다운에서 2.5 배의 목표를 선택합니다. GFP 469, 525 및 밝은 필드 '채널'탭에서 두 개의 채널을 선택합니다. 두 채널 모두를위한 '자동'노출을 확인하고 잘 자동 노출을 선택합니다.
- AUT을 확인하려면오 포커스 설정이 '자동 초점'을 선택하고 '옵션'을 클릭합니다. 자동 초점 옵션의 경우, '다음 자동 초점을 스캔하고'방법을 선택합니다. 설정을 저장하려면 '확인'을 클릭합니다.
- 설정 수평 및 수평 간격 (μm의) = 2881 및 수직 간격 (μm의) = 2127으로, 3 × 2 몽타주에 잘 당 여러 이미지를 스캔 0.Select하는 것이 아니라 (μm의)의 중심에서 수직 오프셋. 프로 시저 설정을 저장하려면 '확인'을 클릭합니다.
참고 : 읽기 매개 변수에 대한 표 2를 참조하십시오.
- 선정 된 플레이트에 대한 읽기 실험을 수행
- 뚜껑을 보장하는 것은 켜져의 '장비 제어'탭을 클릭하고 '밖으로 판'function.Place에게 판 홀더 96 웰 플레이트를 선택합니다. '기기 제어'탭에서 함수 '에서 판'를 선택합니다. 선택 판 탭에서 '지금 읽기'. 96 시간의 후 파종 할 때마다 24 시간까지를 읽어 반복합니다.
- 를 사용하여 세포 수의 분석셀 이미 저 소프트웨어.
- 이미지를 분석하기 위해, 이미지화 된 판의 '데이터'탭을 클릭, 선택 '사진 [GFP 469, 525 + 밝은 필드]. 잘 군데 온 두 번 클릭합니다.
- 로드 이미지를 클릭하십시오. 선택 '분석'과 몽타주의 단일 이미지 분석을 선택합니다. GFP '를 OK'.Check'클릭 '만 채널 및 표 3에 설명 된대로 설정 매개 변수를. 클릭'이미징 세포 매개 변수를 적용 START '를.
- 이미지 당 세포 수를 결정하는 데 사용되는 이미징 셀 위에 위치하는 셀 카운팅 마스크를 관찰한다. 클릭 실험을하는 동안 몇 군데 각 플레이트에 대해이 설정을 '변경 사항을 적용'을 유지한다.
- 일단 다시 이미지화 된 판에, 다운 메뉴에서 '데이터'메뉴를 클릭하고 '세포 수'를 선택합니다. 이것은 물론 당 전체 세포 수를 생성합니다.
- 추가 분석 O를위한 '수출'탭을 클릭하여 스프레드 시트에있는 모든 데이터를 내보내기웰 당 세포 수 (F).
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Representative Results
배양 된 세포의 증식 - Δ40p53 MCF-7 세포를 형질 도입의 세포 증식을 측정하는 다른 방법을 연구하는 비 형질 MCF-7 레고 유방암 세포주와 비교 하였다. 비교 된 세 가지 방법 - 도식에 설명 된 분석 - 종래 방법 혈구 세포 생존력 발광 분석법 및 세포 이미징 (도 1). 각 방법의 장점은 정확하게 시간이 지남에 따라 셀 계수를 측정하는 단점을 가지고 있으며, 가장 효과적인 방법은 실험의 끝점 요구 및 세포 집단에 대해 획득 될 수있는 정보에 의존한다.
MCF-7 및 MCF-레고 -7- Δ40p53 세포의 성장은 4 일 동안 24 시간 후에 측정 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 두 개의 세포주는 세 가지 세포 밀도 (1.5 × 103로 접종 하였다 103; / 웰)을 세포 계수 5 × 103 세포를 접종 한 후 24, 48, 72 및 96 시간 행 하였다. 각 방법은 96 시간 이상 혈구, 발광 기반 분석법, 및 셀이 메이져 (각각도 2A, B와 C)을 사용하여, 증가 된 세포의 증식을 보였다. 세포 증식의 큰 증가는 높은 세포 밀도 (5 × 103 세포)에서 볼 나타내며 이는 이들 세포의 증식을 측정하기위한 최적의 세포 밀도로 제시, 각 시점에서 대부분의 재현 가능한 결과를 보였다. 세포주와 세포의 증식에 유의 한 차이가 없었다.
