이 프로토콜은 유방암 세포주에서 세포 증식을 분석하기 위한 세 가지 다른 방법의 사용을 설명합니다. 여기에는 기존 세포 계수, 발광 기반 세포 생존율 및 세포 이미저 사용을 통한 세포 계수의 사용이 포함됩니다. 각각은 세포 증식의 재현 가능한 측정에 이점을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
측정 셀 증식은 다양한 수준의 감도, 재현성 및 고처리량 포맷과의 호환성을 가진 다양한 방법으로 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 기존의 혈구계 계수 챔버, 생존 가능한 세포의 대사 활동 변화를 상대적인 세포 수의 척도로 활용하는 발광 기반 분석, 계수 알고리즘을 사용하여 세포 수를 측정하는 다중 모드 세포 이미저를 포함하여 체외에서 세포 증식을 측정하기 위한 세 가지 방법의 사용을 설명합니다. 각 방법은 시간, 비용 및 높은 처리량 호환성을 포함하여 세포 증식 측정에 대한 고유한 장점과 단점을 제시합니다. 이 프로토콜은 각 방법이 시간 경과에 따른 세포 증식을 정확하게 측정할 수 있으며 서로 다른 세포 밀도에서 성장을 감지하는 데 민감하다는 것을 보여줍니다. 또한 세포 영상 장치를 사용한 세포 증식을 측정하면 형태, 합류점과 같은 추가 정보를 제공할 수 있었고 시간 경과에 따른 세포 증식을 지속적으로 모니터링할 수 있었습니다. 결론적으로, 각 방법은 세포 증식을 측정할 수 있지만 선택한 방법은 사용자에 따라 다릅니다.
서론
종양 억제 유전자는 p53의는 세포주기 억류, 아폽토시스 및 노화 한 포함한 세포 프로세스의 개수의 필수 레귤레이터이다. 이는 게놈 안정성을 유지할 책임이 있으며, 따라서, 세포 사멸 및 세포 성장의 균형을 유지하는데 중요하다. p53의 돌연변이 암에서 흔히 조절되지 않은 암 세포 증식이 선도 p53의 불 활성화의 주요 원인이다. 흥미롭게도, p53의 돌연변이는 다른 메커니즘은 p53의 기능의 손실에 대해 책임이 있음을 시사 유방암 3의 약 25 %를 차지한다. 최근에 발견 된 p53의 이성체는 인간 암의 다수의 과발현되는 것으로 도시되어 있고, p53의 기능 4,5-를 변조 할 수있다. 우리는 p53의 이성체, Δ40p53는 유방암에서 가장 높은 발현 이성체가 있음을 이전에 도시 한 통상 인접 담배 마는에 비해 상당히 유방암 세포에서 상향 조절된다UE (6). 이것에 따라, 우리는 안정적 레고 IG2 - 순수하지 않아 + 벡터 (GFP의 +)를 이용하여 7 Δ40p53 과발현하는 인간 유방암 세포주 MCF-7 형질. 이들 세포는 높은 Δ40p53 식 유방암 세포에서 세포의 증식 속도가 증가하면 조사 하였다.
시....
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프로토콜
대량 살상 무기 확산 시험 법 1. 준비 세포
주 : 각각의 방법은 분석 될 수 있도록 동일한 포맷에 동일하게 종자의 두 세포주를 준비한다.
- 사용 T에 MCF-7 레고 및 MCF-7 Δ40p53 75 ㎠로 조직 배양 플라스크 75-80% 합류 7 세포 성장 페놀 레드없는 10 % 소 태아 혈청으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) (FBS) 200 mM의 L- 글루타민, 2 μg의 / ㎖ 인슐린, 5 % CO 2, 37 ℃에서 1 μg의 / ml의 퓨로 마이신. 멸균 바이오 안전성 캐비닛 클래스 II의 셀을 처리합니다.
참고 : 합류로 세포를 성장하는 데 걸리는 시간은 시드 희석에 따라 변한다. 확산 분석을위한 세포를 도금에 대비, 1에서 세포를 시드 : 보충 DMEM 3 희석 및 75~80%의 자랄 때까지 3 일 동안 정상적인 성장 조건에서 유지한다. - 에 미디어를 붓고, 플라스크에서 세포를 제거하려면폐기물 용기. 즉시 예열 배 트립신 2 ㎖의 세포 층을 세척한다. 기음 트립신. 5 % CO 2, 37 ℃에서 5 분 동안 항온 세포층과 장소에 미리 가온 된 트립신의 또이 용액을 추가한다.
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결과
배양 된 세포의 증식 - Δ40p53 MCF-7 세포를 형질 도입의 세포 증식을 측정하는 다른 방법을 연구하는 비 형질 MCF-7 레고 유방암 세포주와 비교 하였다. 비교 된 세 가지 방법 - 도식에 설명 된 분석 - 종래 방법 혈구 세포 생존력 발광 분석법 및 세포 이미징 (도 1). 각 방법의 장점은 정확하게 시간이 지남에 따라 셀 계수를 측정하는 단점을 가지고 있으며, 가장 효과적인 방법은 실험의 끝점 요구 및 세포 집단에 대해 획득 될 수있는 정보에 의존한다.
MCF-7 및 MCF-레고 -7- Δ40p53 세포의 성장은 4 일 동안 24 시간 후에 측정 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 두 개의 세포주는 세 가지 세포 밀도 (1.5 × 103로 접종 하였다
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토론
이 프로토콜에서 배양 된 세포에서 세포 증식을 측정하는 방법은 세 가지 조사 하였다. 각 방법은 96 시간 동안 세포 증식 재현하고 정확한 측정을 할 수 있었고, 그 결과 (도 2 및 3) 실험 방법 각간에 비교 하였다. 발광 기반 분석법 및 세포 영상 법은 모두 96 시간 후 세포 증식의 선형 증가를 나타내는 가장 강력한 결과를 생성 (도 2b, c). 또한, 시간이 지남에 따라 셀 이미징 형질 도입 및 비 - 형질 도입 된 세포주 (도 4) 사이의 성장 속도에 큰 차이를 도시하지 않는다.
이 많은 장점과 단점은,이 프로토콜에서 검사 각 방법위한 요약 표 5 참조. 혈구를 사용하는 종래의 전지의 계산 방법은 매우 적은 또는 부가적인 시약을 필요 effo 저비용 방법실온 준비하고 실행합니다. 또한,이 방법은 세포 / ㎖ <.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
transduction MCF-7-LeGO 세포주 개발에 도움을 주신 Hamish Campbell 박사와 Antony Braithwaite 교수님께 감사드립니다. Hunter Medical Research Institute를 통해 Bloomfield Group Foundation의 자금 지원에 감사드립니다. BCM은 뉴캐슬 대학교(University of Newcastle)의 APA 장학금과 헌터 의학 연구소(Hunter Medical Research Institute)의 MM 소여 장학금(MM Sawyer Scholarship)의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Dulbecco의 Modified Eagle Medium, 페놀-레드 없음 | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | 10% FBS, 200 mM L-글루타민, 2 µ 보충; g/ml 인슐린 및 1 µ g/ml 퓨로마이신 |
| L-글루타민 용액(100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| 인슐린 용액 인간 | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| 퓨로마이신 디하이드로클로 | 라이드 Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% 트립신-EDTA 용액(10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | DPBS |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| 조직 배양 플라스크, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, 평평한 바닥 | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer 혈구계 | BOECO 독일 | BOE 01 | |
| Olympus IX51 도립 현미경 | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 분석 | Promega | G9242 | 발광 기반 분석 |
| Cytation 3 세포 이미징 다중 모드 리더 | BioTek | 플레이트 리더 발광, 형광 및 명시야 세포 이미징 | |
| Gen5 데이터 분석 소프트웨어 | BioTek | GEN5 |
참고문헌
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008(2010).
- ....
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