Summary
この作品は、空気圧、液滴操作プラットフォーム上で多塩基多型を検出するためのシンプルで視覚的な方法を提示します。提案手法では、多塩基多型の液滴操作および検出を含む全体の実験は、高度な機器の助けを借りずに、23℃付近で行うことができます。
Abstract
多塩基多型（MNP）を検出するための簡単かつ視覚的方法は、開放面に空気圧液滴操作プラットフォーム上で行いました。比色DNA検出へのこのアプローチは、金ナノ粒子プローブ（AuNPプローブ）のハイブリダイゼーションを媒介成長に基づいていました。 AuNPの成長の大きさおよび構成は、プローブとハイブリダイズしたDNAサンプルの数によって支配されます。ナノ粒子の特定のサイズ - 及び形状に依存する光学特性に基づいて、プローブへの試料DNA断片におけるミスマッチの数を判別することが可能です。試験は、それぞれの試薬およびDNAサンプルを含む液滴を介して行われ、柔軟なPDMSベースの超疎水性膜の制御された空気圧式吸引搬送空気圧プラットフォーム上で混合しました。液滴が無い側effを持つ生体適合性の高い提案されている空気圧プラットフォーム上でオープン表面上で同時にかつ正確に配信することができます液滴内部のDNAサンプルの電気ショック療法。 2つの推奨方法を組み合わせ、多塩基多型は、空気圧、液滴操作プラットフォーム上で視覚で検出することができます。追加の機器が必要とされません。最終的な結果にプラットフォーム上での液滴をインストールからの手順は、既存の方法よりもはるかに少ない、5分未満を取ります。また、この複合MNP検出アプローチは、マクロシステムのものよりも著しく小さい各操作にのみ10μlのサンプル容量を必要とします。
Introduction
DNA配列中の単一塩基対の差である一塩基多型（SNP）は、最も一般的な遺伝子変異の一つです。現在の研究では、SNPは、疾患のリスク、薬効及び遺伝子機能に影響を与えることにより、個人の副作用と関連していることを報告する。1,2最近の研究はまた、二または多点変異（多塩基多型）は、特定の疾患と個体を引き起こすことを明らかにしました病気の影響の違い。3,4塩基多型の検出は、疾患をプレスクリーニングで、したがって不可欠です。配列特異的オリゴヌクレオチドの迅速な検出のための簡単で効率的な方法が非常に過去20年間に開発された。DNAの突然変異を同定するために1,5の現在のアプローチは、典型的には6,7、 などのプローブ固定化、蛍光標識、ゲル電気泳動などの手順を含みますしかし、これらの方法は、一般的に長い分析プロセス、expenを必要としますSIVE機器、よく訓練された技術者、およびサンプルおよび試薬の大幅な消費。
体積に対する表面積の比率が大きいとユニークな物理化学的特性を持つナノ粒子は、特定のバイオマーカーのための高感度かつ安価な検出プラットフォームとして理想的な材料です。金ナノ粒子（AuNP）が広くオリゴヌクレオチドプローブを用いて変更されるので、それらの優れた能力のDNA検出のために使用される。8-10 SNP検出技法もAuNPを用いて開発された。11-13本研究において、我々は、検出するための新規な比色分析的アプローチを採用しましたAuNPプローブのDNAハイブリダイゼーションにより媒介される成長により多塩基多型（MNP）。14この単純かつ迅速なプロービング方法は、一本鎖DNA（ssDNA）または二本鎖DNA（dsDNA）の多様な長さとコンジュゲートという理論に基づいていますAuNP（ 図1参照 ）AuNPの成長の大きさと形状に影響を与える。15 DNAの検出のこの方法試薬の小さな消費、小さなアッセイ時間（数分）、および臨床診断と国内医療スクリーニングのための将来に向かって適用される熱制御することなく、簡単な手順を提供しています。
感度を向上させるために、DNAの検出限界および特異性を、それらのマイクロ流体システムは、16伝統的な実験プロトコルから進化した、大規模な設備の少ない部品を必要とし、実験プロトコルを単純化し、DNA配列を検出するためのいくつかのマイクロ流体システムが開発されていますバイオセンサー。マイクロ流体システム中のDNAの検出方法は、まだ異種のSNPを同定するための単一の読み出しのために、しかし、信号増幅及び蛍光リーダーのためのそのようなPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）のようなその後の処理の機器機械を必要とする。17,18を単純な開発します直接多塩基多型の結果を読み出すために、後続の処理を行わずプラットフォーム非常に望ましいです。よく使用される、従来、マイクロ流体システムを閉じに比べ、オープン表面マイクロ流体デバイスは有望でサンプル、直接的な環境アクセシビリティと全く容易に形成されていないキャビテーションまたは界面障害物に簡単にアクセスすることができ、このような明確な光路などのいくつかの利点を提供しますチャンネル。19私たちの前の仕事は持っている、このプラットフォーム、液滴が同時に運ばれ、吸引力を用いた駆動エネルギーから干渉されることなく操作することができる上に、オープン表面の液滴操作（ 図2参照）。20のための簡単な空気圧のプラットフォームを導入しました生物学的および化学的用途で大きな可能性。この空気圧プラットフォームは、このようAuNPプローブのDNAハイブリダイゼーションにより媒介される増殖の概念を用いて比色分析的アプローチと組み合わせてMNP検出用DNA試料の操作を実行するために利用されました。
本論文でプロトコルが説明します開放表面上の空気圧液滴操作プラットフォーム上でのマルチ塩基多型の単純な視覚的検出。この作品は、多塩基多型は、肉眼で検出可能であることを確認します。提案された空気圧式プラットフォームは、生物学的および化学的用途に適しています。
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Protocol
MNPを検出するために、1の方法
注：このセクションでは、金ナノ粒子のハイブリダイゼーション媒介成長に基づいて、MNPを検出するための手順を説明します。
- プローブDNA濃度100μMで（5'-チオールGAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 '）溶液を調製します。
- プローブDNA修飾されたAuNP（AuNPプローブ）粒子を準備します。21
注：ここで使用されるボリュームは、プローブDNA修飾されたAuNP（AuNPプローブ）粒子の要件に依存します。多数の実験を実施する上で、したがって依存しています。私たちは通常、スペアとして過剰AuNPプローブ粒子を準備します。このような工程で使用されるボリュームは調整可能で柔軟性のあります。- 濃度1 OD / mlの金ナノ粒子の溶液にプローブDNA（ステップ1.1で調製した100μMの、）（13ナノメートル、17 nM）を追加します。
- ドデシル硫酸ナトリウムの最終濃度をもたらす（NAC 12 H 25 SO 4、SDS）、およびリン酸緩衝液（PBS）、0.01％および0.01 M、respectivelY。
- SDSを維持しながら、20分後、0.01％の塩化ナトリウム（2 M）及びPBS（0.01 M）の溶液を0.05 Mに塩化ナトリウム（NaCl）の濃度をもたらし、20分間インキュベートします。
- 1 M 20を超える分間隔の最終濃度になるように0.1 Mの単位でNaCl濃度を増加させます。
- 23℃でボルテックスミキサーで振とうしながら一晩インキュベートします。揺れの速度であればDNAサンプルとAuNPプローブは、ハイブリダイズになるような実験には影響を与えません。
- 30秒間7000×gで金ナノ粒子を遠心分離し、上清を除去します。
- 25 nMの（AuNPプローブ溶液）の濃度で脱イオン水（DI水）にAuNPプローブ粒子を加えます。
- ターゲットDNA試料の準備（： '; 3塩基対ミスマッチ：5'-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3'; 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3完全に相補的な6塩基対ミスマッチを：5'-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 '）の濃度でそれぞれ0.06、0.11、0.17、0.20、0.30、0.50μM、の。
- NaClでDNAサンプル（350μL）（14μM）にAuNPプローブ溶液（6μlを、25 nM）を追加します。
- DNAハイブリダイゼーションのために5分間23℃でボルテックスミキサーを用いてDNA試料およびAuNPプローブの混合物を振ります。
- AuNPの成長のために、溶液（DNAサンプルとAuNPプローブの混合物）にNH 2 OH（6μlを、400 mM）のとのHAuCl 4（6μL、25.4ミリモル）を追加します。 AuNPの成長が完了するのに約30秒かかります。着色の着実な変化が1時間以上を維持しています。
注意：のHAuCl 4との皮膚接触は深刻な毒性作用が生じる可能性があります。使用前に製品安全データシート（MSDS）を参照してください。手袋を着用し、のHAuCl 4を使用する場合にドラフトチャンバーを使用してください。
空気圧液滴操作プラットフォームの2製作
注：P：PDMSベースの液滴操作プラットフォームは、二つの成分を含み、超疎水性表面と空気チャネル層（5 mm）の有するDMS膜（100ミクロン）。 MEMSプロセスなしに、一般的な機械加工プロセスは、製造のために、この微小流体コンポーネントの迅速なプロトタイピングのための金型、PDMS鋳造および複製を行うためのコンピュータ数値制御（CNC）マイクロマシニングを含むデバイス、およびレーザマイクロマシニングを作製するために利用されました超疎水性表面（ 図3参照）。
- 微細構造を有する（ 図3参照）、PMMAベースのマスター金型を製造するためにドリルビット（0.5ミリメートル）を装備したCNC工作機械を使用してください。ドリルビット7ミリメートル/秒の送り速度と回転26000回転の速度を使用してください。 PMMAのスクラップを削除するには、マスター金型の表面をきれいにするために送風機およびDI水を使用してください。
- 比10にPDMSベースの混合物と硬化剤を準備する：1。 30分間、デシケータ内部、または全ての気泡が除去されるまで、混合物を脱気。
- 目にPDMSを注ぎますEマスターモールドと空気室（PDMS膜）の逆ミクロ構造及び空気チャネル（PDMS層）を得たオーブン中で60℃で3時間、PDMSを焼きます。
- （手で）マスターモールドからPDMS層を取り外します。空気吸引インレット用のPDMS層の穴をパンチ。
- 酸素 - プラズマ処理装置のチャンバー内にPDMS膜、PDMS層とガラス基板を置きます。酸素プラズマ処理した後、10分間ホットプレート（90℃）で一緒にPDMS膜、PDMS層とガラス基板を貼り。
- レーザー切断機（PDMS膜側を上）に、複合チップを入れてください。超疎水性領域（15ミリメートル×12ミリメートル）を定義するための.dwgファイルをインポートします。 図3を参照してください。直接PDMS膜（電力12 W、走査速度106.68ミリメートル/秒）の超疎水性の領域を作成するために、CO 2レーザマシンとPDMS膜を刻みます。
- 洗浄するためにDI水で超疎水性表面を清掃してください表面上の離れた炭化残基。
- 電磁弁を介して空気吸入口と真空ポンプを接続する（ 図4参照）。デジタルI / O USBモジュールとコンピュータと制御に電磁弁を接続します。
空気圧プラットフォーム上のMNPの検出のための3.操作
注：このセクションでは、空気圧、液滴操作プラットフォーム上で比色し、急速にMNPを識別するための動作を説明する（ 図5を参照）。すべてのステップは、23℃（周囲温度）、相対湿度85％で起こります。
- 空気圧液滴操作プラットフォームの超疎水性領域にターゲットDNA試料液滴（10μL、0.5μM）を配置します。
- 空気圧液滴操作プラットフォームの超疎水性領域にAuNPプローブ滴（10μL、25 nM）を配置します。
- 電磁弁とSiとPDMS膜のたわみを生じさせる空気吸引を制御しますmpleプログラム（ 例えば、LabVIEWを）。液滴同士が衝突して合体するように、PDMS膜上（それぞれ標的DNAとAuNPプローブを含む）液滴の移動経路に沿って各空気室の空気の吸引を提供します。 -80キロパスカル（ゲージ圧）の真空ポンプの作動圧力を使用してください。
- 代わりに、手動限り、液滴が完全に混合されるように、エア吸引を制御します。手で、テストの初期段階で管を空気室の真空ポンプと入口を接続したり切断します。
- 電磁弁の制御システムを使用して、3分間混合効率を向上させるために前後合体小滴をロール空気吸引を制御します。標的DNAとAuNPプローブを十分に混合し、3分以内にハイブリダイズなります。それぞれ、駆動周波数と5 Hzから-80キロパスカル（ゲージ圧）の作動圧力を使用します。
- NH 2 OH（2μlを、400 mM）のとのHAuClを含む液滴を配置します空気圧液滴操作プラットフォームの超疎水性領域に4（2μL、25.4ミリモル）。
- 液滴が互いに衝突し、合体させるために、エア吸引（-80キロパスカルゲージ圧）を制御します。順方向および逆方向合体小滴ロールを1分間混合効率を高めるためにできるように、空気吸引（5ヘルツと-80キロパスカルゲージ圧）を制御します。
- 肉眼で合体した液滴の色を測定し、記録します。
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Representative Results
この研究では、3つのDNAサンプルは、AuNPプローブのDNAハイブリダイゼーションにより媒介される増殖を介して、検出の簡単かつ新規な方法を用いて試験しました。プローブDNAと3種類のDNAサンプルの配列は、具体的には、cDNAは議定書のステップ1に記載されている、TMDNA（3塩基対ミスマッチDNA）、およびSixMDNA（6塩基対ミスマッチDNA）を（完全に相補的DNAをプローブします）。ここで試験されたDNA試料のプローブのミスマッチは、DNA試料の中央セグメントの両方である。 図6は、多様な濃度のDNAサンプルの成長AuNP溶液の色を示します 。完全にマッチしたDNA（cDNA）を、溶液の色相は、DNA濃度の増加に伴って透明に次にインジゴにピンクから変化し。 TMDNAのために、ソリューションの色が濃い紫色にピンクから行くし、その後インディゴし、SixMDNAのため、色はDNA濃度の増加に伴って濃いピンクにピンクから行きます。独立したD NAサンプルはAuNPの様々な成長の大きさとソリューションの多様な色を発生させたプローブDNAに変化ハイブリダイゼーション親和性を有しています。 TMDNAサンプルは、プローブからの3つの塩基対変異を有する、AuNPの小さい成長サイズを引き起こしたcDNAサンプル未満のハイブリダイゼーション親和性を有します。 図6の結果が示すように、特に大規模なDNA濃度でCDNAとTMDNAサンプル間の色の違いがあります。プローブと多くのミスマッチを通じ、SixMDNAサンプルがあっても0.2μMより大きいDNA濃度で、AuNPにコンジュゲート数のdsDNAをもたらしたプローブに弱いハイブリダイゼーション親和性を有します。 AuNPの成長サイズは、AuNPソリューションは明らかに肉眼で測定されないアマランサス、にピンク色に変化させる、このSixMDNAサンプルで結果的に小さいです。カラー画像に基づいて、CDNA、TMDNAとSixMDNAはおよそ0.11から0.50μMにDNA濃度のために区別されます。
「FO：=キープtogether.withinページ」_content。ここで紹介するプロトコルと方法では1 ">、オープン表面マイクロ流体のためのシンプルかつ新規な液滴ベースの操作プラットフォームが生成する力として空気圧吸引を使用して実証されましたPDMS膜の表面の変形、液滴の容易な輸送および操作は、液滴（ 図7Aを参照）、この場合の生体試料、DNAを中断することなく達成することができる。MNPの新規かつ視覚的検出はこれに実証されています空気圧オープン表面の液滴操作プラットフォームが。 図7（b）に示すようにその結果、DNAミスマッチの検出は肉眼で容易に観察可能である。元の状態では、AuNPプローブ滴が赤色を呈した。最大の光吸収AuNPプローブは、表面プラズモン共鳴（SPR）に起因する520nmで、で様々なDNAサンプル液滴、完全にCとAuNPの標的プローブDNA二重鎖とのハイブリダイゼーションの後に発生します増加AuNPのSPR機能が消えたようomplementary DNA（cDNA）を試料液滴が透明になりました。これとは対照的に、3塩基対ミスマッチDNA（TMDNA）および6塩基対ミスマッチDNA（SixMDNA）とハイブリダイズAuNPは、それぞれ青と紫でした。このアプローチでは、DNA検出の提案プラットフォームおよび方法が組み合わされ、簡単な方法で達成しました。
AuNPのチオール修飾一本鎖DNAのハイブリダイゼーションからMNP。チオール修飾一本鎖DNA（ssDNA）または二本鎖DNA（dsDNA） の比色検出の図1の原理は 、AuNPの成長の大きさと形状に影響を与えそして、AuNPの多様な光学特性を引き起こした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
空気圧液滴操作プラットフォームの図2模式図。フレキシブルなPDMSベースの超疎水性膜のたわみを発生させる力として空気圧吸引すると、膜上の液滴がそれによって活性化される。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
空気圧液滴操作プラットフォームの図3.製作。製作は、コンピュータ数値制御（CNC）マイクロマシニング、PDMSキャスティングまたは複製技術、およびレーザ微細加工が含まれていた。 ラーグを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のERバージョン。
空気圧液滴操作プラットフォームの図4実験セットアップ。真空ポンプは、空気チャンバ内の減圧を提供するために、液滴操作用のPDMS膜のたわみを生じさせる空気吸引を発生します。真空ポンプ、空気流路の入口は、電磁弁を介して接続されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
このMNP検出技術の動作図5模式図。標的DNAを含む液滴とAuNPプローブがプラットフォーム上にロードされ、混合し、HYBridized。 NH 2 OHとのHAuCl 4の両方を含有する小滴は、プラットフォーム上にロードされ、AuNP成長のために混合されます。最後に、AuNPの標的プローブDNA二本鎖は。吸収極大をシフトして色を変化させ、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図濃度の様々なDNA試料の色の6バリエーション。完全に相補的DNA（cDNA）の場合は、溶液の色相は、DNA濃度の増加に伴ってインジゴピンク色によって異なります。 TMDNAのために、ソリューションの色が濃い紫色にピンクから移行し、SixMDNAのため、色はDNA濃度の増加に伴って濃いピンクにピンクから行く。 LARを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のGERバージョン。
図空気吸引による制御と空気圧プラットフォーム上での液滴輸送の空気圧プラットフォーム上での液滴の7.イメージ。A）連続画像。B）提案空気圧液滴操作プラットフォーム上AuNPの対応する標的-プローブDNA二重鎖の画像。駆動周波数と作動圧の操作条件は、それぞれ5 Hzから-80キロパスカル（ゲージ圧）でした。元の状態では、AuNPプローブ滴が赤色を呈します。 cDNAの存在下でのAuNPの標的プローブDNA二本鎖は透明でした。 TMDNAとSixMDNAとハイブリダイズAuNPプローブは、それぞれ青と紫であった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</ A>
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Discussion
このプロトコルでは、MNPを検出するための単純な比色法は、マイクロ遠心管中で0.11から0.50μMの範囲の濃度で実施することができます。さらに、提案されたMNPの検出方法は、DNAのスクリーニングおよび他の生物医学的用途のための高い可能性を有する空気圧液滴操作プラットフォーム上で実施されます。実際には、サンプルのDNA濃度を検出可能な範囲は、オペレーティングプラットフォームの混合効率に依存します。合体した液滴が完全に混合されることを保証するために、このプロトコルで重要なステップは、合体した液滴の大きさに依存する空気吸引（圧力および周波数）の制御です。完全に相補的サンプルDNAとのミスマッチのサンプルDNAとのハイブリダイゼーションの親和性の相違は、長いDNA配列断片について肉眼で区別することは困難です。この検出技術の限界は、従って、試料DNAの断片長です。長いDNとサンプルについて配列サイズまたは成長AuNPの立体配座は、種々のミスマッチを含有する多様なDNAサンプルと同様です。プローブのDNAサンプルの不一致は、このプロトコルで中間セグメントに表示されます。同一の長さとサンプルDNAのホモマーのミスマッチにより、ミスマッチの位置はまた、ハイブリダイゼーションの親和性とAuNPの成長の大きさに影響を与える可能性があります。多くの病気は、現在、特定の欠陥遺伝子にトレースされています。特定の病気のためのゲノムデータベースは依然として拡大し、改善しています。特定のDNA断片のDNA配列の変化は、特定の疾患の原因であることが確認されたら、（DNAの適切な長さおよびミスマッチの位置で）特別に設計されたプローブと試料DNAのミスマッチの数を取得するために使用することができ基づいて検出可能な濃度範囲内のプローブは、すでにこの作業でテストしました。
提案された空気圧液滴操作プラットフォームが実行されオープンな環境で編。液滴の蒸発は、DNA試料の濃度を増加させ、比色分析読み取りの精度に影響を与えます。 MNP分析の精度を向上させるために、制御された環境温度と湿度が必要です。レーザマイクロ加工は、提示プラットフォームに超疎水性表面を作製するために適用しました。 PDMS膜の超疎水性は、液滴操作（> 20倍）の多くの繰り返しの下で保持されません。超疎水性の損失は、この液滴操作プラットフォームの機動性と操作性を低下させます。液滴操作プラットフォームたら（リピートが2.6から2.8ステップ）が必要であるPDMS膜の超疎水性をremodifying、表面に超疎水性を失います。より耐久性のある超疎水性表面の簡単な製造が今後検討中です。このプロトコルでは、目を制御するために、（データ収集装置と）電磁弁と単純な制御プログラムを使用し電子の空気吸入。吸気の制御は、他の方法または装置を含むが、電磁弁の使用に限定されないで使用することができます。
本稿では、我々は、DNA検出の単純な比色法と空気圧液滴操作プラットフォームの組み合わせを導入しました。両方の技術は、ユニークで非常に前向きです。私たちは、同じ結果を達成するために（つまり、迅速かつ視覚の両方である）は、代替のDNA検出法を発見しました。 optowetting含むオープン表面上の複数の液滴操作技術は、22誘電泳動、23エレクトロウェッティング、24振動25と魔法瓶、毛細管作動26が報告されています。すべてのこれらの液滴操作技術の欠点は、我々の以前の研究で議論された。20提案空気圧プラットフォームは前述の方法よりも生体適合性です。
この技術は、O、多塩基多型を検出します空気圧液滴操作プラットフォームナサンプルおよび試薬は直接ロードし、ピペットを用いて収集することができることを意味する、生化学分野の研究者のために簡単です。提示プラットフォームの統合は、自動制御システムと将来の改善され広く使用するためのユーザインタフェースの設計で行われています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5'-end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
References
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