다른 방법 사이 세포 증식의 측정은 선형 회귀 분석 (6) (표 4도 3)에 의해 비교 하였다. 다른 방법의 각 사이에 유의 한 상관 관계 테스트가 있었다, 비교 C양 세포주의 세포 밀도 모두에서 엘 증식 (도 3a 및 b). 강한 상관 발광 기반 분석의 비교 및 셀 이미 저간에 관찰되었다 (R 2 = 0.8899, P ≤0.0001; R 2 = 0.9805, P ≤0.0001 각각도 3a 및 b).
셀 이미 저를 사용하여 세포 증식의 시각적 표현 (그림 4) 표시됩니다. 이 방법은 하나의 판의 연속 측정을 사용하기 때문에 세포가 100 %의 합류점 부근에 도달 할 때까지 세포를 매 24 시간을 이미지화 할 수있다. 도 2에 도시 된 바와 같이, MCF-7 및 MCF-레고 -7- Δ40p53 세포의 성장 속도는 모든 시점에 걸쳐 비교 하였다. 이 방법은 시각적으로 여러 날에 걸쳐 세포의 성장을 모니터하고, 셀 크기 및 셀 모토을 비교할 수있는 세포를 포함한 유용한 정보를 제공한다다른 세포 라인 사이의 뜻.
도 1 : 세포 증식을 측정하는 세 가지 방법의 개략도 세포를 96 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 여러 96- 웰 플레이트에 세 가지 세포 밀도로 접종하고 배양 하였다.. 매일 24 시간, 세포 증식이 혈구, 발광 기반 분석 또는 세포 이미징을 사용하거나하여 측정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 세포 증식의 측정은 96 시간 셀 카운트 후 MCF-7 차전에서 96 시간 동안 매 24 시간을 측정 하였다O 및 MCF-7 세포 Δ40p53 세 가지 세포 밀도로 접종. 세포 수는 (b) 발광 계 상대 발광 단위 분석 (RLU) 또는 (c) 세포 / 이미지 셀 이미 저를 사용하여 연속적인 세포 수를 사용하여, 세포 / ml의 (a) 혈구를 사용하여 측정 하였다. 셀 이미 저 조건은 모든 실험은 3 개의 독립적 인 실험의 평균을 나타내는 표 2에 나타낸다는 SD ± 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3. 유방암 세포주에서 세포 증식을 측정하는 세 가지 방법의 비교는 선형 회귀 분석은 상이한 m 사이의 상관 관계를 비교 하였다 (a) MCF-7 세포와 레고 (b) MCF-7 Δ40p53 세포에서 세포 증식을 측정하는 시험 ethods. 피어슨의 상관 계수를 계산하고, 중요성은 세포 증식을 측정하는 다양한 방법간에 (p <0.05)를 측정 하였다. 모든 결과는 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. GFP 양성 MCF-7 레고 및 MCF-7 Δ40p53 유방암 세포의 이미지 세포의 대표 이미지 5 × 10 (3) 접종 세포는 세포 이미 저마다 24 시간을 사용하여 캡처. 스케일 바는 1,000 μm의를 나타냅니다. 세포 이미징을위한 파라미터는 표 2에 요약되어있다. = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg"대상 = "_ 빈"HREF>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 셀 밀도 (세포 / 웰) | |||
| 셀 유형 | 1.5 × 10 3 | 3.0 × 103 | 5 × 10 (3) |
| MCF-7 레고 | 8.4 ml의 미디어에 76 μl를 | 8.3 ml의 미디어 152 μL | 8.2 ml의 미디어 254 μL |
| MCF-7 Δ40p53 | 8.4 ml의 미디어에 93 μl를 | 8.3 ml의 미디어에 185 μL | 8.2 ml의 미디어에 308 μL |
표 1 : 96 웰 플레이트 셀 시드 볼륨.
