Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Быстрая и конкретная оценка галогенирующего пероксидазной активности в лейкоцитами обогащается проб крови

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54484
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Abstract

В данной работе протокол для быстрого и стандартизированного обогащения лейкоцитов из небольших образцов цельной крови описана. Эта процедура основана на гипотонического лизиса эритроцитов и может быть применен к человеческому образцов, а также в крови нечеловеческого происхождения. Небольшой начальный объем пробы от около 50 до 100 мкл делает этот метод применим к рецидиву забора крови из мелких лабораторных животных. Кроме того, обогащение лейкоцитов достигается в течение нескольких минут и с низкими усилиями материалов, касающихся химических веществ и приборов, что делает этот метод применяется в нескольких лабораторных условиях.

Унифицированная очистка лейкоцитов в сочетании с высокой селективностью методом окрашивания для оценки галогенирующего пероксидазной активности гема пероксидаз, миелопероксидазы (МРО) и эозинофилов пероксидазы (ЕРО), т.е. образованием хлорноватистой и бромноватистой кислоты (HOCl и HOBr). В то время как MPO сильно выражен в NEUTrophils, самый распространенный тип клеток иммунной в крови человека, а также в моноцитах, соответствующий фермент ЭПО экспрессируется исключительно в эозинофилов. Галоидирующим активность этих ферментов решается с помощью почти HOCl- и HOBr специфичную аминофенил краситель флуоресцеин (ФПА) и первичный пероксидазы пероксид водорода субстрата. При последующем анализе проточной цитометрии все пероксидаза-положительных клеток (нейтрофилы, моноциты, эозинофилы) различимы, и их активность пероксидазы галогенирующего может быть определена количественно. Так как ПФА окрашивание можно комбинировать с применением маркеров клеточной поверхности, этот протокол может быть расширен, чтобы конкретно рассмотреть лейкоцитов подфракций. Метод применим для обнаружения HOCl и HOBr производства как в человеке и в грызунах лейкоцитах.

Учитывая широко и разнообразно обсудили иммунологическая роль этих ферментных препаратов при хронических воспалительных заболеваниях, этот протокол может способствовать лучшему пониманиюиммунологическая значимость лейкоцитарного происхождения гем пероксидазы.

Introduction

Полиморфно - ядерных лейкоцитов (PMNs, называемые также гранулоциты) и моноциты представляют собой важные клеточные компоненты врожденной иммунной системы в 1,2 крови. Они способствуют лучшей защиты от патогенных микроорганизмов, а также к активации приобретенной иммунной системы и инициирования системного воспалительного ответа 2-4. Тем не менее , особенно нейтрофилы, наиболее распространенный тип гранулоцитов и моноцитов также вносят значительный вклад в регуляции и прекращения острых воспалительных явлений 5. Таким образом , эти клетки могут также играть важную роль в хронических воспалительных заболеваний , таких как ревматоидный артрит 6,7. На самом деле, астма, хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, характеризуется нарушением апоптоза эозинофилов, второй наиболее гранулоцитов типа в крови 8. Тем не менее, апоптозом гранулоцитов и их быстрое удаление макрофагами два основных шага в процессе клеточного прекращениявоспаления 9-11.

В названных иммунных клеток два тесно связанных ферментов, а именно миелопероксидазы (МРО, нейтрофилы и моноциты) и эозинофилов пероксидазы (ЕРО, эозинофилов) можно найти 12,13. Эти гем пероксидазы классически связаны с гуморального иммунного ответа , как они два в электронном виде окислить (псевдо-) галогениды к соответствующему гипо (псевдо) halous кислоты , которые известны своими бактерицидными свойствами 14-16. В физиологических условиях MPO в основном формы хлорноватистой кислоты (HOCl) и hypothiocyanite (- OSCN) в то время как последний и бромноватистая кислоты (HOBr) образованы EPO 17-19. Новые результаты свидетельствуют о том, что это (псевдо-) активность фермента галогенирования может также способствовать регуляции воспалительных реакций и к прекращению иммунных реакций 20,21. На самом деле, производство HOCl МРО и полученных из них продуктов были показаны для подавления клеток на основе адаптивного иммунного ответа Т - 22-24.

Для того чтобы получить более полное представление о иммунологической роли лейкоцитов от врожденной иммунной системы при хронических воспалительных заболеваниях, а также определения вклада MPO и ЕПВ к этой физиологической функции мы разработали метод, позволяющий быстро обогащать лейкоциты из небольших образцов крови для последующего специфического определение активности галогенирующего пероксидазы в этих клетках. Для разрушения эритроцита мы выбрали стандартный метод, включая два последующих гипотонических шагов лизиса с дистиллированной водой, что приводит к быстрому обогащению лейкоцитов при низких материальных затратах. Для последующего определения галогенирующего MPO и активности ЕРО HOCl- и HOBr специфические аминофенил краситель флуоресцеин (APF) использовали 25-27. В отличие от применения методов окрашивания неспецифическое пероксидазы 28,29, этот подход позволяет избирательно обнаружение активности галогенирования пероксидазы, которая часто нарушенную при тяжелой Влиянammation 30,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все образцы крови человека были получены от здоровых добровольцев и приложенное протокол обогащения лейкоцитарной следует рекомендациям комиссии по этике медицинского факультета Лейпцигского университета. Эксперименты с крысиной крови были утверждены ответственным местным этическим комитетом (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), в соответствии с немецкими руководящими принципами по уходу за животными и использованию.

1. Экспериментальная установка

Примечание: По мере того как гипотонический процедура лизиса для разрушения эритроцитов из образцов крови является процедурой , критичные по времени, подготовить все необходимое оборудование (например, буферов) для этой части протокола заранее.

  1. Добавьте один 15 мл центрифужную пробирку для гипотоническим лизисом и один 1,5 мл пробирку для последующего аминофенил флуоресцеина (ФПА) окрашивания на образце крови.
    1. Если обогащение лейкоцит будет выполняться в стерильных условиях, выполнения этой маркировки в потокекоробка.
  2. Приготовьте около 12 мл фосфатно-солевого буфера (PBS, 10 мМ) в расчете на образце. В зависимости от того, будет ли лейкоциты быть выделены в стерильных условиях или нет, готовят PBS, либо с помощью стерильного готовое решение от поставщика или путем растворения PBS таблетки в дистиллированной воде. Проверьте значение рН и, при необходимости, регулировать до рН 7,4 с помощью небольших количеств 0,1 М HCl растворов и NaOH.
    1. Растворите PBS таблетки (см Таблицу материалов) в 200 мл дистиллированной воды, чтобы получить нестерильный буферного раствора, достаточное для около 16 образцов. При желании, стерилизовать этот раствор подвергают стерильной фильтрации.
  3. Приготовьте около 1 мл раствора Хэнкса сбалансированный солевой (HBSS) с добавлением Ca 2+ на выборку.
    1. Растворить 970 мг HBSS соли в 100 мл (конечный объем) дважды дистиллированной воды. Перед заполнением до конечного объема, проверьте значение рН и отрегулировать его до рН 7,4. Благодаря низкой буферной емкости, подготовить этот буфер свеже каждого дняd выполнить корректировку рН с особой осторожностью при использовании небольших количеств 0,1 М растворов HCl и NaOH.
      Примечание: стерильный раствор может быть использован в зависимости от эксперимента. Раствор может быть стерилизована путем стерильной фильтрации.
  4. Кроме того, два буфера, этикетки и подготовить трубку (например, 50 мл центрифужную пробирку) или колбу (например, 250 мл мерный стаканчик) с дважды дистиллированной водой для гипотонического лизиса процедуры заранее. Приготовьте около 10 мл воды на образце.
  5. Подготовьте контейнер с колотым льдом для окрашивания ФПА (раздел 3), которая выполняется на льду.
  6. Подготовить аликвот APF заранее, чтобы обеспечить быструю подготовку рабочих растворов, используемых в процессе окрашивания (шаг 3.2) и во избежание неоднократно замораживания и оттаивания раствора ФПА.
    Примечание: ПФА обычно получают в виде 5 мг / мл (11,81 ммоль) раствора в метиловом эфира уксусной кислоты.
    1. Замораживание аликвот 10-100 мкл в 0,5 мл пробирки. Для НФА окрашивания окончательныйконцентрация красителя 10 мкМ используется (шаг 3.8).

2. гипотоническим лизисом в эритроцитах

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги гипотонические лизиса (за исключением стадий центрифугирования) под лавкой ламинарного потока, чтобы избежать загрязнения. Выполните всю процедуру при комнатной температуре. По мере того как гипотонический лизис является критическим процессом времени, корректировать пипетки для воды (2 мл) и PBS (5 мл) добавлением заранее и открыть воду и колб PBS перед началом процедуры. Хранить раствор PBS и дистиллированную воду при комнатной температуре перед использованием.

  1. Из каждой передачи пробы крови по 100 мкл в соответствующий 15 мл центрифужную пробирку.
    Примечание: В наших экспериментах образцы крови, как правило, содержат 10 ед / мл гепарина, чтобы избежать коагуляции. Тем не менее, из-за различных источников материала образца природы и концентрации антикоагулянта могут отличаться. Его влияние на окрашивание APF должен быть проверен ComparИнг результаты к результатам, полученным из образцов крови, дополненных другими типами или концентрации антикоагулянта.
  2. Добавляют 2 мл дистиллированной воды и смешивают образцы с использованием вихревой смеситель установлен на среднем уровне. Инкубируйте образцы в течение 60 секунд, затем добавляют 5 мл PBS на пробу и перемешать с помощью вихревой мешалки.
    Примечание: приблизительно до 5 образцов могут быть получены параллельно. Держите заказ образца то же самое для добавления воды и PBS для достижения сопоставимых времени инкубации.
  3. После регенерации изотонических условий путем PBS добавлением (этап 2.2) гранулах оставшиеся интактных клеток во всех образцах центрифугированием в течение 6 мин при комнатной температуре и 450 х г.
  4. Удалить супернатант, выливая в мусорную таблицу отходов. Удалить как можно больше жидкости, как это возможно с помощью инвертирующего центрифугировании трубки и нарезание резьбы отверстие на бумажное полотенце. Убедитесь в том, что осадок клеток является как можно более сухой.
  5. Повторите процедуру гипотонического лизиса, как описано выше (этап 2.2).
    NОТЕ: В принципе эта процедура гипотонический лизис (шаги 2,3 до 2,5) может быть повторен несколько раз, в зависимости от чистоты смешанной лейкоцитарной фракции, которые будут получены. После того, как два лизис шаги доли оставшихся Эритроциты в полученной фракции смешанной клеток составляет около 25%.
  6. Гранул интактными клетки центрифугированием в течение 6 мин при комнатной температуре и 450 х г. Удалить супернатант (этап 2.4). Добавить 500 мкл HBSS к осадку и осторожно растворить его, пока не будет получен гомогенный раствор. Передача каждого образца с соответствующим образом меченного пробирку объемом 1,5 мл.
  7. В зависимости от эксперимента непосредственно анализировать полученные образцы (например, посредством проточной цитометрии) 25, пятно с флуоресцентных-меченых антител (для идентификации отдельных типов клеток) 32, инкубировать с сотовыми раздражители (для экспериментов активации клеток) 33 или хранили на льду и использования позже. В зависимости от цели исследования, сразу же выполнить последующие эксперименты посмешанная лейкоцитарной фракции, так как гранулоциты имеют достаточно короткий период полураспада около 20 часов.
    Примечание: Это также справедливо и для окрашивания пероксидазой активность, как описано ниже.

3. галогенирующим пероксидазной активности Окрашивание

Примечание: HOCl- и HOBr производство по крови, полученных гем пероксидазы MPO и ЕРО количественно с помощью APF, который окисляется до флуоресцеина названными гипогалогеновую кислот. Поэтому, если мечения клеток с флуоресцентно-меченного антитела проводят в комбинации с ФПА окрашиванием, избежать флуорофоры, которые мешают сигнала эмиссии флуоресцеина.

  1. Выполните APF окрашивание при 4 ° С на льду.
  2. Для приготовления рабочего раствора APF оттаивать соответствующий аликвоты красителя (например, 10 мкл, 11,81 ммоль) и разбавить его с HBSS точно 1 мМ (например, добавляют 108,1 мкл буфера в 10 мкл).
    1. Для каждого образца (500 мкл раствора клеток) подготовить 5 мкмл описанного рабочего раствора ФПА. Соответственно, использование одного 10 мкл аликвоты ФПА (11,81 мМ), что дает 118,1 мкл рабочего раствора АТФ (1 мМ), чтобы подготовить около 20 образцов. Из-за потери во время подготовки пипеткой примерно на 10% больше APF рабочего раствора, чем рассчитанное.
  3. Для того , чтобы проверить пероксидазной специфичность окрашивания ФПА, подготовить контрольные образцы с ингибитором пероксидазы гема гидразида 4-аминобензойной кислоты (4-Abah) 35.
    1. Приготовьте 1 М маточного раствора 4-ABAH (151,17 г / моль) в диметилсульфоксиде (ДМСО), путем разбавления 75,6 мг 4-ABAH в 500 мкл растворителя. Далее разведите 4-Abah 1/10 в HBSS.
  4. Для получения метки H 2 O 2 рабочего раствора два 1,5 мл центрифужные пробирки с "70 мм H 2 O 2" и "7 мМ H 2 O 2" соответственно.
    1. В трубке с надписью "70 мМ H 2 O 2", свеже разбавленных 10 мкл30% -ного раствора (8,8 мМ) H 2 O 2 , используя 990 мкл дистиллированной воды , чтобы получить концентрацию около 88 мМ. Хранить на льду и использовать в течение 4 часов.
      Примечание: H 2 O 2 , как правило , поставляется в виде 30% раствора поставщиками. При хранении при 4 ° С, она стабильна в течение 3 лет. Выполните разведений H 2 O 2 в дистиллированной воде , чтобы избежать разложения. H 2 O 2 разведений также могут быть получены в 0,1 М растворе NaOH.
    2. Для определения точной H концентрации 2 O 2 , подготовить еще 1 до 10 разбавление от первого H 2 O 2 маточного раствора (около 88 мм) путем добавления 100 мкл из этого раствора до 900 мкл дистиллированной воды в 1,5 мл пробирку "7 мМ H 2 O 2".
    3. Запись спектра в диапазоне вблизи УФ (например, 200-300 нм) с использованием UV-VIS photospectrometer и использовать оптическую плотность при длине волны 240 нм (49; 240 = 34 М -1 см -1) , для определения фактической концентрации H 2 O 2 во втором H 2 O 2 исходного раствора 34. Убедитесь в том, что ссылка кювета содержит только дистиллированную воду. Для измерения использования кварцевых кюветах как спектр в УФ-диапазоне записывается.
    4. Из этого результата, рассчитать точные концентрации обоих H 2 O 2 растворов. Отрегулируйте концентрацию первого маточного раствора в "70 мМ H 2 O 2" пробирку ровно 70 мМ путем добавления соответствующего количества дистиллированной воды. Хранить полученный рабочий раствор на льду и использовать в течение одного часа.
  5. Добавьте 5 мкл рабочего раствора 4-ABAH (100 мМ) к соответствующим образцам для конечной концентрации 1 мМ. Инкубируйте образцы в течение 15 мин при 37 ° С в инкубаторе перед ФПА того.
  6. Добавьте 5 мкл рабочего раствора APF (1 мМ), чтобы каждый500 мкл образца, чтобы получить конечную концентрацию красителя 10 мкМ. Смешайте образцы осторожно (например, с помощью вихревой мешалки на среднем уровне) и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С.
  7. Добавьте 5 мкл H 2 O 2 рабочего раствора (70 мМ) для каждого образца 500 мкл для конечной концентрации 700 мкМ. Аккуратно перемешать образцы и инкубировать их в течение 60 мин при 37 ° С. Выполните соответствующие контрольные измерения параллельно.
    Примечание: Контрольные измерения показали , что 700 мкМ H 2 O 2, не токсичны для клеток. любые существенные клеточные реакции также не наблюдалось.
    Примечание: Окрашивание ПФА также может быть выполнена путем исключения добавления H 2 O 2, в зависимости от научного вопроса. При отсутствии перекиси водорода только базальный хлорирование МРО и активность ЕРО определяют в то время как добавление H 2 O 2 позволяет детектировать максимальной HOCl и HOBr производства клетками. Tон последний означает значительно более высокий флуоресцентного сигнала.
  8. Для дражирования клетки, Центрифуга образцов в течение 10 мин при комнатной температуре и 400 х г. Тщательно удалите супернатант без разрушения гранул и добавьте 250 мкл HBSS для ресуспендирования клеток.
    Примечание: Образцы теперь готовы для анализа с помощью проточной цитометрии 25.
  9. Храните образцы в темноте до анализа, чтобы избежать отбеливания. После возбуждения при 480-490 нм обнаружить излучение флуоресцеина при приблизительно 525 нм 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Как сообщалось ранее описанный выше метод оказался применим как к человеку , и к материалу , не являющегося человеком 32. Кроме того, как показано на мышах с астматическими симптомами окрашивание APF может быть подходящим инструментом для определения различий в системном провоспалительного статуса. Поэтому в последующем исследовании мы использовали этот протокол повторно оценить галогенирующего активность MPO (EPO) и у самок крыс Dark агути с пристаном индуцированного артрита (PIA). Характерным примером обогащения лейкоцитарного и окрашивания , выполненной в течение этого эксперимента показан на рисунке 1. Около 200 мкл цельной крови получали из ретробульбарное венозных сплетений животного под наркозом и гепарином. Истощение эритроцитов и последующее ПФА окрашивание проводили с использованием 100 мкл объема образца. После этого образец анализировали с помощью проточной цитометрии.

(рис 1А), сильное истощение эритроцитов из образца была достигнута. Кроме того различные типы лейкоцита были четко различимы, которые были идентифицированы с применением флуоресцентно-меченного маркеров клеточной поверхности (не показаны). Кратко эритроцит (CD235a-положительных) / мусора область клеток приходилось лишь 22% случаев, а около 48% событий были идентифицированы как CD16-положительных нейтрофилов. Кроме того 3% событий были идентифицированы как каждый CCR3-положительных эозинофилов и CD14-позитивных моноцитов и около 19% событий приходилось CD5 / CD19-положительных В и Т-лимфоцитов, соответственно. Распределение интенсивности APF-производной флуоресценции (рис 1B) , очевидно , допускается дискриминация пероксидазы-отрицательных эритроцитов и лимфоцитов в то время как моноциты и эозинофилы привело к небольшому окислению ФПА и нейтрофилы были сильно пероксидазой положительным при чOSEN условия проведения эксперимента. Эти результаты согласуются с высоким изобилием МРО в последних клетках по сравнению с концентрацией фермента в моноцитах 20. Относительно слабый отклик эозинофилы можно объяснить тем, что ни один бромид не был добавлен, который, возможно, побудила ЭПО-производный образование HOBr. Предварительные исследования на изолированных эозинофилов на удивление не показали большое влияние добавлялся бромида на окисление ФПА этими клетками. Тем не менее, окисление ФПА по эозинофилов наблюдалось что может быть объяснено введением небольших количеств Br - с помощью буферных растворов , используемых (PBS , и HBSS). В качестве альтернативы EPO может также производить небольшие количества HOCl, по крайней мере , в кислых условиях (например, в фаголизосомах).

Рисунок 1
Рисунок 1: Лейкоцита обогащение и APF-Выведитеd флуоресценции в крови микро-образце , взятом у крыс. в количестве примерно от 200 мкл цельной крови получали из ретробульбарное венозных сплетений женского Темное Агути крысы. После применения описанной процедуры гемолиза до 100 мкл крови и последующего ФПА окрашивая фракцию смешанную клеточную анализировали с помощью проточной цитометрии. Как показано с помощью FSC- / SSC- участок (А) Эритроциты сильно истощены из образца , и различные типы лейкоцитов может быть легко отличить. Распределение APF-производной интенсивности флуоресценции (B) ясно показали гем пероксидаза-отрицательные клетки (эритроциты и лимфоциты), а также лейкоциты с умеренным (эозинофилов и моноцитов) или сильных (нейтрофилы) галогенирования пероксидазной активности. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра большая версия этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поскольку нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоциты в крови человека выделение пероксидаза-положительных клеток , фокусирует часто только на этих клетках , и включает в себя отделение нейтрофилы от других лейкоцитах путем центрифугирования в градиенте плотности 38. Тем не менее , как нейтрофилы гораздо менее распространены в мышиных образцах крови 39 для последних более сложные методы должны быть использованы 40. Кроме того , оба метода также приводит к удалению пероксидаза-положительных моноцитов из образцов , и, в связи с необходимостью больших объемов крови (например, 400 мкл 41), не применимы к микро-образцах , полученных в процессе возвратного забора крови из мелких лабораторных животных 38,40. Очистка мышиных нейтрофилов из перитонеального экссудата также нуждаются в жертву животных и, кроме того, не дает крови , полученных гранулоцитов 38,40. В последнее время разработаны методы для получения высокой степени очистки гранулоцитов фракций от мышиного блООД (например, применение антител) часто являются дорогостоящими, сложными и трудоемкими 40,42,43 и снова акцентировать внимание только на очистку одного пероксидазой положительного типа лейкоцита.

Таким образом, метод, представленный здесь имеет несколько преимуществ по сравнению с другими методами, применяемыми для очистки пероксидаза-положительных лейкоцитов. Как она основана на небольших образцах крови полученные клетки представляют ситуацию в обращении. Из-за небольшого первоначального объема выборки, необходимого для протокола метод применим как к человеку и не-человеческой крови, несмотря на присущие конкретным видам различия в численности нейтрофилов. На самом деле, мы даже смогли применить метод, описанный в начальный объем крови лишь 50 мкл (данные не показаны). Небольшой образец крови необходим для метода также делает его пригодным для многократного забора крови из мелких лабораторных животных или для специальных медицинских применений (например, новорожденных диагноз). В тон Обогащение лейкоцитарный основан на истощении эритроцитов всех пероксидаза-положительных клеток (нейтрофилы, эозинофилы, моноциты), включаются в полученной смешанной лейкоцитарной фракции и может быть по отдельности анализировали с помощью проточной цитометрии. Метод является быстрым, надежным и имеет низкие требования в отношении химических веществ и приборов, что делает протокол подходит для нескольких научных средах.

Поскольку нейтрофилы легко активируются один важный шаг в процессе описанного способа является точное регулирование величины рН буферных растворов, используемых в США (PBS и HBSS, см шаги 1.2 и 1.3 раздела протокола). Не Кроме того, время инкубации клеток крови с помощью дистиллированной воды должна быть не более чем на 60 секунд перед восстановлением normosmotic условий (см шаг 2.2 раздела протокола. (почти) полностью удаление растворителя из клеточного осадка (шаг 2,4) перед добавлением воды для второго гипотонического лизиса является еще одним важным шагом в качестве положительного эффектаэр остатки уменьшит эффективность процедуры гипотонического лизиса. Другим важным шагом относится к применению H 2 O 2 во время окрашивания ФПА. Несмотря на то, нанесенное количество не должно быть цитотоксическое, жизнеспособность клеток должна быть проверена. В ходе наших исследований мы, как правило, применяют краситель 5,5 ', 6,6'-тетрахлор-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine йодид (JC-1) для обнаружения ранних апоптотических событий.

Кроме того, есть несколько ограничений в описанном упрощенном способе обогащения лейкоцитов. В то время как этот метод может быть применен к образцам крови из нескольких видов (человек, крыса и мышь были опробованы), количество лейкоцитов, полученный после лизиса эритроцитов, зависит от их первоначального избытке в крови. Последнее , конечно , зависит от вида животного и 39 также зависит от воспалительного состояния зондируемой индивидуума. Кроме того, в то время как процедура лизиса может быть сделано с до однойСто образцов параллельно промежуточные стадии центрифугирования накладывает ограничения как, в зависимости от используемого центрифуге, только до 30 образцов могут быть обработаны параллельно. Кроме того, в то время как ПФА легко обнаруживает HOCl и HOBr в присутствии SCN -, галогенирующего активность МРО и ЕПВ также влияет на последней псевдо-галогенида. Тем самым hypothiocyanite (- OSCN) формируется которая не способна окислять APF. Еще одно ограничение исходит из свойств красителя ФПА, используемого для определения HOCl- и HOBr производства МРО и EPO. По мере того как краситель окисляется до флуоресцеин, окрашивание не может быть объединено с флуоресцентными антителами с спектра излучения в том же диапазоне. Конечно, любые помехи между APF-производной флуоресценции и сигнала дополнительных флуоресцентных сигналов должны быть проверены и компенсируются в проточном цитометре.

В противном случае, если обнаружение активности галогенирующего пероксидазы не объем формулыизучение, после применения метода истощения эритроцитарной другие аналитические методы могут быть использованы вместо ФПА. По мере того как описано гипотонический лизис процедура приводит лишь к частичному истощению эритроцитов и, как и все лейкоцитарного все еще присутствуют в полученной смешанной клеточной фракции, только методы, которые позволяют одному анализ клеток должен быть применен. Методы , которые включают в себя лизис клеток (например, Вестерн - анализ участка) не даст достоверных результатов. Небольшой начальный объем пробы может быть еще одним препятствием для таких аналитических методов.

Что касается расследования MPO (EPO) и активность в лейкоцитах часто только общее производство окислителем клетками рассматривается вместо конкретно оценки пероксидазной активности гем 44,45. К тому же часто никаких попыток не делаются различия между галогенированием и пероксидазной активности MPO и ЕПВ 46,47. Методы, в которых конкретно рассматривается Хлорирующим MPO активность по Quantifying HOCl-производные продукты , такие как chlorotyrosine не обнаруживают чрезмерно окисляется и / или метаболизируется продуктов и, таким образом, часто приводят к недооценке реального HOCl производства 48. Кроме того , этот метод, а также обнаружение HOCl-производного 2-chloroethidium также отнимает много времени, дорогостоящие аналитического оборудования и включают лизис клеток 48-50 .Существует много сообщений о новых красителей для конкретного определения МРО активности хлорирующим в жизненно важных клеток 44,51,52. Тем не менее , на сегодняшний день только ПФА и связанное с ним соединение гидроксифенил флуоресцеина (ФВЧ) , являются коммерчески доступными и , следовательно , обычно используемый в исследованиях 25,33.

На самом деле, с помощью APF мы могли бы показать , что хлорировать МРО активность не может быть определена количественно только с использованием выделенного фермента 53 , но и путем применения красителя для живых клеток 26,33. Таким образом, комбинируя быстрое обогащение лейкоцитов из крови микроорганизмов, указанных выше образцов сп APF окрашивания мы разработали протокол, который подходит конкретно и одновременно обратиться к галогенирующего активности MPO и EPO во всех пероксидазой положительных лейкоцитов, т.е. нейтрофилы, моноциты и эозинофилы 32. Кроме того, метод не требует лизис клеток, что позволяет широкий спектр аналитических методов, в том числе проточной цитометрии и конфокальной флуоресцентной микроскопии. К тому же эта Окрашивание активность пероксидазы можно сочетать с применением маркеров клеточной поверхности, что позволяет конкретный анализ лейкоцитарных субфракций, в зависимости от научной задачи. Тем не менее, он должен считать, что приложенное флуоресцентно-меченного антитела не мешают флуоресцентного сигнала флуоресцеина на основе используемого для количественного определения HOCl- и HOBr производный окисление РАП.

Таким образом, этот метод может предоставить новый инструмент, чтобы получить больше понимания в физиологической роли галогенирования пероксидазной активности иммунологической реЛевант происходящие из крови пероксидазы MPO и ЕРО, который до сих пор не очень хорошо понимал 8,20,23. К тому же в животном исследовании ревматоидного артрита мы могли наблюдать в последнее время, что этот протокол может привести к оценке МРО-производного производства HOCl в качестве нового клинического маркера при хронических воспалительных заболеваниях (неопубликованные данные).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 -
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE -
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g., 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe -
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 -
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge Eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1 M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
  2. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
  5. Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
  6. Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
  7. Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
  8. Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
  9. Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
  10. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
  11. Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
  12. Loughran, N. B., O'Connor, B., O'Fagain, C., O'Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
  13. Zámocký, M., Obinger, C. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. Torres, E., Ayala, E. M. , Springer. 7-35 (2010).
  14. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
  15. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
  16. Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
  17. Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
  18. Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
  19. van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
  20. Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
  21. Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
  22. Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
  23. Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
  24. Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
  25. Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
  26. Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
  27. Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
  28. Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
  29. Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
  30. Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
  31. Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
  32. Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
  33. Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
  34. Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
  35. Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
  36. Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
  37. Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
  38. Hu, Y. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. Ashman, R. B. , Methods in Molecular Biology. Springer. 101-113 (2012).
  39. Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
  40. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
  41. Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
  42. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  43. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
  44. Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
  45. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  46. Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
  47. Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
  48. Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
  49. Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
  50. Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
  51. Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
  52. Sun, Z. -N., Liu, F. -Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
  53. Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).

Tags

Immunology выпуск 113 подготовка крови обогащение лейкоцитов миелопероксидазы эозинофилов пероксидазу хлорирование активность аминофенил флуоресцеина
Быстрая и конкретная оценка галогенирующего пероксидазной активности в лейкоцитами обогащается проб крови
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flemmig, J., Schwarz, P.,… More

Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter