Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Imitando la funzione di proteine ​​di segnalazione: Verso artificiale trasduzione del segnale Therapy

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Introduction

Vie di trasduzione del segnale giocano un ruolo significativo praticamente in ogni processo cellulare e permettono alla cellula di rispondere rapidamente a segnali ambientali. 1 Questi percorsi sono spesso innescati dal legame di una molecola di segnalazione ad un recettore extracellulare, che si traduce in attivazione di enzimi intracellulari. Amplificazione e propagazione di questo segnale all'interno della cellula è mediata dalla funzione di segnalazione proteine ​​che formano una rete di interazioni proteina-proteina in cui gli enzimi sono reversibilmente attivati ​​con elevata specificità. A causa disregolazione di queste reti porta spesso allo sviluppo del cancro, c'è stato molto interesse a stabilire 'trasduzione del segnale terapia del cancro', 2 in cui i farmaci sono progettati per distruggere vie di segnalazione maligni. Abbiamo recentemente proposto un approccio alternativo per segnalare terapia trasduzione che si basa sulla capacità dei farmaci di generare trasduzione del segnale innaturali.

Per dimostrare la fattibilità di questo approccio, abbiamo recentemente creato una sintetica 'trasduttore chimico' 4, che consente il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) per attivare la scissione di un profarmaco antitumorale attivando glutatione-s-transferasi (GST), che è non il suo partner naturale vincolante. La struttura di questo 'trasduttore' costituito da un anti-PDGF aptamer DNA che viene modificato con un inibitore bivalente per GST. Quindi, questo agente sintetico appartiene ad una famiglia di molecole con i siti di legame perdiverse proteine, 5-7 come induttori chimici di dimerizzazione (CID) 8-10 e anche al gruppo di proteine-leganti basato su coniugati molecola oligonucleotidi sintetici. 11-21

I principi generali alla base della progettazione di tali sistemi sono descritti nel presente documento e protocolli dettagliati per sintetizzare e testare la funzione di questo 'trasduttore' con saggi enzimatici convenzionali sono forniti. Questo lavoro è destinato a facilitare lo sviluppo di "trasduttori" aggiuntivi di questa classe, che può essere usato per mediare comunicazione proteina-proteina intracellulare e conseguentemente, per indurre vie di segnalazione delle cellule artificiali.

La figura 1 descrive schematicamente i principi di funzionamento di sintesi 'trasduttori chimici' che possono mediare la comunicazione proteina-proteina innaturali. In questa illustrazione, un 'trasduttore chimica', che integra leganti sintetici per proteins I e II (leganti I e II), consente proteina II per innescare l'attività catalitica della proteina I, che non è il suo partner naturale vincolante. In assenza di proteine II, il trasduttore lega il sito catalitico dell'enzima (proteina I) e inibisce la sua attività (Figura 1, stato ii). Il legame del 'trasduttore' alle proteine II, tuttavia, promuove interazioni tra legante I e la superficie della proteina II (Figura 1, stato iii), che riduce l'affinità verso proteine I. Di conseguenza, la concentrazione efficace del ' libera trasduttore 'nella soluzione viene ridotta, il che porta alla dissociazione del trasduttore-proteina complesso I e riattivazione della proteina I (Figura 1, stato iv). Nel loro insieme, questi passi in evidenza tre principi fondamentali alla base della progettazione di "trasduttori 'efficienti: (1) un' sensore 'dovrebbe avere un legante specifico per ciascuno dei bersagli proteici, (2) l'interazione between legante II e proteine ​​II dovrebbe essere più forte l'interazione tra binder I e proteine ​​I, e (3) binder devo essere in grado di interagire con la superficie della proteina II. Quest'ultimo principio non richiede necessariamente che legante io solo avrebbe un alta affinità e selettività verso proteine ​​II. Invece, si basa su nostri recenti studi che hanno dimostrato che portare una molecola sintetica in prossimità di una proteina è in grado di favorire interazioni tra questa molecola e la superficie della proteina. 19,22,23