"fo를하기 : 유지 -에 - next.within 페이지 ="항상 ">표 2 : 셀 이미 저를 사용하여 세포 이미징을위한 읽기 매개 변수.
| 영상 매개 변수 | ||||
| 문지방 | 5000 | |||
| 최소 개체 크기 (μm의) | (30) | |||
| 최대 객체 크기 (μm의) | (300) | |||
| MCF-7 레고 | ||
| R 광장 | p 값이 | |
| 발광 기반 분석 대 혈구 | 0.6301 | 0.0021 |
| 혈구 대 셀 이미 저 | 0.7524 | 0.0003 |
| 셀 이미 저 대 발광 기반 분석 | 0.8899 | <0.0001 |
| MCF-7 Δ40p53 | ||
| R 광장 | p 값이 | |
| 루 대 혈구minescence 기반 분석 | 0.8983 | <0.0001 |
| 혈구 대 셀 이미 저 | 0.9303 | <0.0001 |
| 셀 이미 저 대 발광 기반 분석 | 0.9805 | <0.0001 |
표 4 : 테스트 세 가지 확산 방법의 선형 회귀 분석.
| 방법 | 장점 | 단점 | 기술 노트 | 최종 출력 |
| 혈구 | 저가 | 높은 인간의 오류 | 단일 세포 현탁액을 제조하기 위해 여러 번 피펫 | 세포 / ml |
| 최소한의 장비가 필요합니다 | 단일 세포 현탁액이 필요합니다 | 정확도를 달성하기 위해 다수의 계수를 수행 | ||
| 직접 세포 수 | 세포의 수가 많으면 세포 수의 정확한 평가에 필요한 | |||
| 엔드 포인트 | ||||
| 발광 기반 분석 | 멀티 웰 플레이트 형식으로 사용 | 비싼 시약 | 빛으로부터 보호 | 상대 발광 장치 (RLU) / 웰 |
| 수행하기 쉬운 | 발광 플레이트 리더를 필요 | 배경 발광을 결정하는 제어 우물을 포함 | ||
| 빠른 분석 | 온도에 민감한 | |||
| 세포 생존 정보 제공 | 변수 세포의 신진 대사 활동에 따라 | |||
| 간접 측정 | ||||
| 엔드 포인트 | ||||
| 셀 이미 저 | 연속 측정 | 비싼 이미 저 | 확인 셀 이미 저 37 ° C로 설정 | 세포 / 이미지 |
| 온도 제어 | 집중 스킬 | 세포의 불필요한 흔들림 또는 중단을 방지 | ||
| 휴대 정보를 제공합니다 | 세포의 합류에 따라 변수 | |||
| 비용 효율적인 (당신이 이미 저이있는 경우) | 상대 수 | |||
| 직접 측정 | ||||
| 멀티 웰 플레이트 형식의 자동 영상 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. 이 프로토콜에서 배양 된 세포에서 세포 증식을 측정하는 방법은 세 가지 조사 하였다. 각 방법은 96 시간 동안 세포 증식 재현하고 정확한 측정을 할 수 있었고, 그 결과 (도 2 및 3) 실험 방법 각간에 비교 하였다. 발광 기반 분석법 및 세포 영상 법은 모두 96 시간 후 세포 증식의 선형 증가를 나타내는 가장 강력한 결과를 생성 (도 2b, c). 또한, 시간이 지남에 따라 셀 이미징 형질 도입 및 비 - 형질 도입 된 세포주 (도 4) 사이의 성장 속도에 큰 차이를 도시하지 않는다. 이 많은 장점과 단점은,이 프로토콜에서 검사 각 방법위한 요약 표 5 참조. 혈구를 사용하는 종래의 전지의 계산 방법은 매우 적은 또는 부가적인 시약을 필요 effo 저비용 방법실온 준비하고 실행합니다. 또한,이 방법은 세포 / ㎖ (14)의 절대 셀 카운트 quantitates. 그러나, 카운트 사이의 큰 표준 편차를 초래 세포 계수, 높은 에러 레이트의 자연 소모되는 시간 및 셀 번호 고역 정확한 세포 수에 필요하다는 사실을 포함하는 심각한 단점이있다. 이는 혈구 세포를 이용한 계산은 이후 시점에서 낮은 세포 밀도에서 변수 결과, 큰 표준 편차를 보였다도 2a에서 볼 수있다. 이러한 단점은 작은 접시의 크기와 파종 밀도가 필요한 큰 높은 처리량 측정을위한이 방법은 작은 샘플 크기의 셀 계산에 유용하고, 불충분합니다. 