Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

محاكاة وظيفة من البروتينات اشارة: نحو الاصطناعي الإشارة العلاج تنبيغ

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Introduction

مسارات نقل الإشارة تلعب دورا هاما في عملية الخلوية تقريبا كل وتسمح للخلية للرد السريع للإشارات البيئية. 1 وغالبا ما تسبب هذه الممرات من قبل ملزم لجزيء إشارة إلى مستقبلات الخلية، مما يؤدي إلى تنشيط الانزيمات داخل الخلايا. وتوسط التضخيم ونشر هذا إشارة داخل الخلية عن طريق وظيفة يشير البروتينات التي تشكل شبكة من التفاعلات البروتين البروتين الذي الانزيمات يتم تنشيط عكسية مع خصوصية عالية. بسبب التقلبات من هذه الشبكات في كثير من الأحيان يؤدي إلى تطور مرض السرطان، وكان هناك الكثير من الاهتمام في إنشاء "إشارة العلاج تنبيغ السرطان، 2 حيث تم تصميم عقاقير لتعطيل مسارات الإشارات الخبيثة. لقد اقترحت مؤخرا نهجا بديلا للإشارة إلى العلاج التنبيغ التي تعتمد على قدرة الأدوية لتوليد غير طبيعية مسارات نقل الإشارة.

للتدليل على جدوى هذا النهج، وقد انشأنا مؤخرا الاصطناعية "محول الكيميائي" 4 التي تمكن عامل النمو المشتق من الصفيحات (PDGF) لتحريك الانقسام من دواء مساعد المضادة للسرطان من خلال تفعيل الجلوتاثيون-ق-ترانسفيراز (GST)، وهو لا شريك ملزم الطبيعي. هيكل هذا "محول" يتكون من مضاد PDGF-أبتمر الحمض النووي التي تم تعديلها مع مثبط ثنائي التكافؤ لضريبة السلع والخدمات. وبالتالي، فإن هذا عامل الاصطناعية ينتمي إلى عائلة من الجزيئات مع مواقع الربط لالبروتينات المختلفة، مثل 5-7 محرضات الكيميائية من dimerization (رقم تعريفي للعملاء) 10/08، وكذلك إلى مجموعة البروتينات والمواد اللاصقة على أساس تقارن جزيء النوكليوتيد الاصطناعية. 11-21

المبادئ العامة التي يقوم عليها تصميم هذه النظم يوصف هنا ووتقدم بروتوكولات مفصلة لتجميع واختبار وظيفة هذا "محول" مع المقايسات الأنزيمية التقليدية. ويهدف هذا العمل إلى تسهيل النامية محولات "إضافية من هذه الفئة، والتي يمكن استخدامها للتوسط بين الخلايا الاتصالات البروتين البروتين، وبالتالي، للحث الاصطناعية مسارات الخلية إشارات.

الشكل 1 يصف الخطوط العريضة لمبادئ التشغيل من "محولات الكيماوية الاصطناعية التي يمكن أن توسط غير طبيعية الاتصالات البروتين البروتين. في هذا التوضيح، وهو 'محول الكيميائية "، الذي يجمع بين المجلدات الاصطناعية لبروتتمكن EINS الأول والثاني (المجلدات الأول والثاني)، والبروتين الثاني لتحريك النشاط التحفيزي من البروتين الأول، الذي لا شريك له ملزم الطبيعي. في غياب البروتين الثاني، محول يربط الموقع الحفاز للانزيم (البروتين الأول) ويمنع نشاطها (الشكل 1، الدولة الثانية). الربط من "محول" لبروتين الثاني، ومع ذلك، يعزز التفاعل بين الموثق الأول وسطح البروتين الثاني (الشكل 1، دولة ج)، مما يقلل من تقارب تجاه بروتين أولا ونتيجة لذلك، فإن التركيز الفعال لل" يتم تقليل الحرة 'محول في الحل، الأمر الذي يؤدي إلى تفكك محول البروتين أنا معقد وتنشيط بروتين الأول (الشكل 1، الدولة رابعا). معا، وتبرز هذه الخطوات الثلاث المبادئ الأساسية التي يقوم عليها تصميم "محولات" فعالة: (1) "محول" يجب أن يكون الموثق محددة لكل من الأهداف البروتين، (2) betwe التفاعلأون الموثق الثاني والبروتين يجب أن يكون الثاني أقوى من التفاعل بين الموثق الأول والبروتين الأول، و (3) الموثق يجب أن تكون قادرة على التفاعل مع سطح البروتين الثاني. هذا المبدأ الأخير لا يتطلب بالضرورة أن الموثق أنا وحدي سيكون له قابلية عالية والانتقائية تجاه بروتين الثاني. بدلا من ذلك، لأنه يقوم على دراساتنا الأخيرة التي أظهرت أن جلب جزيء اصطناعي على مقربة من البروتين من المرجح أن تعزيز التفاعل بين هذا الجزيء وسطح البروتين. 19،22،23

شكل 1

الشكل 1: التشغيل مبادئ "محولات الطاقة الكيميائية" عندما يتم إضافة "محول الكيميائية" إلى البروتين النشط أنا (ولاية ط)، فإنه يلزم لموقعها النشط من خلال الموثق الأول ويمنع نشاطها (ولاية ب). في وجود البروتين الثاني، ومع ذلك، فإن غير منضم 'ر الكيميائيةransducer "يتفاعل مع البروتين الثاني عن طريق الموثق الثاني، الذي يعزز التفاعل بين الموثق الأول وسطح البروتين الثاني. هذا الموثق يسببها I-بروتين الثاني التفاعل يقلل من التركيز الفعال من الموثق الأول، الأمر الذي يؤدي إلى التفكك من 'transducer' البروتين أنا مجمع والبروتين أنا تنشيط (ولاية الرابع). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توليف "محول الكيميائية"

  1. التحضيرات الأولية
    1. إعداد 2 M triethylammonium خلات (TEAA) عازلة عن طريق خلط 278 مل من ثلاثي الإيثيلامين مع 114 مل من حمض الخليك و 400 مل من الماء عالى النقاء. ضبط درجة الحموضة إلى 7 وإضافة الماء إلى الحجم النهائي من 1 L. يبقيه في زجاجة داكنة.
      ملاحظة: هذا الحل هو مستقر لسنوات.
    2. إعداد محلول حامض الاسكوربيك 5 مم عن طريق إذابة 18 ملغ من حامض الاسكوربيك في 20 مل من الماء عالى النقاء. استخدام حل العذبة؛ والحل هو مستقر لمدة يوم واحد.
    3. إعداد 10 ملم النحاس (II) / ليجند تيم (TBTA) حل عن طريق إذابة 25 ملغ من النحاس (II) pentahydrate كبريتات في 10 مل من الماء عالى النقاء و 58 ملغ من TBTA في 11 مل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). مزيج من الحلين. يبقيه في درجة حرارة الغرفة، وحمايتها من الضوء.
  2. إجراء الاقتران
    1. حل 100 نانومول من النوكليوتيد المعدلة (ODN-1) في 80 ميكرولترمن الماء عالى النقاء جديدة. إضافة 20 ميكرولتر من 2 M TEAA، ودرجة الحموضة = 7. إضافة 80 ميكرولتر من محلول تقدم طازجة من حامض الاسكوربيك (5 ملم في الماء).
    2. حل 1.5 مكرومول (574.5 ميكروغرام) من حمض الإيثاكرينيك المعدلة azido في 180 ميكرولتر من DMSO وإضافته إلى الحل. ديغا الحل باستخدام الأرجون لمدة 60 ثانية، وبسرعة إضافة 40 ميكرولتر من (II) / حل TBTA النحاس (10 ملم في 55٪ (ت / ت) DMSO / الماء).
    3. تطهير مرة أخرى مع الأرجون، على مقربة بإحكام، ويقلب بين عشية وضحاها.
    4. رصد التقدم المحرز في رد الفعل وتنقية المترافقة بواسطة RP-HPLC (الطور المتحرك: أ) 5٪ الأسيتونيتريل، 5٪ TEAA، 90٪ ماء عالى النقاء. ب) 65٪ الأسيتونيتريل، 5٪ TEAA، 30٪ ماء عالى النقاء). 24

2. السيطرة على آخر ضريبة السلع والخدمات من قبل PDGF

  1. التحضيرات الأولية
    1. تجهيز 50 مل من العازلة الفحص عن طريق خلط 33.9 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBSx1) مع 16.1 مل من الماء عالى النقاء لتحقيق 8 ملي تركيز الفوسفات النهائي والإعلاند 23.8 ملغ من MgCl 2 لتحقيق 5 ملي تركيز النهائي.
    2. إعداد محلول المخزون من ضريبة السلع والخدمات M1-1 عن طريق إذابة البروتين في العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم dithiothreitol (DTT)، و 5 ملي ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) لتركيز النهائي من 30 ميكرومتر. تقسيم هذا الحل إلى قسامات الصغيرة ومخزن في -80 مئوية. تمييع حديثا، وفقا للمادة 2.1.5.1، في المنطقة العازلة الفحص والحفاظ على الجليد.
      ملاحظة: الحل أن تكون مستقرة لمدة 5 ساعة، أو حتى يكون هناك انخفاض في نشاط الإنزيم.
    3. إعداد الركيزة وفقا للتعليمات التالية:
      1. حل 10 ملغ من انخفاض الجلوتاثيون (GSH) في 325 ميكرولتر من الماء عالى النقاء إلى تركيز النهائي من 100 ملي حل الأوراق المالية. تمييع 21 ميكرولتر من هذا الحل الأسهم في 979 ميكرولتر من العازلة الفحص لتركيز النهائي من 2.1 ملي حل العاملة.
      2. حل 10 ملغ من 2،4-ثنائي نتروكلوروبنزين (CDNB) في 492 ميكرولتر من البريدthanol إلى تركيز النهائي من 100 ملي حل الأوراق المالية. تمييع 43.2 ميكرولتر من محلول المخزون في 956.8 ميكرولتر من وجود مخزن مؤقت الفحص لتركيز النهائي من 4.32 ملي حل العاملة.
    4. في لوحة 96-جيدا، وطرح كل الركيزة في سطر منفصل (12 بئرا). إدراج لا يقل عن 60 ميكرولتر في كل بئر للسماح للانسحاب سريع وسهل من الحل. تغطية لوحة مع ورقة الألمنيوم لحماية الخفيفة.
    5. إعداد الحلول الأوراق المالية التالية في المخزن المؤقت الفحص:
      1. تمييع GST M1-1 بنسبة 50 إلى تركيز النهائي من 0.6 ميكرومتر من ديمر.
      2. تمييع "محول الكيميائية" إلى 30 ميكرومتر حل الأسهم.
      3. تمييع PDGF إلى تركيز النهائي من 40 ميكرومتر.
      4. تمييع PDGF أبتمر إلى التركيز النهائي من 250 ميكرومتر.
  2. قياس النشاط ضريبة السلع والخدمات في وجود ظاهرة "محول الكيميائية" وPDGF.
    1. انشاء ط الإجراء التجريبين قارئ لوحة لقياس الحركية.
      1. خلق تجربة جديدة ك "بروتوكول قياسي".
      2. اضغط على "إجراء" لفتح نافذة إعدادات الإجراء.
      3. في القائمة المنبثقة على الجانب العلوي من النافذة، اختر '384 لوحة' نوع وفقا لالصانع لوحة.
      4. اضغط على "اقرأ" في القائمة اليسرى.
      5. وفيما يتعلق طريقة الكشف اختيار "الامتصاصية".
      6. فيما يتعلق بنوع قراءة اختيار "نقطة النهاية".
      7. إرسال 340 نانومتر على النافذة الطول الموجي.
      8. اضغط على الجزء السفلي "لوحة الكاملة" على الجانب الأيمن العلوي واختيار جيد للقياس.
      9. اضغط على "موافق" لإغلاق "اقرأ" نافذة.
      10. اختر 'بدء الحركية "في القائمة اليسرى.
      11. جعل تشغيل الساعة 10 دقيقة.
      12. حدد الخيار فترات الحد الأدنى.
      13. اضغط على "موافق" لإغلاق الإطار الحركي.
      14. اسحب 'قراءة' ط خطn لقياس الحركية.
      15. اضغط على زر 'التحقق من صحة "ثم انقر فوق الزر" موافق ".
      16. حفظ التجربة.
      17. اضغط على زر "تشغيل". سيظهر مربع الحوار - الضغط على زر "موافق" فقط عندما يجب أن تبدأ القياس.
    2. من أجل إجراء التجربة يثلث، وإعداد أربع عينات تحتوي كل منها على 3.25 ميكرولتر من 'محول الكيميائية "و 3.25 ميكرولتر من ضريبة السلع والخدمات M1-1. إضافة إلى كل عينة 0، 1.2، 2.4، أو 4.9 ميكرولتر من PDGF و123.5، 122.3، 121.1، 118.6 أو ميكرولتر من العازلة الفحص، على التوالي.
    3. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    4. في لوحة جيدا 384 شفافة، تضاف 40 ميكرولتر من العينة إلى كل بئر. إدراج عينات فقط في الآبار الفردية أو فقط حتى في الآبار في نفس الخط للسماح للاستخدام متعدد pipettor لإضافة الركيزة.
    5. باستخدام 12 قناة متعددة pipettor، بسرعة إضافة 10 ميكرولتر من كل من رانه ركائز التي كانت معدة سلفا في لوحة 96-جيدا (القسم 2.1.4). المزيج بلطف وبسرعة لتجنب الفقاعات. إدراج لوحة في القارئ والبدء في قياس الحركية. منذ حركية ضريبة السلع والخدمات بشكل سريع جدا، في محاولة لتقليل الوقت بين الجمع الركيزة وبداية قياس الحركية.
  3. GST تفعيل دورات / تثبيط وساطة من قبل 'محول الكيميائية.
    1. من أجل إجراء التجربة يثلث، وإعداد 5 عينات تحتوي كل منها على 84.5 ميكرولتر من العازلة الفحص، 3.25 ميكرولتر من "محول الكيميائية، و 3.25 ميكرولتر من ضريبة السلع والخدمات M1-1. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
    2. إضافة 3.65 ميكرولتر من العازلة الفحص لعينة 1 و 3.65 ميكرولتر من PDGF لعينات 2-5. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
    3. إضافة 3.12 ميكرولتر من العازلة الفحص لعينات 1-2 و 3.12 ميكرولتر من PDGF أبتمر لعينات 3-5. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
    4. إضافة 24.4 ميكرولتر من العازلة الفحص لعينات1-3 و 24.4 ميكرولتر من PDGF لعينات 4-5. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
    5. إضافة 7.8 ميكرولتر من العازلة الفحص لعينات 1-4 و 7.8 ميكرولتر من PDGF أبتمر لعينة 5. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    6. في لوحة جيدا 384 شفافة، تضاف 40 ميكرولتر من العينة في كل بئر. إدراج عينات فقط إلى الغريب أو فقط إلى حتى الآبار في نفس السطر.
    7. باستخدام 12 قناة متعددة pipettor، بسرعة إضافة 10 ميكرولتر من كل الركيزة (معدة سلفا في لوحة 96 أيضا). المزيج بلطف وبسرعة لتجنب الفقاعات. إدراج لوحة في القارئ والبدء في قياس الحركية.
    8. حساب الخامس 0 [وزارة الدفاع / دقيقة] تحت كل حالة عن طريق طرح OD قياس في 340 نانومتر في تي = 0.5 دقيقة من OD قياس في 340 نانومتر في تي = 1.5 دقيقة لتقييم تنشيط / تثبيط إعادة التدوير. 25
  4. تقييم الاستجابة في الوقت الحقيقي من 'محول الكيميائية "إلى التغييرات في البيئة.
      <لى> تأثير في الوقت الحقيقي من PDGF إضافة
      1. إنشاء إجراء التجارب في قارئ لوحة لقياس الحركية.
      2. كرر الخطوات من 2.2.1.1-2.2.1.10.
      3. جعل وقت التشغيل 3.5 دقيقة.
      4. حدد الخيار فترات الحد الأدنى.
      5. اضغط على "موافق" لإغلاق الإطار الحركي.
      6. اسحب 'قراءة' خط في قياس الحركية.
      7. اختيار لوحة خارج / في القائمة اليسرى.
      8. اختر الخيار "لوحة من أصل (أي الحوار).
      9. اختر الخيار "تأخير" في القائمة اليمنى وإدخال 30 ثانية.
      10. اختيار لوحة خارج / في القائمة اليسرى.
      11. اختر "لوحة في (أي الحوار) 'الخيار.
      12. إنشاء قياس الحركي الثاني بتكرار الخطوات 2.2.1.4 - 2.2.1.14 ولكن في القسم 2.2.1.11 تعيين الحركية لتكون 25 دقيقة بدلا من 10 دقيقة.
      13. اضغط على زر 'التحقق من صحة "ثم انقر فوق الزر" موافق ".
      14. حفظ التجربة.
      15. اضغط على "جيش التحرير الشعبى الصينىذ 'زر. سيظهر مربع الحوار - الضغط على زر "موافق" فقط عندما يجب أن تبدأ القياس.
      16. إعداد عينتين عن طريق خلط 1 ميكرولتر من ضريبة السلع والخدمات M1-1 و 1 ميكرولتر من 'محول الكيميائية "في 38 ميكرولتر من العازلة الفحص. إدراج العينات في بئرين لوحة جيدا 384 شفافة، وترك بئر فارغة بين هذه الآبار اثنين.
      17. باستخدام 12 قناة متعددة pipettor، بسرعة إضافة 10 ميكرولتر من كل الركيزة، مزيج بلطف وبسرعة لتجنب الفقاعات، أدخل لوحة في القارئ والبدء في قياس الحركية.
      18. عند فتح لوحة حتى (بعد 3.5 دقيقة)، إضافة بسرعة 1.125 ميكرولتر من PDGF إلى إحدى الآبار، وتخلط بلطف، والسماح لوحة يقفل مرتفعا للقياسات الحركية المتبقية.
    1. تأثير في الوقت الحقيقي من إضافة أبتمر PDGF
      1. كرر الخطوات من 2.4.1.1-2.4.1.15.
      2. إعداد عينتين عن طريق خلط 1 ميكرولتر من ضريبة السلع والخدمات M1-1، 1 ميكرولتر من 'محول الكيميائية، و1.125 ميكرولتر من PDGF في 36.9 ميكرولتر من العازلة الفحص. إدراج العينات في بئرين لوحة جيدا 384 شفافة، وترك بئر فارغة بين هذه الآبار اثنين.
      3. باستخدام 12 قناة متعددة pipettor، بسرعة إضافة 10 ميكرولتر من كل الركيزة، مزيج بلطف وبسرعة لتجنب الفقاعات، أدخل لوحة في القارئ، والبدء في قياس الحركية.
      4. عند فتح لوحة حتى (بعد 1.5 دقيقة)، إضافة بسرعة 1.2 ميكرولتر من PDGF أبتمر إلى إحدى الآبار، وتخلط بلطف والسماح لوحة يقفل مرتفعا للقياسات الحركية المتبقية.
  5. قياس JS-K دواء مساعد التنشيط من قبل ضريبة السلع والخدمات في وجود ظاهرة "محول الكيميائية" وPDGF.
    1. إنشاء إجراء التجارب في قارئ لوحة لقياس الحركية.
      1. خلق تجربة جديدة ك "بروتوكول قياسي".
      2. اضغط على "إجراء" لفتح نافذة إعدادات الإجراء.
      3. في القائمة المنبثقة على الجانب العلوي من النافذة اختر '384 لوحة' نوع وفقا لالصانع لوحة.
      4. اضغط على "اقرأ" في القائمة اليسرى.
      5. وفيما يتعلق اختار طريقة الكشف "الامتصاصية".
      6. فيما يتعلق بنوع قراءة اختيار "نقطة النهاية".
      7. إرسال 305 نانومتر على النافذة الطول الموجي.
      8. اضغط على زر 'لوحة الكاملة "على الجانب الأيمن العلوي واختيار جيد للقياس.
      9. اضغط على "موافق" لإغلاق "اقرأ" نافذة.
      10. اختر 'بدء الحركية "في القائمة اليسرى.
      11. جعل تشغيل الساعة 10 دقيقة.
      12. حدد الخيار فترات الحد الأدنى.
      13. اضغط على "موافق" لإغلاق الإطار الحركي.
      14. اسحب 'قراءة' خط في قياس الحركية.
      15. اضغط على زر 'التحقق من صحة "ثم انقر فوق الزر" موافق ".
      16. حفظ التجربة.
      17. اضغط على زر "تشغيل". وبو الحوارس سوف تظهر - اضغط على زر 'موافق' فقط عندما يجب أن تبدأ القياس.
    2. لأي إنتاج قياسات تستخدم عدة مقياس الكالوري النتريت / نترات. في لوحة 96-جيدا إدراج 50 ميكرولتر من العازلة الفحص في صف واحد، و 70 ميكرولتر من Griess أنا الكاشف في الصف الثاني، و 70 ميكرولتر من Griess الثاني كاشف في الصف الثالث.
    3. من أجل إجراء التجربة يثلث، وإعداد أربع عينات تحتوي كل منها على 4.8 ميكرولتر من 'محول الكيميائية. لعينة 1، إضافة 155.2 ميكرولتر من العازلة الفحص، لعينة 2، إضافة 3.2 ميكرولتر من GST-M1-1 و 152 ميكرولتر من العازلة الفحص، لعينة 3، إضافة 9.6 ميكرولتر من PDGF و145.6 ميكرولتر من العازلة الفحص، وأخذ عينات 4، إضافة 3.2 ميكرولتر من GST-M1-1، 9.6 ميكرولتر من PDGF، و142.4 ميكرولتر من العازلة الفحص.
    4. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    5. في لوحة جيدا 384 شفافة، تضاف 50 ميكرولتر من العينة في كل بئر. إدراج عينات فقط في الغريب أو فقط فيحتى الآبار في نفس الخط للسماح للاستخدام متعدد pipettor لإضافة الركيزة.
    6. إضافة 0.54 ميكرولتر من JS-K (5 ملم في DMSO) إلى كل بئر.
    7. باستخدام 12 قناة متعددة pipettor، بسرعة إضافة 10 ميكرولتر من محلول GSH (معدة سلفا في لوحة 96-جيدا)، مزيج بلطف وبسرعة لتجنب الفقاعات. إدراج لوحة في القارئ والبدء في قياس الحركية.
    8. مباشرة بعد قياس الحركية، وذلك باستخدام 12 قناة متعددة pipettor، واتخاذ 50 ميكرولتر من كل عينة في الصف عازلة فحص في لوحة 96-جيدا أعدت مسبقا وبسرعة إضافة إلى ذلك 50 ميكرولتر من Griess أنا كاشف و 50 ميكرولتر من Griess الثاني كاشف. احتضان مع حماية من ضوء لمدة 10 دقيقة في RT وقياس الامتصاصية في 550 نانومتر.
      ملاحظة: المخزن المؤقت فحص وكميات الكواشف تعتمد على بروتوكول مجموعات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تصميم وتركيب، وقدم آلية عمل ل"محول الكيميائية" التي يمكن أن تحدث الاتصالات الاصطناعي بين PDGF وضريبة السلع والخدمات في الشكل 2. هيكل "محول" يدمج أبتمر PDGF الحمض النووي وأميد مكرر الإيثاكرينيك (BEA )، وهي ضريبة السلع والخدمات المانع المعروفة (الشكل 2A). 19 هذه المجلدات تمكين "محول" لربط كل من PDGF وضريبة السلع والخدمات مع الانتماءات المختلفة، أي مع ثوابت التفكك (ك د الصورة) من 26 نانومتر و 144 نانومتر، على التوالي 4 وبالإضافة إلى ذلك، وفقا لهذا التصميم، وملزمة لPDGF يجب أن تحفز التفاعلات غير محددة بين وحدة BEA وسطح PDGF، والذي من شأنه أن يقلل بشكل ملحوظ من فاعلية المانع BEA. ويوضح الشكل 2B 19،22،23 من آلية التشغيل الكامنة وراء هذا النظام. على إضافة "محول" إلى GST نشطة،وحدتين EA ربط في وقت واحد على حد سواء المواقع المفعلة من هذا الانزيم مثنوي وتمنع نشاطها. في ظل وجود PDGF، ومع ذلك، يتم تشكيل PDGF-'transducer "المجمع الذي يمنع وحدة BEA من تثبيط ضريبة السلع والخدمات. هذا بالتالي يؤدي إلى التفكك من GST-'transducer "مجمع وتنشيط ضريبة السلع والخدمات. ضريبة السلع والخدمات ومن ثم يمكن إعادة مستعمل من قبل إضافة أبتمر PDGF معدلة أن يزيح "محول الكيميائية" وتمكنها من منع ضريبة السلع والخدمات مرة أخرى.

وقد أثبتت قدرة PDGF للسيطرة على النشاط GST أولا عن طريق قياس ضريبة السلع والخدمات (10 نانومتر) النشاط مع وبدون "محول الكيميائية" (500 نيوتن متر) وقياس نشاط محول مجمع ضريبة السلع والخدمات'chemical "في وجود تركيزات مختلفة من PDGF (250، 500، و 1،000 نيوتن متر) (الشكل 3A). بعد تأسيس أن 'محول الكيميائية "يدفع الاصطناعي الاتصالات PDGF ضريبة السلع والخدمات، ونحنأنشئت بجانب أن هذه الاتصالات الاصطناعي، على غرار خطوات نقل الإشارة، هو أيضا عكسها وتتكيف بسرعة مع التغيرات في البيئة. تم تنفيذ عكسها تنشيط / تثبيط ضريبة السلع والخدمات عن طريق إضافات متتابعة من PDGF ومعدلة أبتمر PDGF إلى محول ضريبة السلع والخدمات'chemical "معقد (الشكل 3B). تم تقييم مدى استجابة النظام لالتغييرات في الوقت الحقيقي في بيئته من خلال قياس النشاط ضريبة السلع والخدمات مع إضافة المدخلات المختلفة. ولوحظ وجود زيادة سريعة في النشاط ضريبة السلع والخدمات على إضافة PDGF (750 نيوتن متر) إلى GST-'transducer "مجمع (10 نانومتر و 500 نانومتر، على التوالي) بعد 3.5 دقيقة مضيفا ركائز (الشكل 4A). وبالمثل، لوحظ وجود انخفاض في النشاط ضريبة السلع والخدمات على إضافة PDGF أبتمر (5 ميكرومتر) إلى خليط من ضريبة السلع والخدمات (10 نانومتر)، PDGF (750 نيوتن متر)، و "محول الكيميائية" (500 نيوتن متر) (الشكل 4B).

Fومكونا، أثبتنا قدرة هذا النظام للسيطرة على تفعيل دواء مساعد في استجابة للتغيرات في البيئة. JS-K هو دواء مساعد المضادة للسرطان تفعيلها من خلال ضريبة السلع والخدمات لاطلاق سراح NO السامة (الشكل 5A). تم قياس كمية NO صدر عند إضافة JS-K (45 ميكرومتر) إلى "محول الكيميائية" (750 نيوتن متر) ومجموعات مختلفة من ضريبة السلع والخدمات (10 نانومتر) وPDGF (2 ميكرون) (الشكل 5B)، مما يؤكد الا ان وجود كل من ضريبة السلع والخدمات وPDGF سيؤدي إلى تفعيل دواء مساعد.

الشكل 2
الرقم "محول الكيميائية '2. - التوليف وآلية التشغيل (أ)" محول الكيميائية "تتكون من أبتمر PDGF، وثنائي التكافؤ أميد الإيثاكرينيك (EA) GST المانع، وهو fluorophore (فام)، وفاكهه تقضي (Dabcyl) . هذا أبتمر المانع المترافقةيتم تصنيعه عن طريق ربط أميد الإيثاكرينيك (EA) مشتق المعدلة أزيد إلى المعدلة dialkyne وfluorescently المسمى أبتمر الحمض النووي (ODN-1). إعادة طبع بإذن من المرجع 4. (ب) وتثبيط النشاط الأنزيمي من ضريبة السلع والخدمات من قبل 'محول الكيميائية، ويرجع ذلك إلى ربط المجموعات EA في مواقع الإنزيم النشط. إضافة PDGF تؤدي إلى تشكيل "المجمع الذي يعطل" محول PDGF-'chemical التفاعل transducer' ضريبة السلع والخدمات، وبالتالي استعادة النشاط الأنزيمي. إضافة التالية لأبتمر PDGF معدلة تطلق على "محول الكيميائية"، ويسمح لها بإعادة تمنع-الانزيم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
فاي. جوري 3: تسيطر PDGF النشاط ضريبة السلع والخدمات (أ) ضريبة السلع والخدمات (10 نانومتر) النشاط الأنزيمي في وجود (-) وغياب (-) من "محول الكيميائية" (500 نيوتن متر)، وبحضور من 'محول الكيميائية "(500 نيوتن متر) مع زيادة تركيزات (250، 500، أو 1000 نانومتر) من PDGF (---). (ب) دورات تثبيط تفعيل ضريبة السلع والخدمات النشاط الأنزيمي يتجلى بالتغيرات التي تطرأ على السرعة الأولي (V 0) ردا على إضافات متتابعة (IIV) من PDGF ومعدلة أبتمر PDGF إلى محول "ضريبة السلع والخدمات'chemical المجمع: (I) لا شيء، (الثاني) PDGF (750 نانومتر)، (الثالث) أبتمر PDGF (4 ميكرومتر)، (الرابع ) PDGF (5 ميكرومتر)، و (أبتمر V) PDGF (10 ميكرومتر). يعرض الرسم البياني يعني ± الانحراف القياسي من يثلث. إعادة طبع بإذن من مرجعية (4). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.

الشكل (4)
. الشكل 4: تحكم في الوقت الحقيقي من النشاط ضريبة السلع والخدمات (أ) تعزيز GST النشاط الأنزيمي الكشف فورا بعد إضافة 750 نانومتر PDGF (-) لمحلول يحتوي على ضريبة السلع والخدمات (10 نانومتر) و "محول الكيميائية" (500 نيوتن متر) ( -) في ر = 3.5 دقيقة. (ب) إضافة لمعدلة PDGF أبتمر (5 ميكرومتر) (-) لمحلول يحتوي على ضريبة السلع والخدمات (10 نانومتر)، PDGF (750 نيوتن متر)، و "محول الكيميائية" (500 نيوتن متر) (-) في ر = 1.5 دقيقة يؤدي إلى انخفاض فوري في معدل التفاعل الأنزيمي. إعادة طبع بإذن من مرجعية (4). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54396 / 54396fig5.jpg "/>
الرقم 5: التحكم تفعيل دواء مساعد (أ) تفعيل ضريبة السلع والخدمات من JS-K دواء مساعد لاطلاق سراح NO السامة. (ب) لا إطلاق في وجود "محول الكيميائية" ومجموعات مختلفة من ضريبة السلع والخدمات (10 نانومتر) وPDGF (2 ميكرومتر). يعرض الرسم البياني يعني ± الانحراف القياسي من يثلث. تغير بإذن من مرجعية (4). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة منيرفا، ومنظمة HFSP، ومجلس بحوث غرانت الأوروبي (بدءا جرانت 338265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-chloro-2,4-dinitrobenzene Sigma-Aldrich 237329
Acetic acid Bio Lab 01070521
Acetnitrile J.T.Baker 9017-03
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
Copper(II) Sulfate pentahydrate Merck-Millipore 102790
Dimethyl sulfoxide Merck-Millipore 802912
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological Industries 02-023-5A
Ethacrynic acid Tokyo Chemical Industry Co. Ltd E0526
Glutathione-s-transferase M1-1 Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
JS-K Sigma-Aldrich J4137
L-glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251
Magnesium Chloride J.T.Baker 0162
nitrate/nitrite colorimetric assay kit Cayman Chemical 780001
Oligonucleotides W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University custom order
PDGF-BB Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
TBTA Sigma-Aldrich 678937
Triethylamine Sigma-Aldrich T0886
Desalting column GE Healthcare illustra MicroSpin G-25 Columns
HPLC Waters  2695 separation module
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm)
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 10 mm × 50 mm)
Plate reader BioTek synergy H4 hybrid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
  2. Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
  3. Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
  4. Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
  5. Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
  6. Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
  7. Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
  8. Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
  9. DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
  10. Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
  11. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
  12. Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
  13. Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
  14. Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
  15. Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
  16. Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
  17. Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
  18. Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
  19. Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
  20. Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
  21. Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
  22. Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
  23. Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
  24. Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
  25. Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
  26. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 115، إشارة الاصطناعي التنبيغ، استهدفت الافراج عن المخدرات والكيمياء بيوميمتيك، مستقبلات البروتين الاصطناعية، البيولوجيا الكيميائية، المعتمدة على الحمض النووي مستقبلات البروتين، ملفات البروتين للتحويل
محاكاة وظيفة من البروتينات اشارة: نحو الاصطناعي الإشارة العلاج تنبيغ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peri-Naor, R., Motiei, L.,… More

Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54396, doi:10.3791/54396 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter