Introduction
腫瘍抑制遺伝子は、p53は、細胞周期停止、アポトーシス及び老化1を含む細胞プロセスの多数の重要な調節因子です。これは、ゲノムの安定性を維持する責任があり、したがって、細胞死と細胞増殖のバランスを維持するために重要です。 p53の突然変異は、癌において一般的であり、制御されていない癌細胞の増殖を2につながるp53の不活性化の主な原因です。興味深いことに、p53の中の変異は、唯一の他のメカニズムがp53機能の喪失の原因であることを示唆し、乳癌3の約25％を占めています。最近発見されたp53のアイソフォームは、ヒト癌の多数において過剰発現されることが示されており、p53機能4,5を調節することができます。我々は、p53のアイソフォーム、Δ40p53は、乳癌において最も高度に発現されるアイソフォームであることが以前に示されており、正常な隣接TISSと比較した場合に有意に、乳癌細胞において上方制御されますUE 6。その後、我々は、安定レゴ-IG2-puroを+ベクターを用いΔ40p53（GFP +）の7を過剰発現するMCF-7ヒト乳癌細胞株を形質導入しました。これらの細胞は高いΔ40p53発現が乳癌細胞の細胞増殖率を増加させるかどうかを調べるために使用しました。
インビトロ 8,9 で培養した細胞の細胞増殖を測定する多くの直接的及び間接的な方法があります。これらは、時間の経過とともに連続測定として、またはエンドポイントアッセイ10のいずれかに行うことができます。従来の方法は、血球計数器を用いて細胞計数として、依然として有用です。このアッセイは、低コストと細胞数の直接の尺度であるが、それは数からの誤差と大きな標準偏差を最小にするために大規模な細胞数と高度に熟練した訓練に依存しません。ハイスループットフォーマットと互換性のある測定を行う必要がマルチウェルプレートアッセイの開発につながっています。これらの発光ベースアッセイmeasuセル11,12の代謝活性に比例する発光シグナルに基づいて、細胞数の再。より最近では、高含量のイメージングプラットフォームの導入は、定量的及び定性的な表現型データ収集を提供しつつ、細胞増殖をモニターする新しいツールを許可し、システム13の様々な含まれています。これらの方法の全ては、連続測定またはエンドポイントアッセイのいずれかによって、細胞増殖を測定するための手段を提供し、それぞれの感度、サンプル番号のスループット、およびセル情報に関して利点と欠点の範囲を有し、によって適宜計量することができるすべてが研究の質問に。
このプロトコルは、それぞれの方法は、感度、再現性、およびマルチウェルプレートフォーマットの異なる範囲を用いて、in vitroで細胞増殖を測定するための3つの異なる方法を記載しています。このプロトコルは、茶をカウント血球計数器の使用を比較することを目的としましたmber、96時間の時間経過にわたって細胞増殖の測定における発光に基づく細胞生存率アッセイ、および細胞イメージャ。これを行うには、ベクター形質導入細胞（MCF-7-LEGO）の成長は、3つの異なる細胞密度を使用して、Δ40p53（MCF-7-Δ40p53）を過剰発現するように形質導入された細胞と比較しました。細胞増殖は、最大96時間ごとに24時間測定しました。それぞれの方法は、それ自身の利点と欠点を有することが見出され、実験の目的に応じて、各々が依然として増殖の速度についての情報を提供するための有益な方法で行いました。
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Protocol
増殖アッセイのために1.準備細胞
注：各メソッドを分析するために同じ形式で同じ方法及び種子中の2つの細胞株を準備します。
- 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したフェノールレッドフリーのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いてT 75cm 2の組織培養フラスコ中で75％〜80％コンフルエンスに7個の細胞を、MCF-7、レゴとMCF-7Δ40p53成長、200 mMのL-グルタミン、2 / mlのインスリン、5％CO 2で37℃を1μg/ mlのピューロマイシン。滅菌安全キャビネットクラスIIで細胞を処理します。
注：これは、コンフルエンスまで細胞を増殖するのにかかる時間は、播種希釈によって異なり。増殖アッセイのために細胞をプレーティングするための準備では、1で細胞を播種する：補充したDMEM中で3希釈し、75から80までパーセントの集密度になるまで3日間、通常の増殖条件下で維持します。 - メディアを捨てる、フラスコから細胞を除去するために、廃棄物容器。直ちに予熱2×トリプシン2mlの細胞層を洗浄します。吸引し、トリプシン。 5％CO 2で37℃で5分間インキュベーター中に細胞層及び場所に予め温めておいたトリプシンのさらに2 mlを加え。
- 細胞がデタッチしたら、新鮮な補充DMEMを温め10ミリリットルで細胞を洗浄。室温で5分間、491×gでの滅菌15mlチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を転送します。慎重に吸引し、上清を廃棄。
- 新鮮な補充したDMEM 5 mlに細胞ペレットを再懸濁します。 96ウェルプレートに細胞を播種するために適切な濃度を決定するために、細胞計数を行います。
- 900μlの1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中100μlの細胞懸濁液を希釈します。自動セルカウンターの上に新しい60μmのセンサーを配置します。プランジャーを押しながら、希釈した細胞懸濁液にセンサーを沈めます。ゆっくりセルカウンターでプランジャーを解放します。細胞COUからセンサーを削除しますNTER完了したとき。
注：細胞数は、細胞/ mlで細胞計数器に表示されます。
- 900μlの1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中100μlの細胞懸濁液を希釈します。自動セルカウンターの上に新しい60μmのセンサーを配置します。プランジャーを押しながら、希釈した細胞懸濁液にセンサーを沈めます。ゆっくりセルカウンターでプランジャーを解放します。細胞COUからセンサーを削除しますNTER完了したとき。
- 3~5日間にわたって増殖の細胞増殖および測定のための余地を可能にするため〜20％コンフルエントで96ウェルプレート中（DMEM中）を100μlの最終容量で種子細胞（ 表1参照）。三連ですべての細胞株をシード。
注記：この実験では、三つの異なる細胞密度は、最適な細胞密度を決定するために評価しました。必要な細胞数を表1に要約されている。種子細胞を低密度で、より長期的な成長の測定が必要な場合。- 血球計数器と発光ベースアッセイのために、（ すなわち、アッセイあたり4プレート）の時点ごとに一つのプレートを準備します。細胞イメージャアッセイのために、実験期間中のみ1のプレートを準備します。
- 24時間、5％CO 2で37℃で細胞を維持します。
2.決定セルはおカウント血球計数器をる
- 前加温培地および細胞培養インキュベーター、オーブンもしくは水浴中で37℃でトリプシン両方。廃棄物容器への細胞から培地を吸引は、2倍のトリプシン30μlの1回洗浄し、トリプシンを吸引します。
- 2倍のトリプシン30μlので再び細胞を洗浄し、37℃で5分間インキュベートします。静かにプレートから細胞を取り除くために、プレートの端をタップします。補充したDMEMの50μlを添加し、細胞を単一細胞懸濁液を形成するまで、ピペッティングにより細胞を混ぜます。
- 70％エタノールで表面とガラスカバーを洗浄することにより、血球計数器を準備します。
- 計数室の上にガラスカバースリップを置き、「ニュートンの屈折リングは「カバースリップエッジと血球計数器との間で見ることができるようになるまで貼ります。
注：これらは、カバースリップが正しく血球計数器に付着したことを示しています。 - ゆっくり毛管運動によって計数室を埋め、カバースリップの下での細胞懸濁液20μLをピペット。顕微鏡の10倍の倍率で血球計数器を置き、グリッドレイアウト内の計数室を可視化します。
- グリッドレイアウトの4外側の正方形のセルをカウントします。精度を向上させるために、付加的な外側の正方形の反復回数が必要、またはカウントまで70に達した場合- 100セル14,15。
- 次のように1ml当たり細胞濃度を計算します。正方形のx希釈倍率ごとの平均細胞数（使用する場合）10 4を xは
- 繰り返しは、2.1から2.8まで24時間毎に96時間、播種後の手順。
3.発光ベースのアッセイを用いて細胞増殖を決定します
注：これは、エンドポイントの測定です。試薬が細胞に添加されると、プレートは一度だけ定量することができます。
- 30分間22℃の水浴中で解凍発光試薬。
- 静かに均質な混合を得るために、ボトルを反転させることにより、試薬を混ぜます。
- ステップから（播種した細胞の一方のプレートを平衡化1.5）で30分間室温で。
- 各ウェルに発光試薬を100μlを追加します。 2分間オービタルシェーカー上のコンテンツを混ぜます。プレートを室温で10分間インキュベートすることができます。
- マルチモードプレートリーダーソフトウェアを使用して発光実験を設定します。
- マルチモードプレートリーダーをオンにして、ソフトウェアを開きます。 「タスクマネージャ」で、「実験」を選択し、ファイル 'new'.Select作成' '側のツールバーからを、そして下の「プロトコル手順を' 'タブを選択」。
- 「グルニエ96平底「プレートのタイプを選択し、「使用のふた」チェックボックスをオンにします。 「読み取り方法]ボックスの下の「読み取り」アクションを選択します。 「ルミネセンス」検出方法を選択します。 「OK」をクリックします。
- 読み出しステップ]ボックスで、「完全版」タブでスキャンする井戸を選択して、などのブランクウェルとして作用することが井戸を選択します。
- （：穴、ミラー：なし例えば 、プラグ、エム）空のフィルタに設定されたフィルタを設定します。にゲインを設定します135、ウェル当たり0.5秒の積分時間6.5ミリのリード高さを有します。発光読み取りのための設定を保存し、「OK」をクリックします。
- 発光読み取りを実行します
- 「計測器制御」タブを選択することにより、プレートホルダーを取り出し、「蓋を確保する上で、プレートホルダーに96ウェルプレートをout'.Placeプレートをクリックしてください。 「計測器制御]タブの[内プレート」をクリックすることで、プレートホルダーを閉じます。発光読み取りを実行するには、ツールバーから「今すぐ読み」をクリックします。
- よくさらなる分析のためにスプレッドシートにそれぞれの相対発光単位（RLU）の測定値をエクスポートします。
- 繰り返しは、細胞を播種した後、増殖を96時間に24時間毎の最大を記録するために3.1から3.6を繰り返します。
4.セルイメージャーを用いて細胞数を決定します
- マルチモードセルイメージャー・ソフトウェアを用いた細胞イメージング実験のセットアップ
- マルチモードセルイメージャとオープン番目をオンにします電子ソフトウェア。
- 「タスクマネージャ」で、「実験」タブを選択し、ファイル 'new'.Onを作成する' 'ツールバー、をクリックして「プロトコル」タブを開いて「プロシージャ' tab.Select「設定温度」アクション。 「ON」にインキュベーターを設定し、37℃に温度を設定し、次のステップ」のボックスを続行する前に、「予熱」を確認してください。設定を保存するには、「OK」をクリックします。
- 「読み取り」アクションを選択します。 「画像」検出方法をクリックして「エンドポイント/運動「読み取りタイプと「フィルタ」の光学系のタイプを選択します。フルプレート]タブ」をOK'.Click」をクリックして、画像化されるプレート上のウェルを選択します。設定を保存するには、「OK」をクリックします。
- 「目標」オプションのドロップダウンから2.5倍の対物レンズを選択します。 GFP 469、525及びブライトフィールド：「チャンネル」タブで、2つのチャネルを選択します。両方のチャネルは 'auto'で露出を確認し、十分に自動露出を選択します。
- AUTを決定するために、Oフォーカスの設定は、「オートフォーカス」を選択し、「オプション」をクリックします。オートフォーカスのオプションについては、「スキャンした後、オートフォーカス」メソッドを選択します。設定を保存するには、「OK」をクリックします。
- 水平方向の間隔（μm）で= 2881および垂直方向の間隔（μm）と= 2127で、3×2モンタージュにウェル当たり複数の画像をスキャンする0.Selectするウェル（ミクロン）の中心から水平および垂直方向のオフセットを設定します。手順の設定を保存するには、「OK」をクリックします。
注：読み取りパラメータについては、 表2を参照してください。
- 選択されたプレート上で読むの実験を行います
- 「機器制御」タブをクリックして、蓋がオンになっている確保し、プレートホルダーでfunction.Place 96ウェルプレートを「プレートアウト」を選択します。 「計測器制御]タブで、関数 'でプレート」を選択します。選択プレートタブから「今読んで」。 96時間後に播種し24時間毎のアップを読んで繰り返します。
- 用いた細胞数の分析セルイメージャソフトウェア。
- 画像を分析するために、画像形成されたプレート上で「データ」タブをクリックし、選択し "画像[GFP 469、525 +明視野] '。よく撮像された上でダブルクリックします。
- ロードされた画像をクリックしてください。選択して「分析」と分析するモンタージュの単一のイメージを選択します。 GFP「OK'.Check「クリック」だけチャネル、および表3に概説のように設定したパラメータを。クリックして「画像化された細胞にパラメータを適用するには、START 'を。
- 画像あたりの細胞数を決定するために使用される画像化された細胞上に置か細胞計数マスクを観察します。 「変更を適用」と実験を通して撮像された各プレートのために、これらの設定を維持する]をクリックします。
- いったん戻って画像形成されたプレートで、「データ」のドロップダウンメニューを選択し「細胞数」をクリックします。これは、ウェル当たりの総細胞数を生成します。
- さらなる分析のoには、「エクスポート」タブをクリックすることにより、スプレッドシートにすべてのデータをエクスポートします。ウェル当たり細胞数F。
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Representative Results
培養された細胞の増殖を測定する別の方法を研究するために、MCF-7Δ40p53形質導入細胞の細胞増殖は、非形質MCF-7レゴ乳癌細胞株と比較しました。比較された三つの方法-従来の血球計数法、細胞生存率発光アッセイ、及び概略図（ 図1）に概説されている解析-細胞イメージング。それぞれの方法にも長所と短所が正確に時間をかけて細胞計数を測定することがあり、最も効果的な方法は、実験や細胞集団のために取得できる情報のエンドポイントの要件に依存します。
MCF-7-LEGOおよびMCF-7-Δ40p53細胞の増殖を、4日間24時間後に測定しました。 図1に示すように 、2つの細胞株は、3つの異なる細胞密度で播種した（1.5×10 3 3。 5×10 3細胞/ウェル）、細胞計数を、播種後24、48、72及び96時間行いました。それぞれの方法は、96時間にわたって（それぞれ、 図2a、b及びc）血球計、発光ベースのアッセイ、および細胞イメージャを使用して、細胞増殖の増加を示しました。細胞増殖の最大の増加は、最も高い細胞密度（5×10 3細胞）で見られ、また、これは、これらの細胞における増殖を測定するための最適な細胞密度であることを示唆し、各時点での最も再現性のある結果を示しました。細胞株との間の細胞増殖の有意な差はなかったです。
異なる方法の間で細胞増殖の測定は、線形回帰分析6（;表4、図3）によって比較しました。 Cを比較したときにテストの異なる方法のそれぞれとの間に有意な相関があったが、両方の細胞株における細胞密度の全くエル増殖（ 図3a及びb）。最も強い相関が発光ベースのアッセイの比較、および細胞イメージャとの間に観察された（R 2 = 0.8899、P≤0.0001; R 2 = 0.9805、P≤0.0001、それぞれ図3a及びb）。
細胞イメージャーを用いた細胞増殖の視覚的な表現は、（ 図4）に示されています。この方法は、単板の継続的な測定値を使用するため、細胞が100％コンフルエンスに近くに達するまで、細胞は24時間毎に画像化することができます。 図2に示されるように 、MCF-7、レゴとMCF-7Δ40p53細胞の増殖率は、全てのタイムポイントで同等でした。この方法は、視覚的に複数日にわたって細胞の成長を監視することができるなどの有用な細胞情報を提供し、細胞サイズおよび細胞モルフォ比較異なる細胞株の間ででれっと。
図1： 細胞増殖を測定する3つの異なる方法の概略図で細胞を複数の96ウェルプレートに三つの異なる細胞密度で播種し、最大96時間、5％CO 2で37℃でインキュベートしました。 24時間ごとに、細胞増殖は、血球計数器、発光ベースのアッセイまたは細胞イメージングを使用してのいずれかで測定した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 細胞増殖の測定細胞数は、MCF-7-戦で96時間、24時間毎に測定した96時間後。OおよびMCF-7-Δ40p53細胞は、3つの異なる細胞密度で播種しました。細胞数は（b）の細胞/画像内の細胞イメージャーを使用して連続的な細胞数発光ベースの相対発光単位（RLU）でのアッセイ、又は（c）を用いて、細胞/ mlで（a）は血球計を用いて測定しました。セルイメージャーの条件は±SDを、すべての実験は、3つの独立した実験の平均を表す表2に示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 乳癌細胞株における細胞増殖を測定する3つの異なる方法の比較線形回帰分析は、異なるmとの相関関係を比較するために行きました。 ethods（a）は、MCF-7レゴセルと、（b）MCF-7-Δ40p53細胞における細胞増殖を測定するために調べました。ピアソンの相関係数を計算し、有意性は、細胞増殖を測定する別の方法との間（p <0.05）を決定しました。すべての結果は、3つの独立した実験の平均±SDを示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：GFP 陽性MCF-7-LEGOおよびMCF-7-Δ40p53乳癌細胞の画像セルイメージャごとに24時間を使用して撮影し、5×10 3播種した細胞からの細胞の代表的な画像。。スケールバーは千μmで表します。細胞イメージングのためのパラメータを表2にまとめます。 href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 細胞密度（細胞/ウェル） | |||
| 細胞型 | 1.5×10 3 | 3.0×10 3 | 5×10 3 |
| MCF-7-LEGO | 8.4ミリリットルのメディアで76μlの | 8.3ミリリットルのメディアで152μlの | 8.2ミリリットルのメディアで254μlの |
| MCF-7-Δ40p53 | 8.4ミリリットルのメディアで93μlの | 8.3ミリリットルのメディアで185μlの | 8.2ミリリットルのメディアで308μlの |
表1：96 ウェルプレートのための細胞播種のボリューム。
「FO：キープで-next.within-ページ= "常に">表2：セルイメージャーを用いた細胞イメージングのために読むのパラメータ。
| 撮像パラメータ | ||||
| しきい値 | 5000 | |||
| 最小オブジェクトサイズ（ミクロン） | 30 | |||
| 最大オブジェクトサイズ（ミクロン） | 300 | |||
| MCF-7-LEGO | ||
| R広場 | p値 | |
| 発光ベースアッセイ対血球計数器 | 0.6301 | 0.0021 |
| 血球計数器対細胞イメージャ | 0.7524 | 0.0003 |
| セルイメージャー対発光ベースのアッセイ | 0.8899 | <0.0001 |
| MCF-7-Δ40p53 | ||
| R広場 | p値 | |
| LU 対血球計数器minescenceベースのアッセイ | 0.8983 | <0.0001 |
| 血球計数器対細胞イメージャ | 0.9303 | <0.0001 |
| セルイメージャー対発光ベースのアッセイ | 0.9805 | <0.0001 |
表4：試験した3つの異なる増殖方法の線形回帰分析。
| 方法 | メリット | デメリット | テクニカルノート | 最終出力 |
| 血球計 | 低価格 | ハイヒューマンエラー | 単一細胞懸濁液を調製するために複数回のピペット | 細胞/ mlの |
| 最小限の機器が必要です | 単一細胞懸濁液が必要です | 精度を達成するために、複数のカウントを行います | ||
| 直接細胞計数 | 細胞数を正確に評価するために必要な細胞の数が多いです | |||
| 終点 | ||||
| 発光ベースアッセイ | マルチウェルプレートフォーマットを使用します | 高価な試薬 | 光から保護します | 相対発光単位（RLU）/ウェル |
| 実行が簡単 | 発光プレートリーダーが必要です | バックグラウンド発光を決定するための対照ウェルを含みます | ||
| 高速分析 | 温度感受性 | |||
| 細胞生存率の情報を提供します | 細胞の代謝活性に依存して可変 | |||
| 間接測定 | ||||
| 終点 | ||||
| 細胞イメージャ | 連続測定 | 高価なイメージャ | 確保細胞イメージャを37℃に設定されています | 細胞/画像 |
| 温度管理 | 集中的なスキル | 細胞の不要な振とうまたは混乱を避けます | ||
| 細胞情報を提供します | 細胞の合流点に応じて可変 | |||
| 費用対効果の高い（あなたはイメージャを持っている場合） | 相対数 | |||
| 直接測定 | ||||
| マルチウェルプレートフォーマットの自動イメージング |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. このプロトコルでは、培養細胞における細胞増殖を測定する3つの異なる方法を検討しました。それぞれの方法は、96時間にわたる細胞増殖の再現性と正確な測定が可能であった、その結果は（ 図2及び3）試験方法の各々の間で同等でした。発光ベースのアッセイ及び細胞イメージング法の両方が、96時間後の細胞増殖の線形増加を示し、最も堅牢な結果が得られた（ 図2B、C）。さらに、経時細胞イメージングは、形質導入および非形質導入細胞株（ 図4）との間の成長率に有意差を示しませんでした。 多くの利点と欠点は、このプロトコルで調べ、それぞれの方法のためにありますが、概要については、 表5を参照してください。血球計数器を用いた従来の細胞計数法は非常に少ない追加の試薬またはeffoを必要とする低コストの方法でありますrtが準備して実行します。さらに、この方法は、細胞/ mlで14における絶対細胞数を定量します。しかし、カウントの間に大きな標準偏差をもたらす細胞計数、高いエラー率の性質を消費する時間、および細胞数の高い範囲が正確な細胞計数のために必要であるという事実を含む重大な欠点があります。これは、血球計数器を用いて細胞計数は、後の時点で、低細胞密度における変数の結果、大きな標準偏差を示した図2aに見られます。これらの欠点は、この方法は、小さなサンプルサイズの細胞計数のために有用な、より小さなプレートサイズと播種密度が要求される、より大きな高スループットの測定には不十分で行います。細胞密度が計数した細胞の最小数が100以上のセルのしきい値で始まったように、増加した場合、これらの制限を緩和することができました。多くの細胞懸濁液を希釈し、又はセルDを下げますensity未満、100細胞を計数し、したがって、複製15間の変動を増大させる大きなチャンス。しかし、この方法は、96ウェルプレートに適さない低い細胞表面積に起因し、従って、分析に使用することができる細胞の数が不十分です。これは、この方法の高スループット能力の欠如と、この機能を必要とするユーザーのための明確な欠点を強調しています。 発光ベースのアッセイは、代謝活性のある細胞16の存在の指標であるATPの量を測定することによって細胞生存率を決定します。このアッセイは、細胞増殖を決定するために、96ウェルプレート形式で複数の試料のハイスループットスクリーニングのために設計されています。この単純な方法は、代謝的に活性な細胞中のATPの存在に比例したプレートリーダーを使用して、相対発光単位（RLU）として細胞増殖を定量します。しかし、この方法の主な欠点は、Tであります彼は、試薬のコスト、および細胞の代謝活性の測定の依存性。例えば、温度または細胞周期時点のような種々の細胞培養条件は、容易にアッセイ17によって生成された発光シグナルに正比例する細胞によって産生されるATPの量に影響を与えることができます。したがって、経験的実験の条件は、細胞の代謝活性を妨害し、潜在的に細胞によって生成された相対発光シグナルを妨害しないことを決定することが重要です。 細胞増殖を決定するための検討第3の方法は、相対的な細胞数を実行するための生細胞イメージャとソフトウェアました。アッセイの期間にわたって同じセルを使用して、温度制御と共に、リアルタイムで、ウェルごとに複数の画像を捕捉するために自動化することができるように、細胞イメージャーは、ハイスループット能力を有しています。 図4に示されるように 、細胞増殖をmとすることができます細胞計数分析と共に細胞集団に関する追加情報を提供することができ、時間の経過とともに同じプレートにonitored。これは、96ウェルプレートフォーマットで一般的であるクロスプレートの変動および細胞播種誤差を排除して非常に有利です。細胞イメージャに付随するソフトウェアは、 表2および3に概説されたパラメータを使用して、細胞数の定量化を可能にします。これは、ハイスループット設定において有用であると容易にそのようなアポトーシスまたは細胞毒性などの細胞機能を測定する他のアッセイに多重化することができます。システムの主な欠点は、タッチオブジェクトを分割する能力が制限されているソフトウェアです。それが下の合流細胞内でこの機能を実行することができますが、それはアッセイの主要な制限であるため、細胞型特異的な最適化を必要とします。イメージャーを使用して、個々の実験は、非常に低コスト板バイプレートスケールでありながらも、この方法は、上の希望機器がすでに実験室で設定されている場合lyが費用効果的で。したがって、これは、高スループット分析のために、この方法は、適切な製造、培養細胞の細胞増殖を測定するための新規な方法を提供し、追加の試薬を必要としないという大きな利点を有し、そして96ウェルプレートの自動計数することが可能です。これは、従来の血球計数器細胞計数法上の重要な改善であり、発光ベースのアッセイと、より費用対効果の高いオプションです。 セルイメージャーを使用しての重要なステップは、撮影した画像や画像ごとに、その後の細胞数の分析の間です。これらの画像は、細胞イメージングプラットフォームの数を使用して処理することができます。調査中の細胞型のための最も適切なソフトウェアを判断することが最も重要です。異なる画像化ソフトウェアを使用して細胞イメージャによって取得された画像から細胞数を検証するのに有用であろう。このプロトコルは、に適用することができますY培養細胞は、しかし、分析パラメータは、各細胞株のために定義されなければなりません。これは、時間最初にかかる可能性があるが、パラメータが設定された後、この方法は、一度に画像全体のプレートに自動化することができます。 細胞数（血球計、細胞イメージャ）、または代謝活性（発光ベースのアッセイ）を測定するように時間をかけて、これらのアッセイは、実際には増殖の間接的な尺度であることに留意することが重要です。これらの方法は、容易に増殖に影響を与えることができる他の重要な要因を測定するために修正することができます。例えば、トリパンブルー排除法を容易に死細胞を排除し、したがって、細胞生存度13を決定するために、血球計または細胞撮像方法のいずれかに組み込むことができます。発光ベースのアッセイは、細胞の健康状態に関する追加情報を提供するために、細胞毒性アッセイと多重化することができ、このアッセイ中に測定された代謝活性は、細胞viabiの測定値でありますリティ12。したがって、追加の細胞の情報を提供するために、他のアッセイと多重化されるこれらのアッセイの柔軟性は、これらの方法のそれぞれの強力な利点です。 このプロトコルは安定にGFP遺伝子を含むLEGO-IG2-puroを+ベクターで形質導入されているヒト乳癌細胞株MCF-7を使用しました。これは、培養培地中に任意の色素剤を添加することなく、画像のGFP光学フィルタ細胞の使用を可能にします。この方法は、容易に、または増殖マーカーで細胞を標識することにより、いずれかの明視野光学型を用いて細胞を撮像して画像GFP陰性細胞あるいは初代細胞株に変更することができます。このプロトコルで比較方法は、異なる細胞株の広範囲で使用するのに十分強固なしかしながら、各個々の細胞株についての最適なプロトコル設定が最初に決定されるべきです。明視野チャネルを用いた細胞のイメージングは、一次CEに最適なオプションを表しこの方法の長期的な性質によりLLSまたは遅い成長しているもの、。このような発光ベースのアッセイのようなエンドポイントアッセイは、長期的な細胞増殖の分析に適していません。 このプロトコルは、 インビトロでの細胞増殖を測定するための3つの異なる方法を説明しました。それぞれの方法は、日常的に、細胞増殖を測定するために実験室で行うことができ、ほとんどの研究室では、これらのいずれかの方法を実行するために必要なスキルを持つであろう。しかしながら、分裂細胞を測定するために利用可能な他のアッセイ範囲が存在します。これらは、DNA合成、代謝活性を測定する方法、増殖またはATP濃度9の関連抗原を含むことができます。例えば、多数のアッセイは、3 H-チミジンなどの放射性物質で細胞を標識することにより、細胞のDNA合成の速度を測定するために開発されてきました。この方法の欠点は、放射性物質、及びそれらの処分の明らかな使用です。他の日常的に、細胞増殖を測定するために使用される方法は、18フローサイトメトリーを用いて測定することができる新たに形成されたDNAのBrdU標識の使用を含みます。フローサイトメトリー、細胞数、並びに細胞周期情報の両方を分析するために使用することができます。しかし、これは、この方法の欠点は、フローサイトメーターを操作し、得られたデータ18を分析するために追加の時間やステップ、高価な試薬および増加したユーザーに訓練された技術を含む、特定の実験のために有利な結果かもしれません。したがって、そこに細胞の増殖を評価するために、科学者が利用可能な多数の異なるアッセイがあり、選択された方法は、使用する細胞の種類、ユーザ及びそれらのスキルレベル、および実験のエンドポイントで必要なデータの種類に大きく依存します。 結論として、細胞増殖を測定する3つの異なる方法が、乳癌細胞を用いて比較しました。それぞれの方法には多くの利点とdisadvantagを持っていますESので、ユーザに依存し、各実験のために、それらの要件に基づいて、細胞計数を行うために最も適切なアッセイを決定する点です。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. 著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。 Discussion
Disclosures
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
References
- Lane, D. P.
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
- Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
- Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
- Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
- Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Cell Biology. Celis, J. E. , Third Edition, Academic Press. 25-31 (2006).
- Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
- Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , http://au.promega.com/resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells (2014).
- CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/celltiterglo%202%200%20assay%20protocol.pdf (2015).
- Banks, P., Brescia, P. J. Application Guide: Automated Digital Microscopy. , http://www.biotek.com/resources/articles/automated-digital-microscopy.html (2015).
- Bastidas, O. Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php (2016).
- Bastidas, O. Technical Note: Cell Count for Low Concentration Samples . , http://www.celeromics.com/en/resources/docs/Articles/Low-concentration-cell-counting.pdf (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., et al. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H., et al. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/ (2013).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf 1-12 (2011).
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癌生物学、発行115、分子生物学、細胞増殖、乳癌細胞イメージング、癌生物学、細胞計数 View Video
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