세포 밀도가 세포 계수의 최소 개수는 100보다 큰 셀의 문턱에 시작되도록, 증가 된 경우 이러한 제한이 경감 될 수있다. 개 세포 현탁액을 희석하거나 셀 D 저하ensity 미만 100 세포 수를 계산하고 (15)를 복제 사이 따라서 가변성을 증가시키는 더 많은 기회. 그러나,이 방법에 의한 낮은 세포 표면 영역에, 96 웰 플레이트에 적합하며, 따라서, 분석에 사용할 수있는 셀의 수가 충분. 이것은이 방법이 기능이 필요한 사용자에 대한 명확한 단점의 높은 처리 능력의 부족을 강조한다. 발광 기반 분석은 대사 활성 셀 (16)의 유무의 측정은 ATP의 양을 측정함으로써 세포 생존 능력을 결정한다. 이 분석은 세포 증식을 결정하기 위해 96 웰 플레이트 형식으로 여러 시료 고 처리량 스크리닝을 위해 설계된다. 이 간단한 방식은 대사 적 활성 세포의 ATP의 존재에 비례하는 플레이트 판독기를 사용하여 상대 발광 단위 (RLU)과 같이 세포 증식을 quantitates. 그러나,이 방법의 주요 단점은 t이다그 시약 비용 및 세포의 대사 활성의 측정 의존성. 온도 나 세포주기 시점 등 다양한 세포 배양 조건은 쉽게 분석 (17)에 의해 발생되는 발광 신호에 직접적으로 비례하는 세포에 의해 생성 된 ATP의 양에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 경험적 실험 조건은 세포의 대사 활동에 방해가 잠재적으로 세포에 의해 생성 된 신호의 상대 발광을 방해하지 않는 것으로 판단하는 것이 중요하다. 세포 증식을 결정하기 위해 조사 된 세번째 방법은 상대적인 세포 카운트를 수행하는 생균 이미 저와 소프트웨어이다. 이 분석의 기간에 걸쳐 동일한 셀을 사용하여, 온도 제어에 따라 실시간으로 각 웰에 대해 다수의 이미지를 캡처하는 자동화 할 수 있으므로 이미 저 셀은 높은 처리 능력을 갖는다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 세포 증식 될 수 m세포 계수 분석과 함께 세포 집단에 관한 추가 정보를 제공 할 수있는 시간에 걸쳐 동일한 플레이트에 onitored. 이를 통해 96 웰 플레이트 형식에서 일반적이다 크로스 플레이트 변동 셀 시드 오류를 제거으로 매우 유리하다. 셀 이미 저에 따라 소프트웨어를 표 2 및 3에 제시된 파라미터를 이용하여 세포 수의 정량을 허용한다. 그것은 높은 처리량 설정에 따라서 유용하고 쉽게 사멸 또는 세포 독성 등의 세포 기능을 측정하는 다른 분석으로 다중화 될 수있다. 시스템의 주요 단점은 터치 물체를 분할 할 수있는 능력이 제한되어있는 소프트웨어이다. 이 하부 합류 세포에서이 기능을 수행 할 수 있지만, 상기 분석의 주요 한계이므로 셀 타입 별 최적화를 필요로한다. 이미 저를 사용하여 개별 실험은 매우 낮은 비용이 판에 의해 플레이트 규모에있는 동안 또한,이 방법에 대한 것기기가 이미 실험실에서 설정된 경우 LY는 비용 대비 효과가 될 수있다. 따라서, 이것은 높은 처리량 분석이 방법이 적합하게 배양 된 세포의 세포 증식을 측정하는 새로운 방법을 제공하며, 추가의 시약을 필요로하지의 큰 장점을 가지며, 96 웰 플레이트 자동 카운팅 할 수있다. 이것은 종래의 혈구 세포 계산 방법에 크게 향상하고, 발광 기반 분석에 대한보다 비용 효과적인 선택이다. 셀 화상 카메라를 사용하는 중요한 단계는 촬영 된 이미지와 이미지 당 이후의 세포 수의 분석 중입니다. 이러한 이미지는 세포 이미징 플랫폼의 개수를 사용하여 처리 될 수있다. 조사중인 셀 타입에 대한 가장 적절한 소프트웨어를 결정하는 것이 중요하다. 이는 다른 이미지 소프트웨어를 이용하여 세포의 이미 저에 의해 취득 된 화상으로부터 세포 수를 확인하는 데 유용하다. 이 프로토콜은 적용될 수있다Y 배양 세포 그러나 분석 파라미터는 각각의 세포주에 대해 정의 될 것이다. 이것은 시간이 먼저 소비 될 수 있지만, 파라미터를 설정 한 후에,이 방법은 한 번에 전체 이미지 플레이트 자동화 될 수있다. 그들이 세포 수 (혈구 세포 이미 저) 또는 대사 활성 (발광 기반 분석)을 수단으로 시간에 걸쳐, 이러한 분석법 사실 증식 간접 측정 한 것이 중요하다. 이러한 방법은 쉽게 증식에 영향을 미칠 수있는 다른 중요한 인자를 측정하기 위해 수정 될 수있다. 예를 들면, 트립 판 블루 제외 방법을 쉽게 사균을 제외하고 따라서 세포 생존 (13)를 결정하는 혈구 세포 또는 이미 저 방법 중 하나에 포함될 수있다. 발광 기반 분석은 셀 상태에 대한 추가 정보를 제공하기 위하여 독성 분석을 다중화하고, 상기 분석 동안 측정 대사 활성은 또한 세포 viabi를 측정 할 수있다lity 12. 따라서 이러한 분석의 유연성은 각 방식의 강점은 추가적인 셀룰러 정보를 제공하기 위해 다른 분석에 함께 다중화한다. 이 프로토콜은 안정적 GFP 유전자를 함유 레고 IG2 - 순수하지 않아 + 벡터로 형질 도입 된 인간 유방암 세포주 MCF-7을 사용했다. 이 배양액에있는 색소 제를 추가 할 필요없이 이미지의 GFP 광학 필터 셀의 사용을 허용한다. 이 방법은 간단하거나 증식 마커와 세포를 라벨링하여, 어느 시야 광학계 방식을 사용하여 셀을 촬상하여 화상 GFP - 음성 세포 또는 일차 세포주로 변형 될 수있다. 이 프로토콜에 비해 방법은 다양한 세포주의 다양한 사용에 충분히 강력하지만 각각의 세포주에 대한 최적의 프로토콜 설정이 먼저 결정되어야한다. 밝은 필드 채널을 사용하여 세포의 이미징은 주요 가전에 가장 적합한 옵션을 나타냅니다LLS 또는 이에있어서의 장기 특성으로 느린 성장을 된 것. 이러한 발광 기반 분석 등 종점 분석법, 장기 세포 성장 분석에 적합하지 않는다. 이 프로토콜은 시험관 내에서 세포 증식을 측정하기위한 세 가지 방법을 설명 하였다. 각 방법은 통상적으로 세포의 성장을 측정하는 실험을 수행 할 수 있으며, 대부분의 실험실 방법 중 하나를 수행하기 위해 필요한 기술을 갖고있다. 그러나, 또한 분열하는 세포를 측정 사용할 수있는 다른 분석의 범위가 있습니다. 다음은 DNA 합성, 대사 활동을 측정하는 방법, 확산 또는 ATP 농도 (9)의 관련 항원을 포함 할 수있다. 예를 들어, 분석의 수는 3H 티미 딘으로 방사성 물질과 세포를 라벨에 의해 세포의 DNA 합성의 속도를 측정하기 위해 개발되었다. 이 방법의 단점은 방사성 물질 및 그 처분의 명백한 사용이다. 다른통상적으로 세포 증식을 측정하기 위해 사용되는 방법은 18 유세포 분석을 이용하여 측정 할 수있다 새로 형성된 DNA의 BrdU의 표지의 사용을 포함한다. 유동 세포 계측법 셀 번호뿐만 아니라 세포주기 정보 모두를 분석하는데 사용될 수있다. 그러나, 이것은이 방법의 단점은 사이토 흐름을 제공하고, 생성 된 데이터 (18)를 분석하기 위해 추가의 시간과 같이, 고가의 시약을 증가 사용자 훈련 능력을 포함 특정 실험에서 바람직한 결과 일 수있다. 따라서,이 세포의 성장을 평가 과학자 가능한 다양한 분석법이 있으며, 선택된 방법에 사용되는 세포 유형, 사용자 자신의 스킬 레벨, 실험의 엔드 포인트에서 요구되는 데이터의 유형에 크게 의존한다. 결론적으로, 세포 증식을 측정하는 방법은 세 가지 유방암 세포를 사용하여 비교 하였다. 각 방법은 많은 장점과 disadvantag이ES, 따라서 사용자 의존적 각 실험을위한 요구 사항에 기초하여, 셀 카운팅을 수행하는 최적의 분석 조건의 결정이다. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. 저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다. Discussion
Disclosures
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
References
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