Figura 1

Figura 1:. Funzionamento principi di 'trasduttori chimici "Quando si aggiunge il' trasduttore chimica 'per una proteina attiva I (stato i), che si lega al suo sito attivo attraverso legante I e inibisce la sua attività (stato ii). In presenza di proteine ​​II, tuttavia, la non legato 't chimicaransducer 'interagisce con proteine ​​II tramite legante II, che promuove le interazioni tra legante I e la superficie della proteina II. Questo legante indotta I-II proteina interazione riduce la concentrazione effettiva di legante io, che porta alla dissociazione del 'transducer'-proteina complesso I e alle proteine I riattivazione (stato iv). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sintesi della 'chimica trasduttore'

  1. I preparativi preliminari
    1. Preparare 2 M trietilammonio acetato (TEAA) tampone mescolando 278 ml di trietilammina con 114 ml di acido acetico e 400 ml di acqua ultrapura. Regolare il pH a 7 e aggiungere acqua ad un volume finale di 1 L. Conservare in una bottiglia scura.
      Nota: Questa soluzione è stabile per anni.
    2. Preparare una soluzione di acido ascorbico 5 mM sciogliendo 18 mg di acido ascorbico in 20 ml di acqua ultrapura. Utilizzare una soluzione fresca; la soluzione è stabile per un giorno.
    3. Preparare una (II) soluzione 10 mM Cu / Tris (benzyltriazolylmethyl) ammina (TBTA) sciogliendo 25 mg di rame (II) pentaidrato solfato in 10 ml di acqua ultrapura e 58 mg di TBTA in 11 ml dimetilsolfossido (DMSO). Mescolare le due soluzioni. Mantenere a temperatura ambiente e proteggerla dalla luce.
  2. procedura Coniugazione
    1. Sciogliere 100 nmol del oligonucleotide modificato (ODN-1) in 80 microlitridi acqua ultrapura fresca. Aggiungere 20 ml di 2 M TEAA, pH = 7. Aggiungere 80 ml di una soluzione preparata di acido ascorbico (5 mM in acqua).
    2. Sciogliere 1,5 mmol (574,5 mg) di acido etacrinico azido-modificato in 180 ml di DMSO e aggiungerlo alla soluzione. Degassare la soluzione con Argon per 60 sec e rapidamente aggiungere 40 microlitri da (II) soluzione Cu / TBTA (10 mM in 55% (v / v) DMSO / acqua).
    3. Spurgare di nuovo con Argon e chiudere, e mescolare durante la notte.
    4. Monitorare l'avanzamento della reazione e purificare il coniugato mediante RP-HPLC (fase mobile: A) 5% acetonitrile, 5% TEAA, 90% di acqua ultrapura; B) 65% acetonitrile, 5% TEAA, il 30% di acqua ultrapura). 24

2. Controllo GST attività da PDGF

  1. I preparativi preliminari
    1. Preparare 50 ml del tampone Assay mescolando 33,9 ml di tampone fosfato (PBSx1) con 16,1 ml di acqua ultrapura per ottenere una concentrazione finale di fosfato 8 mM e annuncid 23,8 mg di MgCl 2 per ottenere un 5 mm di concentrazione finale.
    2. Preparare una soluzione stock di GST M1-1 sciogliendo la proteina in un tampone contenente 50 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitolo (DTT), e 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) ad una concentrazione finale di 30 pM. Dividere questa soluzione in piccole aliquote e conservare a -80 ° C. Diluire fresco, secondo la sezione 2.1.5.1, nel tampone e tenere in ghiaccio.
      Nota: la soluzione sarà stabile per circa 5 ore, o fino a quando vi è una riduzione dell'attività enzimatica.
    3. Preparare il supporto secondo le seguenti istruzioni:
      1. Disciogliere 10 mg di glutatione ridotto (GSH) in 325 ml di acqua ultrapura per una concentrazione finale di 100 mM soluzione madre. Diluire 21 ml di questa soluzione madre in 979 ml di tampone per una concentrazione finale di 2,1 soluzione di lavoro mm.
      2. Sciogliere 10 mg di 2,4-dinitroclorobenzene (CDNB) in 492 ml di postathanol ad una concentrazione finale di 100 soluzione madre mm. Diluire 43,2 ml di soluzione madre in 956,8 ml di un tampone per una concentrazione finale di 4.32 soluzione di lavoro mm.
    4. In una piastra da 96 pozzetti, mettere ogni substrato in una riga separata (12 pozzetti). Inserire almeno 60 microlitri in ciascun pozzetto per permettere semplice e veloce prelievo della soluzione. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per la protezione dalla luce.
    5. Preparare le seguenti soluzioni madre nel buffer Assay:
      1. Diluire GST M1-1 da 50 ad una concentrazione finale di 0,6 mM del dimero.
      2. Diluire il 'trasduttore chimica' per un 30 micron soluzione madre.
      3. Diluire PDGF ad una concentrazione finale di 40 pM.
      4. Diluire PDGF aptamero ad una concentrazione finale di 250 mM.
  2. Misurare la GST attività nel presenza della 'trasduttore chimica' e PDGF.
    1. Impostare una procedura sperimentale in per il lettore di piastre per la misurazione cinetica.
      1. Creare un nuovo esperimento come un 'protocollo standard'.
      2. Premere 'procedura' per aprire la finestra delle impostazioni della procedura.
      3. Nell'elenco comparsa sul lato superiore della finestra, scegliere il tipo '384 piastra' secondo il produttore piatto.
      4. Premere 'Leggi' nel menu a sinistra.
      5. Per quanto riguarda il metodo di rilevamento scegliere 'assorbanza'.
      6. Per quanto riguarda il tipo di lettura scegliere 'Punto finale'.
      7. Valuta 340 nm sulla finestra di lunghezza d'onda.
      8. Premete sul fondo 'Piatto pieno' sul lato superiore destro e scegliere il bene da misurare.
      9. Premere 'OK' per chiudere la finestra 'Leggi'.
      10. Scegliere 'iniziare cinetica' nel menu a sinistra.
      11. Effettuare il tempo di esecuzione 10 min.
      12. Selezionare l'opzione intervalli minimi.
      13. Premere 'OK' per chiudere la finestra cinetica.
      14. Trascinare il 'Leggi' i lineanto la misurazione cinetica.
      15. Premere il pulsante 'convalidare' e poi il pulsante 'OK'.
      16. Salvare l'esperimento.
      17. Premere il tasto 'play'. Apparirà una finestra di dialogo - solo premere il pulsante 'OK' quando deve essere avviato la misurazione.
    2. Per eseguire l'esperimento triplicato, preparare quattro campioni contenenti ciascuna 3,25 microlitri del 'trasduttore chimica' e 3.25 ml di GST M1-1. Aggiungere ad ogni campione 0, 1.2, 2.4 o 4.9 ml di PDGF e 123.5, 122.3, 121.1, o 118,6 ml di tampone di dosaggio, rispettivamente.
    3. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 min.
    4. In un piatto ben 384-trasparente, inserire 40 ml di campione a ciascun pozzetto. Inserire i campioni soltanto nei pozzetti dispari o solo nei pozzetti anche nella stessa linea per consentire l'uso di un multi-pipetta per l'aggiunta del substrato.
    5. Utilizzando un 12-channel multi-pipetta, aggiungere rapidamente 10 ml di ciascuno dei tegli substrati che sono stati pre-preparati nella piastra a 96 pozzetti (sezione 2.1.4). Mescolare delicatamente e rapidamente per evitare le bolle. Inserire la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica. Poiché la cinetica GST è abbastanza veloce, cercare di minimizzare il tempo tra substrato aggiunta e l'inizio della misurazione cinetica.
  3. GST attivazione / inibizione Cicli mediato dal 'trasduttore chimica'.
    1. Per eseguire l'esperimento triplicato, preparare 5 campioni contenenti ciascuno 84,5 ml di tampone, 3,25 ml di 'trasduttore chimico', e 3,25 ml di GST M1-1. Incubare a temperatura ambiente per 3 min.
    2. Aggiungere 3,65 ml di tampone per il campione 1 e 3,65 ml di PDGF ai campioni 2-5. Incubare a temperatura ambiente per 3 min.
    3. Aggiungere 3.12 ml di tampone per campioni 1-2 e 3.12 ml di PDGF aptameri ai campioni 3-5. Incubare a temperatura ambiente per 3 min.
    4. Aggiungere 24,4 ml di tampone per campioni1-3 e 24,4 ml di PDGF ai campioni 4-5. Incubare a temperatura ambiente per 3 min.
    5. Aggiungere 7,8 microlitri di tampone del saggio di campioni 1-4 e 7,8 ml di PDGF aptameri a campione 5. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    6. In un piatto ben 384-trasparente, inserire 40 ml di campione in ciascun pozzetto. campioni Inserire solo nel dispari o solo nelle addirittura pozzi nella stessa linea.
    7. Utilizzando un 12-channel multi-pipetta, aggiungere rapidamente 10 microlitri di ciascun substrato (pre-preparata nella piastra a 96 pozzetti). Mescolare delicatamente e rapidamente per evitare le bolle. Inserire la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica.
    8. Calcolare il V 0 [Mod / min] in ciascuna condizione sottraendo il OD misurata a 340 nm at = 0.5 min dalla OD misurata a 340 nm at = 1.5 min per valutare l'attivazione / inibizione della riciclabilità. 25
  4. Valutare la risposta in tempo reale del 'trasduttore chimica' per cambiamenti nell'ambiente.
      <li> effetto in tempo reale di PDGF aggiunta
      1. Impostare una procedura sperimentale nel lettore di piastre per la misurazione cinetica.
      2. Ripetere i passaggi 2.2.1.1-2.2.1.10.
      3. Effettuare il tempo di funzionamento 3.5 min.
      4. Selezionare l'opzione intervalli minimi.
      5. Premere 'OK' per chiudere la finestra cinetica.
      6. Trascinare la linea di 'Leggere' nella misurazione cinetica.
      7. Scegli Piastra Out / In nel menu a sinistra.
      8. Scegliere l'opzione 'piatto fuori (senza finestra)'.
      9. Scegliere l'opzione 'Gara' nel menu a sinistra ed entrate 30 sec.
      10. Scegli Piastra Out / In nel menu a sinistra.
      11. Scegliere il 'piatto in (senza finestra)' opzione.
      12. Creare una seconda misura cinetica ripetendo i passi 2.2.1.4 - 2.2.1.14 ma nella sezione 2.2.1.11 impostare la cinetica di essere 25 min invece di 10 min.
      13. Premere il pulsante 'convalidare' e poi il pulsante 'OK'.
      14. Salvare l'esperimento.
      15. Premere il tasto 'PLApulsante Y '. Apparirà una finestra di dialogo - solo premere il pulsante 'OK' quando deve essere avviato la misurazione.
      16. Preparare due campioni mescolando 1 ml di GST M1-1 e 1 ml di 'trasduttore chimica' in 38 ml di tampone. Inserire i campioni in due pozzetti di una piastra ben 384-trasparente, lasciando un pozzo vuoto tra questi due pozzetti.
      17. Utilizzando un 12 canali multi-pipetta, aggiungere rapidamente 10 ml di ogni substrato, mescolare delicatamente e rapidamente per evitare le bolle, inserire la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica.
      18. Quando la piastra si apre (dopo 3,5 min), aggiungere rapidamente 1.125 ml di PDGF ad uno dei pozzi, mescolare delicatamente, e lasciare che la piastra di chiusura per le misurazioni cinetiche rimanenti.
    1. effetto reale tempo di aggiunta del aptamer PDGF
      1. Ripetere i passaggi 2.4.1.1-2.4.1.15.
      2. Preparare due campioni mescolando 1 ml di GST M1-1, 1 ml di 'trasduttore chimica ', e 1.125 ml di PDGF a 36,9 ml di tampone. Inserire i campioni in due pozzetti di una piastra ben 384-trasparente, lasciando un pozzo vuoto tra questi due pozzetti.
      3. Utilizzando un 12 canali multi-pipetta, aggiungere rapidamente 10 ml di ogni substrato, mescolare delicatamente e rapidamente per evitare le bolle, inserire la piastra nel lettore, e avviare la misurazione cinetica.
      4. Quando la piastra si apre (dopo 1,5 min), aggiungere rapidamente 1,2 ml di PDGF aptameri ad uno dei pozzi, mescolare delicatamente e lasciare che la piastra di chiusura per le misurazioni cinetiche rimanenti.
  5. Misurare JS-K Prodrug attivazione da GST in presenza della 'trasduttore chimica' e PDGF.
    1. Impostare una procedura sperimentale nel lettore di piastre per la misurazione cinetica.
      1. Creare un nuovo esperimento come un 'protocollo standard'.
      2. Premere 'procedura' per aprire la finestra delle impostazioni della procedura.
      3. Nella lista pop-up sulla parte superiore della finestra di scegliere il tipo '384 piastra' secondo il produttore piatto.
      4. Premere 'Leggi' nel menu a sinistra.
      5. Per quanto riguarda il metodo di rilevazione scelto 'assorbanza'.
      6. Per quanto riguarda il tipo di lettura scegliere 'Punto finale'.
      7. Valuta 305 nm sulla finestra di lunghezza d'onda.
      8. Premere il pulsante 'Piatto pieno' sul lato superiore destro e scegliere il bene da misurare.
      9. Premere 'OK' per chiudere la finestra 'Leggi'.
      10. Scegliere 'iniziare cinetica' nel menu a sinistra.
      11. Effettuare il tempo di esecuzione 10 min.
      12. Selezionare l'opzione intervalli minimi.
      13. Premere 'OK' per chiudere la finestra cinetica.
      14. Trascinare la linea di 'Leggere' nella misurazione cinetica.
      15. Premere il pulsante 'convalidare' e poi il pulsante 'OK'.
      16. Salvare l'esperimento.
      17. Premere il tasto 'play'. Una finestra di dialogo box apparirà - solo premere il pulsante 'OK' quando deve essere avviato la misurazione.
    2. Per la produzione di NO misurazioni utilizzare un kit calorimetrica nitriti / nitrati. In una piastra da 96 pozzetti inserire 50 ml di tampone in una riga, 70 ml di Griess I reattivo nella seconda fila, e 70 ml di Griess II reattivo nella terza fila.
    3. Per eseguire l'esperimento triplicato, preparare quattro campioni contenenti ciascuna 4,8 microlitri del 'trasduttore chimica'. Per campionare 1, aggiungere 155,2 ml di tampone; per assaggiare 2, aggiungere 3,2 ml di GST-M1-1 e 152 ml di tampone; per assaggiare 3, aggiungere 9,6 ml di PDGF e 145,6 ml di tampone; e per assaggiare 4, aggiungere 3,2 ml di GST-M1-1, 9,6 ml di PDGF, e 142,4 ml di tampone.
    4. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 min.
    5. In una piastra ben 384-trasparente, inserire 50 ml di campione in ciascun pozzetto. campioni Inserire solo nel dispari o solo nelanche pozzetti di una stessa linea per consentire l'uso di un multi-pipetta per l'aggiunta del substrato.
    6. Aggiungere 0,54 ml di JS-K (5 mm in DMSO) in ciascun pozzetto.
    7. Utilizzando un 12 canali multi-pipetta, aggiungere rapidamente 10 ml di soluzione di GSH (pre-preparati nella piastra a 96 pozzetti), mescolare delicatamente e rapidamente per evitare le bolle. Inserire la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica.
    8. Immediatamente dopo la misurazione cinetica, con un 12 canali multi-pipetta, prendere 50 ml di ogni campione nella fila tampone nella piastra a 96 pozzetti pre-preparati e aggiungere rapidamente ad esso 50 ml di Griess I reagenti e 50 ml di Griess II reagente. Incubare proteggendo dalla luce per 10 minuti a RT e misurare l'assorbanza a 550 nm.
      Nota: Il tampone e volumi reagenti dipendono protocollo dei kit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La progettazione, la sintesi, e il meccanismo di azione di un 'trasduttore chimica' che può indurre comunicazione artificiale tra PDGF e GST sono rappresentati in Figura 2. La struttura del 'trasduttore' integra un aptamero PDGF DNA ed un ammide bis-ethacrynic (BEA ), che è, rispettivamente, un inibitore noto GST (Figura 2a). 19 Questi leganti consentono 'trasduttore' di impegnare sia PDGF e GST con differenti affinità, cioè, con costanti di dissociazione (k d 's) di 26 nM e 144 nM, . 4 Inoltre, secondo questo disegno, il legame PDGF dovrebbe indurre interazioni non specifiche tra l'unità BEA e la superficie di PDGF, che ridurre notevolmente la potenza dell'inibitore BEA. 19,22,23 figura 2b illustra la meccanismo di funzionamento alla base del sistema. Dopo l'aggiunta del 'trasduttore' a un GST attiva, ladue unità EA legano simultaneamente entrambi i siti attivi di questo enzima dimerica e inibire la sua attività. In presenza di PDGF, tuttavia, a-PDGF'transducer complesso 'è formato, che impedisce l'unità BEA inibisca GST. Questo porta di conseguenza alla dissociazione del GST-'transducer 'complesso e di GST riattivazione. GST può essere ri-inibita aggiungendo un aptamero non modificato PDGF che sposta l' 'trasduttore chimica' e permette di inibire nuovo GST.

La capacità di PDGF per controllare l'attività GST è stata dimostrata misurando GST (10 nM) di attività con e senza la 'trasduttore chimica' (500 nM) e misurando l'attività del complesso GST-'chemical trasduttore 'in presenza di diverse concentrazioni di PDGF (250, 500, e 1000 nM) (Figura 3a). Dopo aver stabilito che la 'trasduttore chimica' induce comunicazione PDGF-GST artificiale, abbiamosuccessiva stabilito che tale comunicazione artificiale, simili ai passaggi di trasduzione del segnale, è anche reversibile e si adatta rapidamente ai cambiamenti nell'ambiente. Reversibile attivazione / inibizione GST è stata eseguita mediante aggiunte sequenziali di PDGF e non modificato aptamer PDGF al trasduttore GST-'chemical 'complessa (Figura 3b). La risposta del sistema alla dinamica in tempo reale nel suo ambiente è stata valutata misurando l'attività GST aggiungendo i vari ingressi. Un rapido aumento dell'attività GST è stato osservato dopo l'aggiunta di PDGF (750 nM) alla GST-'transducer 'complessa (10 nM e 500 nM, rispettivamente) 3,5 minuti dopo l'aggiunta di substrati (figura 4a). Analogamente, una diminuzione dell'attività GST è stato osservato dopo l'aggiunta di PDGF aptamer (5 mM) ad una miscela di GST (10 nM), PDGF (750 nM), e 'trasduttore chimica' (500 nM) (Figura 4b).

Fnfine, abbiamo dimostrato la capacità di un tale sistema per controllare l'attivazione profarmaco in risposta ai cambiamenti nell'ambiente. JS-K è un profarmaco antitumorale attivato da GST per rilasciare NO tossici (figura 5a). La quantità di NO rilasciato dopo l'aggiunta di JS-K (45 pM) alla 'trasduttore chimica' (750 nM) e differenti combinazioni di GST (10 nM) e PDGF (2 mM) sono stati misurati (figura 5b), confermando così che solo la presenza sia di GST e PDGF provocherà l'attivazione profarmaco.

figura 2
Figura 'trasduttore Chemical' 2. -. Sintesi e comando (a) Il 'trasduttore chemical' è costituito da un aptamero PDGF, un inibitore GST bivalente ammide ethacrynic (EA), un fluoroforo (FAM), ed un quencher (DABCYL) . Questo coniugato aptameri-inibitoreè sintetizzato attaccando un ammide ethacrynic (EA) derivato azide modificato ad un dialkyne-modificato e aptamer DNA fluorescente (ODN-1). Ristampato con il permesso di riferimento 4. (B) L'attività enzimatica delle GST è inibita dal 'trasduttore chimica', a causa del legame dei gruppi EA nei siti attivi dell'enzima. Aggiunta di PDGF porta alla formazione del 'complesso, che interrompe il' trasduttore PDGF-'chemical interazione transducer'-GST, quindi ripristinare l'attività enzimatica. La seguente aggiunta di un aptamero non modificato PDGF rilascia il 'trasduttore chimica' e permette di ri-inibire l'enzima. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Fi. figura 3: attività GST PDGF-controllato (a) GST (10 nM) L'attività enzimatica in presenza (-) e assenza (-) del 'trasduttore chimica' (500 nM), in presenza della 'trasduttore chimica '(500 nM) con concentrazioni crescenti (250, 500, o 1000 nm) di PDGF (---). (B) Inibizione cicli-attivazione di GST attività enzimatica manifestati da cambiamenti della velocità iniziale (V 0) in risposta ad aggiunte sequenziali (IIV) di PDGF e non modificato aptamer PDGF al trasduttore 'GST-'chemical complessa: (I) nessuno, (II) PDGF (750 nM), (III) PDGF aptamer (4 mM), (IV ) PDGF (5 mM), e (aptamero V) PDGF (10 pM). Il grafico presenta la media ± STDEV di triplicati. Ristampato con il permesso di riferimento 4. Fare clic qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.

Figura 4
. Figura 4: Controllo in tempo reale dell'attività GST (a) Miglioramento della GST attività enzimatica rilevato immediatamente dopo l'aggiunta di 750 nM PDGF (-) ad una soluzione contenente GST (10 nM) e 'trasduttore chimica' (500 nM) ( -) a t = 3.5 min. (B) aggiunta di un non modificato PDGF aptamer (5 mM) (-) ad una soluzione contenente GST (10 nM), PDGF (750 nM), e 'trasduttore chimica' (500 nM) (-) a t = 1,5 min porta ad un'immediata diminuzione della velocità di reazione enzimatica. Ristampato con il permesso di riferimento 4. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

5 "src =" / files / ftp_upload / 54396 / 54396fig5.jpg "/>
Figura 5:. Controllato attivazione profarmaco (a) attivazione GST di JS-K profarmaco per rilasciare NO tossici. (B) il rilascio di NO in presenza della 'trasduttore chimica' e diverse combinazioni di GST (10 nM) e PDGF (2 micron). Il grafico presenta la media ± STDEV di triplicati. Cambiato con il permesso di riferimento 4. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione Minerva, l'Organizzazione HFSP, e un Consiglio di Grant europeo della ricerca (Starting Grant 338.265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-chloro-2,4-dinitrobenzene Sigma-Aldrich 237329
Acetic acid Bio Lab 01070521
Acetnitrile J.T.Baker 9017-03
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
Copper(II) Sulfate pentahydrate Merck-Millipore 102790
Dimethyl sulfoxide Merck-Millipore 802912
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological Industries 02-023-5A
Ethacrynic acid Tokyo Chemical Industry Co. Ltd E0526
Glutathione-s-transferase M1-1 Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
JS-K Sigma-Aldrich J4137
L-glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251
Magnesium Chloride J.T.Baker 0162
nitrate/nitrite colorimetric assay kit Cayman Chemical 780001
Oligonucleotides W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University custom order
PDGF-BB Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
TBTA Sigma-Aldrich 678937
Triethylamine Sigma-Aldrich T0886
Desalting column GE Healthcare illustra MicroSpin G-25 Columns
HPLC Waters  2695 separation module
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm)
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 10 mm × 50 mm)
Plate reader BioTek synergy H4 hybrid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
  2. Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
  3. Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
  4. Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
  5. Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
  6. Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
  7. Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
  8. Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
  9. DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
  10. Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
  11. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
  12. Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
  13. Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
  14. Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
  15. Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
  16. Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
  17. Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
  18. Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
  19. Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
  20. Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
  21. Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
  22. Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
  23. Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
  24. Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
  25. Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
  26. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).

Tags

Biochimica trasduzione del segnale artificiale il rilascio mirato di farmaci la chimica biomimetica recettori proteina sintetica biologia chimica recettori proteici basati sul DNA leganti proteici commutabile
Imitando la funzione di proteine ​​di segnalazione: Verso artificiale trasduzione del segnale Therapy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peri-Naor, R., Motiei, L.,… More

Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54396, doi:10.3791/54396 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter