Abstract
Affinity rensing tilnærminger har vært vellykket i å isolere innfødte komplekser for proteomikk karakterisering. Strukturell heterogenitet og en grad av komposisjons heterogenitet av et komplekst vanligvis ikke til hinder for framgang i å gjennomføre slike studier. I motsetning til dette, bør en kompleks beregnet for strukturell karakterisering renses i en tilstand som er både sammensetningsmessig og strukturelt homogent, så vel som ved en høyere konsentrasjon enn nødvendig for proteomikk. Nylig har det vært betydelige fremskritt i anvendelsen av elektronmikroskopi for strukturbestemmelse av store makromolekylære komplekser. Dette har økt interessen for tilnærminger for å rense innfødte komplekser av tilstrekkelig kvalitet og kvantitet for strukturbestemmelse ved elektronmikroskopi. The Tandem Affinity Rensing (TAP) metoden har blitt optimalisert for å trekke ut og rense en 18-subenhet, ~ 0,8 MDA ribonucleoprotein enheten fra spirende gjær (Saccharomyces cerevisiae)
Introduction
Mange store cellulære prosesser blir utført av store protein og protein-RNA komplekser 1. En vesentlig flaskehals for å drive biofysiske og strukturelle studier av slike komplekser er å skaffe dem av et egnet kvalitet (dvs. homogenitet) og i en passende konsentrasjon. Isolere et kompleks fra en innfødt kilde har mange fordeler, blant annet å holde relevante post-transkripsjon og / eller translasjonsforskning modifikasjoner av underenheter og sikrer riktig sammensatt forsamling. Men store cellekomplekser er ofte tilstede i en celle på et lavt kopiantall og rensing må være svært effektiv og forekomme i henhold til i nærheten av fysiologiske betingelser for å sikre at komplekset integritet opprettholdes. Rensing av et kompleks fra en eukaryot kilde er spesielt utfordrende og kan være økonomisk uoverkommelige. Dermed er strategier eller metoder som er effektive og gi et homogent kompleks svært ønsket.
En strategi som har værtvellykket i å rense innfødte komplekser fra eukaryote celler for deres første karakterisering er den Tandem Affinity Rensing (TAP) -metoden 2,3. TAP-metoden ble opprinnelig utviklet for å rense et nativt protein fra den spirende gjær (S. cerevisiae) i kompleks med samspill faktor (e) 2. TAP-metoden benyttes to koder, hver tag smeltet sammen til samme proteinkodende gensekvens. Merkene ble valgt slik at den balanserer et behov for stram og selektiv binding til en affinitet harpiks med et ønske om å opprettholde nær fysiologiske løsnings betingelser. Denne balansen tjener til å opprettholde stabil interaksjon (e) av den merkede protein med samspill faktor (er) for etterrensing karakterisering. Den genomisk innlemmet TAP-tag ble plassert ved enden (C-terminale) av et protein-kodende gen og besto av en sekvens som koder for et Calmodulin Binding peptid (CBP) etterfulgt av Protein A - en tilsetning av i overkant av 20 kDa til den merkede protein. CBP er kort, 26 aminosyrer, og som gjenkjennes av ~ 17 kDa-proteinet Calmodulin (CaM) i nærvær av kalsium med en K D i størrelsesorden av 10 -9 M 4. Protein En kode er større, som består av to rapporter av 58 rester med en kort linker mellom gjentakelser. Hver 58 aminosyre repeat er anerkjent av immunglobulin G (IgG) med en K D ~ 10 -8 M 5. Mellom disse to kodene ble innlemmet et gjenkjenningssete for TEV protease, en endopeptidase fra Tobacco Etch Virus 6,7. Som illustrert i figur 1, i den første affinitet trinn i fremgangsmåten TAP-merkede proteinet er bundet til et IgG-harpiks via protein A. Det merkede proteinet blir eluert ved på kolonne spaltning ved tilsetning av TEV protease, sete-spesifikt spalte mellom de to koder. Dette er et nødvendig skritt som samspillet mellom IgG og Protein A er svært sterk og kan bare være tilstrekkelig opprørt etter denaturerende løsnings forhold. Mangler en Protein A-koden, blir proteinet bundet til CaM harpiks i nærvær av kalsium og eluert fra denne harpiks med tilsetning av metallionet chelateringsmidlet EGTA (etylenglykol-tetraeddiksyre) (figur 1).
Kort tid etter innføringen av TAP-metoden, ble det brukt i en stor undersøkelse for å generere et "kart" av komplekse interaksjoner i S. cerevisiae 8. Viktigere, som en konsekvens av dette arbeidet en hel gjær-TAP Tagged åpen leseramme (ORF) bibliotek samt enkelte TAP tagget ORF 9 er tilgjengelige fra en kommersiell kilde. Dermed kan man oppnå en hvilken som helst gjærstamme med et kodet protein for en hvilken som helst gjær-komplekset. TAP metoden også ansporet modifikasjoner eller variasjoner av TAP tag, inkludert: bruk for rensing av komplekser fra andre eukaryote samt bakterielle celler 10,11; utformingen av en "split tag", karakterisert ved at protein A og CBP er plassert på forskjellige proteiner 12; og tags endret, for derved å imøtekomme behovet for undersøkeren, som for eksempel følsomhet av komplekset til Ca2 + eller EGTA 13.
Nylige fremskritt innen både instrumentering og metodikk har ført til betydelige fremskritt i bruk av elektronmikroskopi (EM) for strukturbestemmelse, som har ført til høy, nær atom oppløsning av makromolekylære komplekser 14. Oppløsningen kan fremskaffes av et kompleks av EM forblir imidlertid betinget av at kvaliteten av komplekset under studien. Denne studien har benyttet TAP tag tilnærming for å rense fra S. cerevisiae U1 snRNP, en 18-subenhet (~ 0,8 MDA) lav kopiantall ribonucleoprotein kompleks som er en del av spliceosome 15,16. Et antall skritt er tatt for å rense dette komplekset slik at det er homogent og av en tilstrekkelig konsentrasjon. Potensielle problemer som oppstår på ulike stadier av rensingen er beskrevet og tatt strategier for å overvinne challEnges uthevet. Ved å nøye vurdere og optimalisere trinn i rensingen, U1 snRNP renset er av en kvalitet og til en mengde som passer for negative flekken og elektron kryo mikroskopi (cryo-EM) undersøkelser. En optimalisert TAP fremgangsmåte protokoll for rensing av innfødte komplekser for strukturelle studier er beskrevet heri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Den følgende protokoll ble utviklet for rensing av et kompleks fra 4 L fra cellekultur, ca. 40 g våtvekt av celler. Etter tilberedning bør alle buffere lagres ved 4 ° C og anvendt innen en måned etter deres fremstilling. Reduksjonsmiddel og proteasehemmere er bare lagt til buffere like før bruk.
1. Utarbeidelse av Whole Cell Extract for Tandem Affinity Rensing
- Vekst av S. cerevisiae Cells
- Streak ønsket TAP tagget S. cerevisiae stamme fra lagring (-80 ° C) på en gjær pepton dekstrose (YPD) plate. Inkuber i 3 - 5 dager (30 ° C), inntil gjærceller vises hvitt og luftig.
- Inokulere en strek på ca. 2 mm to av de friske celler fra platen inn i 10 ml YPD media i en 50 ml konisk polypropylen sentrifugerør. Rist røret ved 180 omdreininger per minutt (rpm) over natten (30m ° C).
- Vaksinere 2 ml overnatt kultur per liter YPD-medier i en 2 liters Erlenmeyer eller konisk kolbe. Rist ved 180 rpm (30 ° C). Overvåke cellevekst ved en optisk tetthet på 600 nm (OD 600) til sen logfase, OD 600 på 1,8 til 2, typisk 20-24 timer.
- Høsting S. cerevisiae Cells
- Høste cellene ved sentrifugering ved 5400 xg i 15 minutter (4 ° C).
- Raskt dekanter supernatanten og holde cellene ved 4 ° C eller på is.
- Suspender hver liter av cellepelleten med 2 ml kjølt lysebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 300 mM NaCl; 10 mM KCI, 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM imidazol, pH 8,0, 10% glyserol; 0,1% v / v NP-40). Suspendere celler ved å svinge og / eller gjentatt pipettering ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette.
Merk: Betydningen av NP-40 som det gjelder komplekse kvalitet og post-rensing analyse er omtalt nedenfor. - Overfør cellesuspensjonen inn i et tomt 50 ml konisk sentrifugerør av polypropylen kEPT på is. Vask hver sentrifuge flaske med ytterligere 2 ml kjølt Lysis Buffer og legge til cellesuspensjonen i 50 ml tube.
- Bestem våtvekt av cellepelleten ved veiing av røret, og å subtrahere vekten av den tomme rør, så vel som den tilsatte Lysis Buffer.
Merk: En liter av cellekulturen med en OD 600 på 1,8 er omtrent 10 g. - Skape en flytende nitrogen-bad i en 50 ml konisk polypropylen sentrifugerør. Tegn suspenderte celler inn i en 5 ml sprøyte. Koble en 16 G nål til sprøyten. Fryse cellesuspensjonen ved å føre den inn i sprøyten / nål for å generere celle "dråper". Valuta frysing bør være ca 1 min / ml.
- Oppbevar frosne celledråper (-80 ° C) eller gå videre til lyse.
- Lysing Cells og Lysate Avklaring
- Lyse gjærceller ved hjelp av en kaffekvern. Lyses celler åtte til ni ganger med 25 sek sliping bursts, mens rister coffee jeksel. Før bruk, pre-chill kaffekvern med flytende nitrogen. Hver to runder med sliping, legge til et grunt lag av flytende nitrogen til jeksel og la det fordampe.
- Rør med en flytende nitrogen avkjølt spatel som trengs for å holde celler fra klumper. Vær forsiktig for å hindre tining av celler, noe som kan resultere i celle klumper. Cellene skal vises som et fint, hvitt pulver etter lysering. Maksimalt Cellepelleten fra 4 liter av gjærkulturen (~ 40 g) kan males på en gang.
Note: Observasjoner angående metode for lyse er omtalt nedenfor. - Vurdere graden av cellelysering ved hjelp av et hemocytometer eller alternativ celle-tellemetoden. For å gi en tilstrekkelig analyse, ta følgende prøver: (1) før lyse; (2) etter fire runder med lyse; og (3) etter lysering. For å sjekke disse prøvene, ta en liten mengde av celler med flytende nitrogen kjølt spatel og plasser i en 1,5 ml tube.
- Når cellene er tint, pipettes 5 mL av cellerog blandes med 495 pl vann. Hvis 40-60% lysis av cellene er observert, går du videre til neste trinn i protokollen.
Note: Observasjoner angående effekten av lange perioder med lyse er omtalt nedenfor. - Når tilstrekkelig lyse er observert, butikk lysert celler (-80 ° C) eller gå videre til neste trinn.
- Fremstille to 50 ml konisk sentrifugerør av polypropylen hver med 15 ml lysebuffer, inkludert 1 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF), 1 mM ditiotreitol (DTT), og et kommersielt tilgjengelig cocktail av proteaseinhibitorer.
Merk: Dersom betydelig proteolyse er observert, vurdere bruk av en protease mangel belastning. - Bruk en flytende nitrogen kjølt slikkepott til å øse den frosne lyserte celle pulver i forberedt 50 ml rør. Tilsett celle pulver / faststoff i inkrementer til den Lysis Buffer, som inneholder både et reduksjonsmiddel og protease inhibitor (er).
- Rotere 50 ml rør forsiktig ved romtemperatur for derved å tine / oppløse cellene, men også for å hindre dannelse av bobler. ENs cellen pulver / solide oppløses, legge til ekstra celle fast / pulver.
- Fyll hver av de to 50 ml rør inntil hver har ca. 20 g av celler eller alle celler tilsatt. Fortsett tining / oppløsning til det ikke er frosset celle klumper observert i 50 ml rør. Dette bør ta ca 50 min.
- Sentrifuger suspen cellelysat i 20 minutter ved 25 000 xg (4 ° C). Vel-lyserte celler kan oppvise en liten mengde av sort bunnfall.
- Overfør 50 ml av supernatanten til polykarbonat ultra-sentrifugerør (26,3 ml rør som brukes) og tilsett 10 mL 200 mM PMSF til hver hele røret.
- Sentrifuger i 1 time ved 100.000 xg (4 ° C). Fire lag skal være synlig, fra bunn til topp: (1) en hard klar pellet, som inneholder ribosomal komplekser; (2) en myk lipidrike pellet; (3) et stort klar gul-farget lag som inneholder mesteparten av cellens oppløselige proteiner og komplekser; og (4) en "skjellete 'øverste laget består av lipider.
- Utfør alle subsequent trinnene i et kaldt rom (4 ° C). Fjern så mye av toppen "skjellete" lipid lag som mulig med en 1 ml pipette og kast. Bruke en 10 ml serologisk pipette for å gjenvinne det meste av den gule, klare lag.
- Gjenvinne de siste få ml av dette lag ved hjelp av en 1 ml pipette for å unngå å forstyrre de to nederste lag. Fra 40 g våt cellepellet, blir omtrent 48 ml av det midtre lag typisk utvunnet og 8 ml lipid sjiktet fjernet / kassert.
Merk: Kolonne rensestrømning blir sterkt hindret ved tilstedeværelse av lipider, som også kan redusere kvaliteten av komplekset, omtalt nedenfor.
2. Kolonne Rensing trinn 1: IgG Kromatografi
- Resin Ekvilibrering og innbinding
- Forbered en 300 mL IgG Sepharose slurry for 40 g celle pellet. Skjær enden av en 1 ml pipette spiss for å lette pipettering oppslemmingen. Vask / likevekt IgG harpiks tre ganger, hver gang med 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCI, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazol, pH 8, 0,1% volum / volum NP-40, 1 mM DTT, en proteaseinhibitor tablett per 50 ml volum).
- Spin å pelletere ved 160 xg (4 ° C) mellom vasker og fjern supernatanten.
- Rotere IgG harpiks med den midterste fase supernatanten og to mini proteasehemmer tabletter per 40 g av celler, ved hjelp av en passende rotator, i 2 timer (4 ° C). Dette er IgG satsløsningen.
- Fremstille to 10 ml poly-prep kolonner for bruk ved å kutte enden av kolonnen for å produsere et flatt snitt. For å fremskynde pakking og vasking av kolonnen ved tyngdekraftstrømning, legger et maksimum på 200 pl pakket IgG harpiks eller ~ 25 ml av IgG batch oppløsning per 10 ml kolonne.
- Hell IgG sats oppløsning inn i kolonnen og tillate å sedimentere av tyngdekraften. Hvis sedimente tar lengre tid enn 30 minutter, var det mest sannsynlig lipid forurensning når utvinning av det midterste fase fra sentrifugen tUBE'er.
- Vask pakket kolonne med fire suksessive 10 ml volumer av IgGD150 buffer.
- Forbered en 300 mL IgG Sepharose slurry for 40 g celle pellet. Skjær enden av en 1 ml pipette spiss for å lette pipettering oppslemmingen. Vask / likevekt IgG harpiks tre ganger, hver gang med 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCI, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazol, pH 8, 0,1% volum / volum NP-40, 1 mM DTT, en proteaseinhibitor tablett per 50 ml volum).
- På Column TEV Cleavage
- Tett i bunnen av kolonnen og tilsett 1 ml IgGD150 buffer og 100 ul TEV protease (0,6 mg / ml lager, mutant variant S219V av TEV produsert in-house). Forsegle toppen av kolonnen og bland i 20 minutter (18 ° C) ved bruk av en termisk-blander, risting ved 750 rpm. Resuspender harpiks og blander igjen i 20 minutter, gjentas en gang til for en total av 1 time inkubasjon.
Merk: Det er viktig å holde tiden for inkubasjon til et minimum. - Returnere kolonnen til 4 ° C og eluere proteinet / komplekset av tyngdekraften. Eluer dead-volumet med ytterligere 200 ul IgGD150 buffer.
- Tett i bunnen av kolonnen og tilsett 1 ml IgGD150 buffer og 100 ul TEV protease (0,6 mg / ml lager, mutant variant S219V av TEV produsert in-house). Forsegle toppen av kolonnen og bland i 20 minutter (18 ° C) ved bruk av en termisk-blander, risting ved 750 rpm. Resuspender harpiks og blander igjen i 20 minutter, gjentas en gang til for en total av 1 time inkubasjon.
3. Kolonne Rensning Trinn 2: Calmodulin Affinity Chromatography
- Resin Ekvilibrering og innbinding
- Forbered 200 ul calmodulin affinitet harpiks per 40 g cellepellet. Vask harpiksen tre ganger, hver gang med 5 ml calmodulin bindingsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCI, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazol, pH 8; 2 mM CaCl2; 0,1 % volum / volum NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol), sentrifugering ved 160 xg (4 ° C) for å pelletere for hver vask.
- Til hver en ml IgG eluatet, tilsett 3 volumer av calmodulin bindingsbuffer. For å holde kalsiumnivået konstant, legge CaCl 2 og β-mercaptoethanol å gjøre rede for mangelen på disse bestanddeler i IgG eluering. Sluttkonsentrasjoner bør være 2 mM CaCl2 og 10 mM β-merkaptoetanol.
- Tilsett prøven til Calmodulin harpiksen og binde i 1 time (4 ° C) ved hjelp av et rør rotator.
- Pakking og Eluerende fra calmodulin Resin
- Fremstille en 2 ml poly-prep kolonne av 100, ul Calmodulin slurry ved å kutte enden av kolonnen for å skape en flat åpning. Laster ikke mer enn 100 ul Calmodulin slurry pr column å minimalisere mengden av harpiks prøven kommer i kontakt med under eluering.
- Pakk-kolonnen ved hjelp av tyngdekraft og vask harpiksen i kolonnen tre ganger med 5 ml calmodulin bindingsbuffer.
- Elueres proteinet med tilsetning av 200 ul Calmodulin elueringsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCI, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazol, pH 8,0, 4 mM EGTA, pH 8,0, 0,08% v / v NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol). Gjenta seks ganger tilsetning av 200 ul Calmodulin elueringsbuffer.
- For elueringer 1 til 3, gjelder volumet til kolonnen og samler eluatet straks. For eluering 4, forsegle bunnen av kolonnen og inkuberes med elueringsbuffer i 2,5 minutter og deretter bryte seglet og tillate å eluere av tyngdekraften. For eluering 5, inkuber i 5 minutter og deretter bryte seglet og elueres. For eluering 6, inkuber i 10 min og deretter bryte seglet og elueres.
Merk: Integriteten av komplekset kan variere mellom elueringer / fraksjoner (se representative resultater avsnitt) <./ Li> - Dialyser elueringer 2 til 6 enkeltvis over natten ved bruk av en egnet mikrodialysemetoden. Dialyser fraksjonene mot dialysebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCI, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazol, pH 8, 10 mM β-merkaptoetanol).
Merk: NP-40 ikke passerer vesentlig, om i det hele tatt, gjennom dialysemembranen.
4. Post-rensing Analyser for å vurdere Complex Kvalitet
- Native Gel og Silver Farging
- Utarbeide en 4-16% precast innfødte gel for analyse av komplekse ifølge instruksjonene fra produsenten. Bruke en passende molekylvekt protein standard og last 15 ul av hver av de dialysert Calmodulin elueringsprofiler / fraksjoner på gelen.
- Electrophorese gelen ved 150 V i ca. 3 timer (4 ° C).
- Sølvfarging av gelen for å vurdere kvaliteten av hver av de seks elueringer. Alternativt kan du bruke like følsom kommersiellfluorescerende flekk (e). På dette stadiet er mest sannsynlig under påvisningsnivået for Coomassie blåfarging av konsentrasjonen av komplekset.
- Ekstra Gel analysemetoder
- For å oppdage protein ved Western blotting, løse komplekse ved SDS eller nativ PAGE og deretter undersøke gel for calmodulin Binding Peptide (CBP) epitop ved hjelp av en TAP tag antistoff i henhold til instruksjonene fra produsenten.
- Ved hjelp av en spesiell fluorescerende flekk (s), bekrefte tilstedeværelse og integritet av protein og / eller nukleinsyre i en TAP renset kompleks. Pass på at ingen spektral overlapp blir oppdaget mellom disse flekkene.
- Negative Stain Elektronmikros Visualisering
- Bruk kontinuerlige karbon nett glød-utladet ved -15 mA i 30 sek, innen 30 min av komplekse søknad.
- Anvende 3 mL av TAP renset kompleks (typisk ved en konsentrasjon på 1 nM) til gitteret. Inkuber i et minutt. blot fROM på siden av risten for å fjerne overskudd av buffer.
- Vask to ganger med 20 pl dråper deionisert vann. Side klatt mellom hver vask.
- Påfør rutenett til en 50 pl negative flekken slipp og inkuberes i en min. Farging med uranylacetat (2%) eller uranyl formiat (0,75%) anbefales.
Forsiktig: Uranyl salter og løsninger er svakt radioaktivt og inneholder tungmetaller. Disse bør håndteres med forsiktighet og alt materiale som kommer i kontakt med disse løsningene skal avhendes etter institusjonelle anbefalte avfalls retningslinjer. - Påfør rutenettet til en frisk 50 pl negative flekken slipp, uten blotting. Inkuber i et min, deretter side blot, og til slutt lufttørke og visualisere.
- Cryo Elektronmikroskopi (cryo-EM) Visualisering
- Utfør cryo-EM med TAP renset kompleks, men optimalisering kan være nødvendig, i henhold til produsentens protokoll.
Merk: Tilstedeværelse av vaskemiddel ved høye konsentrasjoner may hindre fremgang og er omtalt nedenfor.
- Utfør cryo-EM med TAP renset kompleks, men optimalisering kan være nødvendig, i henhold til produsentens protokoll.
5. Complex lagring
- Forbereder Complex for lagring
- Konsentrer komplekset, hvis nødvendig, ved hjelp av en sentrifugal-filter som har en passende molekylvekt cut-off for komplekset. Spin på 14 000 xg for trinn 1 min til ønsket konsentrasjon er nådd.
Merk: NP-40 konsentrasjon vil øke i konsentrasjon under konsentrering, da det ikke passerer gjennom filteret eller dialysemembran. - Flash fryse komplekset i 30 mL alikvoter i flytende nitrogen eller tørris avkjølt etanol-bad, og deretter lagres ved -80 ° C.
- Konsentrer komplekset, hvis nødvendig, ved hjelp av en sentrifugal-filter som har en passende molekylvekt cut-off for komplekset. Spin på 14 000 xg for trinn 1 min til ønsket konsentrasjon er nådd.
- Valgfri Post-rensing Fjerning av vaskemiddel
Merk: Tilstedeværelsen av en detergent så som NP-40 og ved en konsentrasjon over den for dens kritiske micellekonsentrasjon kan hindre eller hemme utvikling for noen anvendelser. Konsekvensene av det fjernes fra protocol samt erstatning med andre additiver eller ko-oppløsningsmidler er omtalt nedenfor. Hvis ingen NP-40 er ønskelig, er et alternativ til å bruke en kommersiell anvendelse for fjerning, for eksempel Bio-perler.
- Pre-likevekt kommersielt tilgjengelige vaskemiddel absorberende perler i Dialyse buffer. Bland fem perler per 30 pl av komplekset (vanligvis ved 10 nM konsentrasjon).
- Inkuber likevekt perler fra trinn 5.2.1 med TAP renset kompleks i 15 min på is. Bruk kompleks i løpet av få timer etter fjerning av detergent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En modifisert TAP metode ble anvendt for å rense fra S. cerevisiae U1 snRNP, en 18-subenhet ribonucleoprotein kompleks. En innledende TAP rensing av komplekset etter den publiserte protokoll 2,3 ga et kompleks som dukket heterogen, migrerer som tre band på en sølv farget innfødt polyakrylamid gel (Figur 2A). Flere runder med optimalisering av TAP fremgangsmåte, ga et kompleks som migrerte som først og fremst et enkelt bånd på en innfødt gel som indikerer en mer homogen sammenstilling (figur 2A). Ved hjelp av fluorescerende fargestoffer for å farge for både protein og nukleinsyre, ble det fastslått at det rensede kompleks hadde begge biopolymerer tilstede (figur 2B).
Den rensede Komplekset ble også analysert ved SDS-PAGE og Western blotting ved anvendelse av en TAP-tag antistoff (figur 3A). I samsvar med native gel resultat, komplekset renset i henhold til den protokoll som er publisert oppviste proteolyse av TAP-merkede protein (Snu71). Mengden av proteolyse, men var signifikant redusert med modifikasjoner av den TAP-metoden. Nesten alle de sytten proteiner i U1 snRNP komplekset ble løst ved SDS PAGE og positivt identifisert ved MALDI massespektrometri (figur 3B). Så vel som naturlig og SDS PAGE, var sammensatt kvalitet vurdert ved forskjellige stadier av rensingen ved negativ flekkelektronmikroskopi (figur 4). De monodispergerte partikler observert i figur 4A og B, men fraværende fra 4C, er eksempler på god prøve for strukturell studien. Denne analysemetoden gitt kritisk innsikt i virkningen av endringer i TAP-metoden.
TAP metodekall for inkludering av det ikke-ioniske vaskemiddel NP-40 og ved en konsentration over at av dens kritiske micellekonsentrasjon (CMC). Robustheten av de metoder for å vurdere kvaliteten av komplekset er beskrevet i protokollen er godt demonstrert ved et forsøk hvor det zwitterioniske overflateaktive CHAPS, glycerol eller ingen co-løsningsmiddel ble substituert for NP-40 i alle buffere (figur 5). Ved nativ PAGE og negative flekken EM, vises U1 snRNP mest homogene og stabile i NP-40 med minkende stabilitet fra CHAPS til glyserol til ingen biløsningsmiddel lagt. Det kan være at gjær U1 snRNP har en hydrofob ansikt og nærværet av NP-40 hindrer aggregering ved å belegge denne overflate. Dessverre kan NP-40 ikke fjernes ved dialyse og konsentrering av komplekset vil så konsentrere NP-40. Mens høyere NP-40 ikke synes å forurolige komplekset, gjorde det innvirke negativt på frysing av partikkelen i glasslegemet is for Cryo-EM og store micelliknende aggregater ble observert. Vaskemiddel absorberende perler ble brukt med hell til rEDra flertallet av NP-40 fra U1 snRNP prøven uten vises til å påvirke den komplekse strukturelt.
Etter rensing av komplekset med de modifikasjoner som er beskrevet i protokollen, en kompleks er egnet for både negative flekken og kryo-EM ble oppnådd, noe som gjenspeiles av bilder av plenen av partikler og særegne representative klasse gjennomsnitt (figur 6).
Figur 1. Oversikt over Tandem Affinity Rensing (TAP) Metode. (A) Skjematisk av to-trinns metode TAP. Kompleks av interesse (grå) inneholder en TAP tagget subenhet (svart, U1 snRNP subenhet Snu71) genomisk smeltet sammen med en sekvens som består av en calmodulin Binding Peptide (CBP, grønn), en gjenkjenningssete for den stedsspesifikke protease TEV (blå), og to IgG-bindende områder fra protein A (Pr A , Rød). I det første trinnet blir cellelysatet inkubert med et IgG-harpiks og komplekset blir beholdt gjennom dets interaksjon med protein A sekvensen. Komplekset frigjøres fra harpiksen ved TEV mediert spalting. I det andre trinnet blir komplekset inkubert med en Calmodulin harpiks, en Ca2 + avhengig reaksjon. Komplekset blir frigjort via tilsetningen av Ca 2 + chelator EGTA. (B) Western blot etter en TAP-merket protein gjennom rensetrinnene som er illustrert i (A). Det ble tatt prøver av celle-lysat, etter første trinn, og etter andre trinn av TAP-metoden. Den reaktive protein observert i cellelysat migrerer raskere etter første trinnet, etter TEV protease cleavage og dermed tap av protein A sekvensen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ure 2 "src =" / files / ftp_upload / 54389 / 54389fig2.jpg "/>
Figur 2. Optimalisering av den TAP metode. (A) Silver farget innfødte gel av TAP renset komplekser. Nativ PAGE av: proteinstandard (spor 1); komplekse renset i henhold til opprinnelige TAP metode 3 (spor 2), tre band observert (pilspisser); tre påfølgende elueringer fra samme TAP rensing følgende endringer i buffer, to band observert (pilspisser) (banene 3 - 5); ytterligere endringer i den aktuelle TAP-metoden, noe som gir først og fremst en enkelt sammensatt bånd som vandret på ~ 800 kDa (felt 6). (B) Analyse av sammensetningen av en sammensatt renset ved farving av en enkelt gel kjørefelt med både protein og RNA-reaktive flekker. Nativ PAGE av: proteinstandard (spor 1) farget med et fluorescerende protein flekk; Komplekset avbildes med protein fluorescerende flekk (spor 2), to bånd observert; samme kjørefelt i kjørefeltet 2, nå avbildes med en nukleinsyre fluorescerende flekken (spor 3), to band observert; og fluorescerende signal overlegge av farget kompleks i sporene 2 og 3 (spor 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Optimalisering av TAP Method. (A) Western blot-analyse av forbedring i komplekset kvalitet, etter TAP merket subenhet Snu71 probet med α-TAP antistoff. Flere proteolyserte bånd er synlige i utgangspunktet (spor 1), men forbedringer redusere mengden av nedre bånd betraktelig (spor 2 og 3). (B) En representativ SDS gel farget med et fluorescerende protein gel flekken. Gel løser 12 av de 17 proteinunderenheter av komplekset. Identitet av protein i båndene ble etablert av massespektrometri. Klikk her for å se en largeh versjon av denne figuren.
Figur 4. Eksempel Kvalitet i Etapper i TAP Metode Vurdert av Negative Stain Elektronmikros Vurdering av negative flekken elektronmikroskopi av komplekset etter:. (A) den 1. trinn i TAP, (B) den 2. trinn i TAP, (C ) kompleks destabilisert. Scale bar, 125 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Konsekvenser for Sample Quality of Tilsetningsstoffer til stede i TAP Metode Buffere Lanes en -. 4 er de fire første elueringer av den endelige eller 2. trinn i TAP rensing av complex renset i nærvær av: (A) en ikke-ionisk detergent nonyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), analysert ved nativ PAGE (øverst) og negativ flekk EM (bunn), (B) den zwitterioniske detergent 3 - [(3- cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propan (CHAPS), analysert ved nativ PAGE (øverst) og negative flekken EM (nederst), (C) glyserol, analysert ved nativ PAGE (øverst) og negative flekken EM (nederst); og (D) ingen additiv, analysert ved nativ PAGE (øverst) og negative flekken EM (nederst). Scale bar, 50 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Visualisering av TAP Metode Renset Complex. (A) Top, en representant bilde av en negativ flekk elektron mikroskop,py (EM) mikrograf. Observert er en plen av lignende formede partikler, er to eske, renset ved optimalisert TAP-metoden. Bottom, et utvalg av klasse gjennomsnitt tatt av partiklene som fremhever partikkel særtrekk. Scale bar, 50 nm. (B) Top, en representant bilde av en cryo-EM mikrograf. Observert er regioner med høyere kontrast representant for partikler, se to slike regioner eske. Bottom, klasse gjennomsnitt av utvalgte partikler frosset i glasslegemet is. Scale bar, 50 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TAP metoden benytter to koder som balanserer behovet for stram og selektiv binding til en tilhørighet harpiks med et ønske om å opprettholde nær fysiologiske løsnings forhold. Denne balansen tjener til å opprettholde stabil interaksjon (e) av den merkede protein med samspill faktor (er) for etterrensing karakterisering. I tillegg har enkelte TAP merket ORF er tilgjengelige fra en kommersiell kilde, slik at man kan oppnå en hvilken som helst gjærstamme med et kodet protein for en hvilken som helst gjær-komplekset. Bevare integriteten av et komplekst og tilgjengeligheten av en ressurs for å teste bruk av forskjellige kodede protein subenheter i en kompleks for rensing er to fordeler for anvendelse av TAP fremgangsmåte for rensing av en innfødt kompleks. Men den opprinnelige TAP-metoden protokoll ble ikke utviklet for å sikre at komplekset er renset sammensetningsmessig og strukturelt homogent. TAP-metoden har derfor blitt modifisert, slik det er beskrevet ovenfor, for å oppnå dette målet.
Diversetrinnene i TAP-metoden ble vurdert å etablere en optimal tilnærming og forhold for å rense en kompositorisk og strukturell homogen kompleks. En tidlig kritisk punkt er cellelyse. Dette trinnet krever en balanse mellom en ønske om et høyt utbytte, og således maksimal lysering, samtidig som det sikres at det oppnådde komplekset er av høy kvalitet, dvs. homogent. Ulike tilnærminger til lyserende gjærceller ble utforsket, blant annet ved hjelp av en perle-beater, høy ren væske prosessor, og ballen mill. Bruk av mindre kostbare kaffekvern var mindre effektiv enn de alternative metoder (40 - 60% lysis), men komplekset isolert og renset først på monodisperse mens flere av disse fremgangsmåter seg for enten forurolige partikkelintegritet eller forårsake en grad av aggregering. Til slutt ble et betydelig antall celler ikke lysert for å sikre høy kvalitet komplekset ble oppnådd. Mens 40-60% lyse er ideell for gjær U1 snRNP, er optimalisering foreslått når du bruker denne protokollen til en nytt biologisk kompleks.
Var det avgjørende å identifisere de trinnene i metoden som kan skynde rensing slik at komplekse integritet ikke ble svekket av cellulære proteaser, subenheten dissosiasjon som et følge av fortynning, og forlenget inkubasjon ved 18 ° C i løpet av TEV protease cleavage. Ett enkelt trinn for å oppnå tid effektiv rensing var å påse at lipider ikke bære over fra tidlig lysat avklaring ettersom lipider hindrer flyten under gravitasjon rensning. Andre tiltak inngår identifiserer en optimal balanse mellom mengden harpiks og kolonnestørrelse / dimensjoner for å oppnå effektiv rensing og en maksimal strømningshastighet. En spesielt viktig skritt var å redusere tiden av på kolonne spalting av TEV protease. Den TEV protease anvendt ble renset i huset for å sikre at det var protease / nuklease fri, og i en høy konsentrasjon 17. Betydelige mengder av TEV protease ble brukt til å oppnå fullstendig spalting under en time.
ontent "> I første TAP renselser proteolyse ble observert. Proteolyse under rensingen kan begrenses ved å jobbe effektivt, og legger et batteri av inhibitorer, og inkludert i rense høye salt vasker. Et bredt spekter av proteasehemmere levert i løpet av første halvdel av rensing kraftig forbedret stabiliteten av TAP merket protein og komplekse. i tillegg ble proteolyse minimalisert ved å øke monovalent konsentrasjon på 300 til 500 mM i løpet av cellelyse og IgG trinnene med rensing. Selv med de ovennevnte modifikasjoner av den TAP-metoden, suksessive eluert fraksjoner av av CBP affinitet harpiks variert i deres grad av kompositoriske homogenitet. Dermed selektiv pooling av fraksjoner fra den andre, CBP kromatografi skritt, er berettiget.Et aspekt av TAP metode som mottok særlig fokus var viktigheten av det ikke-ioniske vaskemiddel NP-40 til komplekse rensing og ved en konsentrasjon over dens CMC. Tilstedeværelsen av NP-40 ved en konsentrasjon på 0,08% eller høyere hadde en generelt fordelaktig effekt på komplekse integritet, og det endelige utbytte. Den tilsynelatende gunstig effekt (er) av NP-40 kan skyldes delvis til å redusere ikke-spesifikke interaksjoner mellom harpiks og komplekset. Mens NP-40 ser ut til å ha en fordelaktig effekt i løpet av rensingen, kan den bli fjernet etter rensing uten å forårsake kompleks aggregering.
Til slutt, kritisk for å optimalisere TAP fremgangsmåte for strukturell studien var flere komplementære assays som brukes for å vurdere integritet og homogeniteten av komplekset. Disse inkluderte lysspredning, SDS og nativ PAGE probet ved hjelp av den aktuelle TAP antistoff ved Western blot og / eller farget med fluorescerende fargestoffer, såvel som negativ flekkelektronmikroskopi. Endringene som er gjort i TAP-metoden beskrevet her, ga en homogen kompleks på tilstrekkelige mengder for elektronmikroskopi. Ytterligere endringer kan måtte bli gjort til den TAP metode for andre komplekser, i særdeleshet en avskrekkemelse av viktigheten av NP-40.
Oppsummert kan den TAP rensemetode brukes for å kunne rense makromolekylære komplekser fra en eukaryot kilde av egnet kvalitet for strukturelle studier. Vi har etablert en egnet metode for rensing av S. cerevisiae U1 snRNP og detalj trinnene tatt, samt begrunnelsen for mange av disse endringene. For andre komplekser, foreslår vi at etterforskeren tilsvar utforske trinnene i protokollen, som kan gi tilstrekkelige mengder og kvalitet av komplekse. Trinnene som skal undersøkes omfatte cellelyse, salt og additiv type og konsentrasjon, inkludert detergent, og følsomheten av komplekset til kalsium og metallchelator EGTA. Videre er det avgjørende for langtidsstudier at komplekset kan fryses og tines uten perturbing struktur. Viktigere, bør man ha flere alternative måter å analysere strukturen av komplekset under og etter rensing. Native ennd SDS PAGE, negative flekken EM, og lysspredning har tjent oss godt i vår undersøkelse av hvordan best å rense en homogen kompleks med TAP-metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 ml Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 ml poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
References
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
- Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
- Ghaemmaghami, S., et al.
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
- Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
- Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
- Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
- Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
- Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).
