Summary
分解性感温ハイドロゲル ヒドラゾン架橋高分子オリゴマー バルク スケール、マイクロ スケール、およびナノスケール、ゲル粒子・ ナノファイバーの調製のための後者のに基づいて作製のためのプロトコルを説明します。
Abstract
その究極の臨床使用を生物学的関連性の欠如によって妨げられている様々 なスマート材料は、さまざまな生物医学アプリケーション (例えばドラッグデリバリー、ティッシュ エンジニア リング、バイオ イメージングなど) の検討されている間最もスマート材料の観察の劣化。特に、ほぼ一様に、機能的分解性ポリマーに基づく温度応答性ハイドロゲルのです (例えばpoly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) または (oligoethylene リコール ポリメタクリル酸 (POEGMA)).可変セル材料相互作用、潜在的な theranostic 材料細胞骨格のリモート制御や代謝規制薬物送達の課題に感温ハイドロゲルの可能性を効果的に翻訳するなど、イメージングとドラッグデリバリー システムと他のアプリケーションのメソッドは (完全分解ではない) の場合、少なくとも腎クリアランスの材料の必要な有効期間を次のことができる、ヒドロゲルをレンダリングに必要なです。そのために、このプロトコルはヒドラジドと分子のアルデヒド官能基化 PNIPAM または POEGMA オリゴマーの反応に基づいて複数の長さスケールで加水分解分解ヒドラゾン架橋ハイドロゲルの調製をについて説明します。腎の濾過限度以下の重み。具体的には、分解性感温一括ヒドロゲル (ダブル バレル シリンジ法を使用して) を作製する方法ヒドロゲル粒子 (同時混合を促進するマイクロ流体プラットフォームを使用して両方のマイクロ スケールで、前駆体ポリマーの熱対流を使用してナノ乳化自己架橋法と)、ハイドロゲル ナノファイバー (反応性エレクトロスピニング戦略を使用して) 記述されています。それぞれのケースで従来自由ラジカル架橋プロセスを介して達成に類似した温度応答性のプロパティを持つハイドロゲルを達成することができます、しかし、ヒドラゾン架橋ネットワークは、オリゴマーに再編成する時間の経過と共に低下する可能性が前駆体高分子と有効にするクリアランス。そのため、(これが一般的、合成に応用水溶性ポリマー、スマート材料なだけではなく) これらのメソッドは合成スマート材料臨床応用への移行が容易になります期待しています。
Introduction
スマート材料は、外部および/または環境の信号にリバーシブルの「オンデマンド」応答のための潜在性ための重要な注目を集めています。温度応答性材料は温度 T での沈殿物の温度駆動の結果下の臨界溶液温度 (LCST) 動作により特定の関心を集めている > LCST1,2。感温ハイドロゲルのコンテキストでこの下限臨界溶液温度現象は可逆 swelling/腫れイベント一括温度可変サイズの結果によって明示される (T で大きく < LCST)3細孔のサイズ (大きい T で< LCST)4、および界面特性 (T で親水性 < LCST)5。このような遷移は、ドラッグデリバリーに広く適用されている (外部または環境にトリガー可能な薬物4,6,7をリリース)、組織エンジニア リングと細胞培養 (可逆細胞粘着のため/はく離8,9,10)、(切替可能な膜の気孔率と浸透率またはサーマル リサイクル可能の診断サポート11,12,の版13)、マイクロ流体処理 (オン ・ オフ弁の流れ14,15を調整する)、およびレオロジー修飾子 (の温度可変粘性16)。重要な (そして増加) 仕事も oligoethylene リコール (ポリメタクリル酸に行ったものの、最も一般的感温ハイドロゲルは、poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)17、に基づいてを調査 (POEGMA)2 ,18 , poly(vinylcaprolactam) (PVCL)19,20。POEGMA は、数の異なる基を有するモノマーの線形予測を混合物の21,22の予想される改善された生体適合性とその曲安易な LCST 挙動を与えられた特定の最近の関心を集めています。エチレンオキシドの側鎖の繰り返し単位を変えたり ~ 20 ° C から LCST > 90 ° C2,23。ただし、これらのポリマーのラジカル重合により作製した、従って潜在的なユーティリティおよび生物医学アプリケーションのコンテキストでこのような高分子の訳しを著しく抑える炭素-炭素バックボーンが含まれています分解 (または少なくとも腎のろ過によりクリアランスのための容量) の要件は、通常。
この制限に対し、我々 が最近広く報告ヒドラゾン化学の応用で (すなわち、ヒドラジドとアルデヒド官能基化前ポリマー反応) 感温の分解性類縁体を準備するには。ヒドロゲル24,25,26,27,28,29。機能性前駆体高分子30の混合時に酸ヒドラジドとアルデヒド グループ間急速かつ可逆的反応により両方の in situゲル化 (安易な注入を必要とせずにこれらの材料を有効にする手術注入または任意の種類の UV 照射や化学開始など外部重合刺激) 化学架橋サイトの密度によって制御される速度でネットワークの加水分解の分解だけでなく。さらに、腎の濾過限度以下ヒドロゲルを準備するために使用前のポリマーの分子量を図り、このアプローチを使用したゲルは、25 本体から消去することができますオリゴマー前駆体ポリマーに戻って低下します。 ,,2728。低毒性とこれら材料25,26,27による低の炎症性組織反応と相まって、このアプローチを提供する可能性のある変換可能な感温の使用法医学、特に場合は、すべての長さにこのようなヒドロゲルの制御された分解性アナログ スケール (一括、マイクロ、ナノ) スマート ゲルを作製できます。
このプロトコル合成感温前ポリマー ヒドラジドとアルデヒド グループと同様の方法これらのポリマーに適用する上明確に定義された寸法を持つゲルを作成する制御番号、機能集積化を行うための方法について述べる様々 な長さのスケール。特に、この原稿は、反応性酸ヒドラジドとアルデヒド官能基化前ポリマーの混合を制御する開発し、, このように明確に定義されたジオメトリと感温ハイドロゲル ネットワークを作成する 4 つの異なるアプローチを説明しますと形態:
スタティック ミキサーをそのコンセントに装備して、その後に共押出ダブルバレル シリンジの樽に反応前のポリマーを読み込まテンプレート戦略を説明、定義されたサイズに分解性一括ヒドロゲルを作成する、シリコン金型目的ハイドロゲル形状および寸法21,27 (図 1)。
図 1: 一括ハイドロゲル形成の模式。ヒドラジドとアルデヒド官能基化高分子溶液 (水または緩衝水溶液) はダブル バレル シリンジの樽に読み込まれ、円筒形のシリコーン型に、このスタティック ミキサーを通して共押出します。ミックス フォーム ヒドラゾン架橋ハイドロゲルが自立 (一度金型を削除) を分前駆体高分子の濃度および官能基密度によって数秒以内にその場で急速なゲル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ミクロン スケールの分解性ゲル粒子を作成するため反応マイクロ メソッドが記載されて、前駆体高分子溶液は、同時に混合し、ソフト リソグラフィ テンプレート マイクロ流体チップ設計を使用して、有効にすることを乳化、混合反応性高分子液滴の形成その後ゲルその場でテンプレートのサイズとフォーム ゲル微粒子乳剤 (図 2)31,32。
図 2: ゲル微粒子形成反応マイクロ流体を介してのスケマティック。(A, B)ヒドラジドとアルデヒド官能基化高分子溶液 (水または緩衝水溶液) は、ジグザグの一連の水路の逆流を防いで圧力勾配を作成するように設計を介して下流に接続されている別の貯水池にシリンジ ポンプによって供給されます。ポリマー、(またシリンジ ポンプによって駆動される) 両側から流れるパラフィン オイルでせん断される直前に混合し、水の流れ中心生産の結果ノズルを通して強制連続パラフィン油相 (高分子溶液) 液滴(ノズル面積と液滴形成過程の図の (B) 参照)。追加の 2 つパラフィン油入口ノズルをさらに別のコレクション チャネル流、その後生成される微粒子ゲル粒子除去する前に完全なゲル化への水滴の後配置します。磁気撹拌ビーカー; で収集(C) ノズルの液滴生成プロセスの画像 (そのヒドラジド ポリマーは混合を説明するために青というレッテルに注意)
反応前駆体ポリマー (「シード」高分子) の 1 つのソリューションがあり、安定した nanoaggregate を形成するための LCST 上記方法について説明自己反応性熱駆動、ナノスケールの分解性ゲル粒子を作成するには相補的な反応前駆体ポリマー (「架橋」ポリマー); 添加による架橋後結果ヒドラゾン架橋ナノゲル28nanoaggregate (図 3) で直接テンプレート化されたサイズがあります。
図 3: 熱駆動を介してナノゲル形成反応の概略図自己集合。上記の安定した uncrosslinked nanoaggregate を作成するその下限臨界溶液温度 (感温) ヒドラジド官能基化ポリマーを含む水溶液を加熱します。次、アルデヒド官能基化ポリマーはヒドラゾン結合形成を介して nanoaggregate 架橋に追加し、したがって、LCST 以下で冷却にナノゲル粒子を安定させます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
(一括ゲルを作るために使用)、そのコンセントでスタティック ミキサー搭載ダブル バレル注射器は標準エレクトロスピニング プラットフォーム (図 4 に接続されている反応エレクトロスピニング法を説明分解性ナノファイバーの作製、)33。
図 4: ハイドロゲル ナノファイバー形成反応エレクトロスピニング模式。スタティック ミキサー (一括ヒドロゲルのとおりロードしますが、またエレクトロスピニングの援助として高分子量 poly(ethylene oxide) の分数を含む) でダブル バレル注射器が接続されている注射器の終わりに針とシリンジ ポンプにマウントされています。高電圧電源。ヒドラゾンの架橋は、ストリーム (アルミ箔やアルミ円板) コレクターに達するナノ形態を維持するため、紡糸プロセス中に発生します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
興味のポリマーとして PNIPAM または POEGMA のいずれかを使用してこのプロトコルで分解スマート ハイドロゲル ネットワークを作成するこのような手法の応用を実証します。粘度の適切な調整はあるものの、任意の水溶性ポリマーに記載されている基本的なアプローチを翻訳ことができますただし、(の場合、自己組織化ナノゲル作製法) 種子の形成の前のポリマーの安定性nanoaggregate。
Protocol
1. ヒドラジド機能性高分子の合成
注: 次の特定のレシピ PNIPAM 擬態感温 POEGMA 前駆体ポリマー (PO10) 30 mol % ヒドラジド化で提供されます。PNIPAM と POEGMA 前駆体ポリマー別の相転移温度は、これと同じ一般的な方法を用いて調製できるが、(各種 POEGMA ポリマーの変更のセクション 1.2 を参照)21を使用型とコア モノマーの比率を変更します。,25,27。
- 重量 37 mg 2,2'-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe、イニシエーター) のうちジエチレング リコール メタクリル酸 (M(EO)2MA) の 3.1 g oligoethyleneglycol メタクリル酸 0.9 g (OEGMA475, 475 g/mol n = 7-8 エチレンオキシド リピート単位)、523 の μ L(AA、コモノマー) アクリル酸と thiolglycolic 酸 (TGA、連鎖移動剤) 20 mL バイアル シンチレーションに 7.5 μ L。
- PO0 (部屋の温度遷移温度 POEGMA)、M(EO)2MA (475の OEGMA ないん) の 4.0 g を使用します。PO100 (転移温度 POEGMA)、OEGMA475 (M(EO)2MA) の 4.0 g を使用します。
注: 中間相転移温度が可能 M(EO)2MA の OEGMA475, 中間混合物の使用に基づいてルッツらによると23 - 1 つまたは複数の首丸底フラスコにジオキサン (5 mL/g 全モノマー) すべての試薬を溶解します。
- 30 分の窒素 (UHP グレード) フローと反応を消去します。
- 一度削除された窒素と 400 rpm 磁気攪拌下で 4 h 75 ° C で維持される予熱した油浴中でフラスコを配置します。
- 4 h 後 50 ° C、200 rpm に設定回転蒸発器を用いて溶媒を削除します。
- 150 mL の脱イオン水で得られたポリマー製品を溶解します。
- ポリマーに組み込まれて AA 残基の数を 5 倍モル超アジピン酸 dihydrizide (ADH) を追加 (この例で、AA は電導べ度滴定法に従って生成ポリマーの単量体の単位の 29 モル % を含む)。
- Ph 4.75 0.1 M hcl 溶液の pH を調整します。
- PH が安定したら追加N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) AA 残基の存在の数に 5-fold モル超)。
- 0.1 M HCl 4 h 以上の滴下で反応 pH 4.75 を維持します。
- ままに、一晩撹拌反応をします。
- 注ぐ製品ソリューション 3 〜 30 cm 長い透析チューブ (3500 Da 分子量カットオフ、1 インチの厚さ) に流出を最小限に抑えるために漏斗の使用。ピンチ クランプを使用してクランプ整合性を改善するために管の小さな (~ 2 cm) セグメントを折ることによって充填する前にチューブの底を閉じる(空気の泡を削除するを押す) 上部に繰り返し充填が完了したとき。脱イオン水の 100 余分なボリュームの内部管を配置し、完全の交換水目的の純度を達成するために透析の 6 サイクル、少なくとも 6 時間を残します。
- 最終的な乾燥ポリマー製品を得るため透析のサンプルを凍結乾燥します。
2. アルデヒド官能基化ポリマーの合成
- アルデヒド前駆体モノマー N-(2,2-Dimethoxyethyl) メタクリル酸 (DMEMA) の合成
- 20 w/v NaOH 溶液 500 mL 3 首丸底フラスコに場所 200 mL。
- 氷浴でソリューションを冷却し、反応中に氷で 0 ° C の温度を維持します。
- 冷却の NaOH 溶液に aminoacetyl アルデヒド ジメチル アセタールの 50 mL を追加します。
- テンポの 0.1 g で追加 ((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-イル) オキシル)、電磁攪拌棒を使用してテンポを完全に溶解するまで 400 rpm でかき混ぜます。
- メタクリロイル塩化滴下ビュレット 2 h 以上を使用して、48 mL を追加します。
- 2 時間後、アルミ箔と残す、一晩撹拌反応槽をカバーします。
- 1 L 分離漏斗で石油エーテル 75 mL に反応製品を追加、揺れ、脱ガス、および最上位のレイヤーを破棄することによって製品を抽出します。
- 2.1.7 のステップを 3 回繰り返します下部層製品を原料製品として各抽出のステップから次の抽出サイクルに追加します。
- 最終的な底層製品、100 mL ビーカーに転送を削除します。
- 追加 〜 5 g 硫酸マグネシウム (Mg2SO4)「雪の世界」までモノマーとビーカーに効果が観察されます。
- など4100 mL Mg2を削除するブフナーをフィルター処理します。
- Tert-ブチル エーテル、たびに漏斗を通して洗浄液を注いで 〜 75 mL で 2 回ビーカーをすすいでください。
- 500 mL の丸底フラスコに製品を譲渡し、常温ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させる最終製品を収集するために 200 の RPM。
- アルデヒド官能基化ポリマーの合成
注: 次の特定のレシピ PNIPAM 擬態 POEGMA 前駆体ポリマー (PO10) 30 mol % アルデヒド官能基化で提供されます。PNIPAM と POEGMA 前駆体ポリマー別の相転移温度は、同じ一般的な方法を用いて調製できるが、(各種 POEGMA ポリマーの変更のセクション 1.2 を参照)21を使用型とコア モノマーの比率を変更します。,25,27。- 37 mg 2,2'-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe) M(EO)2メタクリル酸ジエチレング リコール、MA、3.10 g のオリゴ エチレング リコール メタクリル酸 0.1 g を量り (OEGMA475、475 g/mol、n = 7-8 エチレンオキシド リピート単位)、n-(2, 2-1.30 gdimethoxyethyl) アクリルアミド (DMEMA) および thiolglycolic 酸 (TGA) 20 mL バイアル シンチレーションに 7.5 μ L。
- PO0 (部屋の温度遷移温度 POEGMA)、M(EO)2MA (475の OEGMA ないん) の 4.0 g を使用します。PO100 (転移温度 POEGMA)、OEGMA475 (M(EO)2MA) の 4.0 g を使用します。
注: 中間相転移温度を実現できます M(EO)2MA の OEGMA475, 中間混合物の使用に基づいてルッツらによると。23 - 1 つまたは複数の首丸底フラスコにジオキサン (5 mL/g 全モノマー) すべての試薬を溶解します。
- 30 分の窒素 (UHP グレード) フローと反応を消去します。
- 一度削除された予熱した油浴中で場所フラスコは窒素と 400 rpm 磁気攪拌下で 4 h 75 ° C で維持されます。
- 4 h 後 50 ° C、200 rpm に設定回転蒸発器を用いて溶媒を削除します。
- 100 mL の脱イオン H2o. に結果として得られる高分子製品を溶解します。
- 溶存液に 1 M 塩酸 50 mL を追加し、磁気攪拌 (400 回転) 24 h DMEMA でアセタールの機能を完全に加水分解するためにかき混ぜます。
- 反応完了後 1.13 のステップごとの透析チューブに高分子溶液を転送します。
- 最終的な乾燥ポリマー製品を得るため透析のサンプルを凍結乾燥します。
3. ヒドラゾン架橋一括ゲルの作製
- ヒドラジドとアルデヒド官能基化ポリマー別に 10 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、または目的濃度の溶液を作成する、すべての必要な水性バッファーに溶解します。
注: 5-40 wt % の質量濃度通常使用される低濃度ポリマーに高機能グループの分数がある場合可能でゲル化。 - シングル バレル スポイトを使用して転送ソリューション、ソリューションを読み込む各前駆体 (〜 1 mL 各) ダブル バレル シリンジ (1:1 の比率のシリンジ 2.5 mL ボリューム) の別の樽にスタティック ミキサー (長さ 1.5") および (オプション) (通常 18 G、注射器に接続されています。1.5"in vitro 試験の長さ) と (必要に応じて) 注射器 (通常 18 G、1.5" in vitro 試験の長さ)。
- シリコーン ゴム シートに所望の厚さ、形状、パンチング穴径の金型を準備します。
注: 典型的な実験標準パンチ セットが 1/16"厚さシリコーン ゴム シート (貯水池 〜 300 μ L の総ボリューム) の内部 7 mm 径の円筒穴をパンチに使用されています。 - シリコーン型を標準的なガラス顕微鏡スライド金型で穴をパンチするようマウントは、ガラスによって完全にサポートされます。 ガラスの 0.1 M HCl 洗浄は推奨事項は、シリコーン型の取付前に必要ありません。
- 共同完全に記入 (または少しあふれて、上部に半月板と) シリコーン型スタティック ミキサーを通してダブル バレル注射内容を押し出します。
注: 複数のサンプルは、ゲル化時間が同程度の大きさのまたは複数の型を満たすために必要な合計時間よりも長く、1 つのサンプルの間に準備します。 - 金型の上に別の標準的なガラス顕微鏡スライドを配置し、ゲル化を完了するを待ちます。
メモ: 合成セクション ゲル内で説明されている標準的なレシピ < 1 分ゲル化に時間がかかる (そして必要な待機時間が長く) は、官能基密度が低い、低高分子濃度および/または OEGMA475 M(EO)2MA (POEGMA ヒドロゲル) の基準の高い分数で観察されます。 - トップの顕微鏡スライドを外し、シリコーンゴム型からハイドロゲルをプッシュするヘラを使用します。
- さらにテストのヒドロゲルを回復する下の顕微鏡スライドから金型を持ち上げます。
4. ヒドラゾン架橋ゲル微粒子の作製
- マイクロ流体チップの作製
- シリコン ・ ウエハを脱水 (D = 76.2 mm、380 μ P ドープ < 100 > 向き) ホット プレートで 5 分の 200 ° C の加熱による。
- ウェーハ スピン コーターに SU 8 ~ 7 mL を用いた SU 8 100 フォトレジストの ~ 100 μ m 厚い層レジスト コートをセンター、500 rpm/s とし、速度を保持して、3000 rpm で 30 秒間の割合で 3000 rpm までの速度ランプをスピン。
- 前 10 分の 65 ° C でコーティングを焼くと、- 95 ° C、30 分で塗装を焼くソフト。
- 透過セクション重合レジスト層の所望のパターンにあるような透明度に図 2A、によって定義されたマイクロ パターンとフォトマスクを印刷します。
- マスクア ライナー、フォトレジスト コーティング シリコンウェハー、フォトマスクを挿入し、95 の 365 nm の光にウェーハを公開 s (6.5 W 露出力)。
- 65 ° C でホット プレート上に配置し、その後 10 ° C/分で 95 ° C にホット プレートを加熱によって最初 95 ° C で 10 分間のパターン付きウェハを焼きます。
- ホット プレート、500 mL ビーカー 100 mL SU 8 開発者少なくとも 10 分を含む、非曝露フォトレジストを削除するソリューション全体でゆっくりとウェーハを旋回の場所からウェハを削除します。10 分後イソプロパノールとパターン付きウェハをすすいで空気乾燥します。パターン付きウェハをソフト ・ リソグラフィー レプリカ成形に使用しないときに光から涼しい、乾燥した環境に格納します。
- ペトリ皿にパターン化されたマイクロ金型を配置します。入り江やチップの店で L/S 13 シリコン チューブの位置 〜 10 mm 長さ。
- ポリ (ジメチル シロキサン) 〜 10 mL を注ぐ (PDMS; 10:1 の比率でシリコーンのエラストマー ベースとシリコーンのエラストマーの硬化剤を混合することによって準備)、チップ上に配置されたシリコーン チューブ内の任意の PDMS を組み込む慎重に回避します。
- パターンの建物周辺を永続化、硬化時に空気の泡を削除する 〜 10 分の真空チャンバーにペトリ皿を配置します。
- パターン金型と 2-3 h の 85 ° c 鉄板未硬化 PDMS を含むペトリ皿を置くことによって、PDMS を治します。
- マイクロ金型の柔らかい線描パターン PDMS レプリカを公開するパターンのシリコンウエハーから硬化 PDMS を慎重にはがします。
- パターン PDMS の場所とフィードの空気クリーナー高出力プラズマで逆さまにスライド ガラス。200 mtorr プラズマと 90 の 45 W 適用 s をスライド ガラスに PDMS を結合し、最終的なマイクロ流体チップを作成します。
- ゲル微粒子の合成
- 無水エタノール 20 mL に NIPAM (4.5 g)、アクリル酸 (0.5 g - 15 mol % 全モノマー)、チオグ リコール酸 (TGA、80 μ L)、2, 2-azobisisobutyric 酸ジメチル (AIBME、0.056 g) を溶解することにより酸ヒドラジド修飾 PNIPAM (PNIPAM Hzd) を準備し、その後手順 1.4 1.14、合成を完了する手順 1.5 の 56 ° C と反応温度の変化が。
- 20 の NIPAM (4 g)、n-(2, 2-dimethoxyethyl) メタクリル酸 (DMEMA、0.95 g - 13.4 mol % 全モノマー)、チオグ リコール酸 (TGA、80 μ L)、2, 2-azobisisobutyric 酸ジメチル (AIBME、0.056 g) を溶解することによりアルデヒド官能基化 PNIPAM (PNIPAM Ald) を準備します。mL のエタノールと続いて次の手順 2.2.4-2.2.10、合成を完了するは、反応温度を 56 ° C に変更することがで 2.2.5 がステップします。
- 別の標準的な 5 mL 注射器に脱イオン水と負荷 6 wt % で PNIPAM Hzd と PNIPAM Ald を溶解します。
- 1 wt % ノニオン界面活性剤 (例えば、スパン 80) 重いパラフィン油を溶解し、標準 60 mL 注射器にソリューションを読み込みます。
- マイクロ流体チップとマイクロ流体チップを経由して 1/32"ID シリコーン チューブ (~ 30 cm 長さ、入口あたりのオイル入口チャネルにパラフィン油液の 2 つの独立した高分子入口チャネル 2 前駆体高分子ソリューション注射器を個別に接続します。~ 45 cm アウトレットあたり)。
- 輸液ポンプ ・ シリンジ ポンプ (1 つ上流の石油は、ノズル後追加されたオイルの 1 つ) を分離 2 を使用して、主要なチップとチップを確実にポリマー流を起動することがなく流量 1.1 mL/h と 5.5 mL/h の間でチップに油を提供無料の欠陥と 運用 (通常維持される 30 分間)。
- 別注入シリンジ ポンプを使用すると、流量 0.03 mL/h でチップに、高分子溶液のそれぞれを提供します。
- 次の流れが平衡し、均一粒子形成 (30 分-1 時間)、ように初期安定化期間磁気撹拌丸底フラスコ内の粒子を収集します。
- すべてのオイルが消費される (流れによって h 12-55、) まで粒子を収集します。シリンジ ポンプを停止し、ポンプをきれいにチップを介して前駆体高分子溶液の代わりに水がすぐに必要な場合。 ただし、流れが停止したときは、これらの材料の急速なその場でゲル化を与え、それは各別の実験のための新しいチップを使用する勧めします。
- 磁気攪拌を切り、解決するゲル微粒子を許可します。ピペットを使用してすべての利用可能なパラフィン油をデカントします。
- 残りのパラフィン油を削除するペンタン (微粒子量ごとの 0.5 mL を 10 mL の量で適用される) ゲル微粒子を洗浄、エマルジョンを精力的にミックス 〜 1 分再 1 ~ 2 のために解決するゲル微粒子を許可する時間をデカントし、ピペットを使用して残留有機相。完全パラフィン油除去を確保するため、少なくとも 5 回を繰り返します。
- 20 mL バイアル シンチレーション中 10 mL の脱イオン水でゲル微粒子を再懸濁しますおよび任意の残留ペンタンを削除する窒素を一晩でバイアルをパージします。
5. ヒドラゾン架橋ナノゲルの作製
- PNIPAM Hzd の貯蔵液を溶解 (1 w/v%) と PNIPAM Ald (1 w/v%) 脱イオン水。4.2.1 と 4.2.2 のセクションでそれぞれ説明 PNIPAM Hzd や PNIPAM Ald を準備します。
- 70˚C する PNIPAM Hzd 保存溶液 20 mL バイアル シンチレーション内電磁攪拌 (350 RPM) の下のオイルの浴室を使用しての 5 mL の約数を加熱します。
注: ソリューション必要があります不透明になる (すなわち温度が PNIPAM Hzd の下限臨界溶液温度を超える場合)、表示される沈殿物は成立しないが。 - PNIPAM Ald の 0.25 mL の約数を追加 (PNIPAM Hzd の質量の 5-20 wt % シード ソリューションに存在) 5-10 秒の期間にわたって温水 PNIPAM Hzd ソリューションに伝。
- 混合用シンチレーションでソリューション バイアルを削除した後、追加の 15 分油浴からサンプルを続行し、一晩室温に冷却する製品を許可します。
- 脱イオン水、非架橋ポリマーを削除に反対 (3500 kDa MWCO 透析膜を使用して) 6 x 6 時間サイクルで結果ナノゲルを dialyze します。必要な場合は、ストレージの凍乾します。
6. ヒドラゾン架橋ナノファイバーの作製
- 37 mg ジメチル 2,2'-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe)、4.0 g oligoethyleneglycol メタクリル酸を溶解することにより酸ヒドラジド機能 POEGMA (POEGMA-Hzd) を準備 (OEGMA475、475 g/mol、n = 7-8 エチレンオキシド リピート単位)、および 0.25 g アクリル酸(AA) 20 mL ジオキサン及び 1.3-1.14 合成を完了する手順を実行します。
- 50 mg ジメチル 2,2'-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe)、4.0 g oligoethyleneglycol メタクリル酸を溶解することによりアルデヒド官能基化 POEGMA (POEGMA Ald) を準備 (OEGMA475、475 g/mol、n = 7-8 エチレンオキシド リピート単位)、および 0.60 g N-(2, 2-dimethoxyethyl) (DMEMA) メタクリル酸 20 mL ジオキサンと合成を完了する次の手順 2.2.3-2.2.10
- 溶解 POEGMA Hzd (15 wt %) と POEGMA Ald (15 wt %) 別の脱イオン水ソリューションで。
- ポリ (エチレンオキ サイド) を溶解 (PEO、Mw= 600 × 103 g/mol、5 wt %) 脱イオン水。 7.5 wt %poegma 前駆体高分子と 2.5 wt %peo の最終的な前駆体溶液を作成するステップ 6.3 で準備して各反応 POEGMA 溶液の PEO 溶液のミックス 1 mL。
- 3 (1.5"スタティック ミキサーも含む) に記載されている同じダブル バレル シリンジの樽に 2 つのソリューションをロードおよび輸液シリンジ ポンプにダブル バレル注射器をマウントします。
- スタティック ミキサーと鈍チップ 18 G 針を二重バレル注射器に接続します。
- コレクターは接地鈍先端の針に高電圧の電源を接続します。
注: コレクターはアルミ箔の 10 mm × 10 mm の正方形のいずれかを構成または 200 rpm の速度で回転、~ 10 mm 径のアルミ ディスク両方垂直にマウント 10 cm の距離で針針の端から。 - 0.48 mL/h の速度で注射器のポンプを起動し、同時に、8.5 の高電圧スイッチ、静電紡糸ナノファイバーの作製し kV。
- 異なる太さのまたは入口のソリューションがなくなるまで足場を作るに必要に応じてエレクトロスピニングを続行します。
- PEO エレクトロスピニング援助を削除するには、脱イオン水で 24 時間収集した足場を浸します。
Representative Results
一括ヒドロゲル シリコーン型にダブル バレル、注射器から押出成形金型の寸法に合わせるなりフリースタンディングにカビの除去;ゲル化は通常、数秒から数分ポリマー前駆体によって共押出次使用を発生します。(培細胞文化挿入を使用して腫れのソリューションから、ハイドロゲルを簡単に削除する測定)、腫れによる典型的な特性 thermoresponsivity (同じテクニックを使用して、上記の培養温度のサイクリングを測定し、相転移温度)、下 (測定を使用して、同じ手法で、以上のより長い期間)、劣化とせん断または圧縮弾性率 (2 mm 厚、7 mm 径の成形サンプルを使用して測定される) を示します、ハイドロゲルの可変性(具体的には、長鎖 OEGMA モノマー、ハイドロゲルを準備するために使用する短いの比 POEGMA) の前駆体ポリマーの化学によって反応前駆体高分子とそれらの濃度に官能基のモル分率前駆体ポリマー (図 5)27。
マイクロ流体は油および/または複合高分子水溶液相 (図 6 a)31の流量に基づく制御のサイズ、25-100 μ m のサイズのスケールに明確に定義されたゲル微粒子の形成に します。高温顕微鏡確認感温性 (に起因する可逆温度依存性腫れ-主のみわずかなヒステリシスをサイクル 1 を示すバルク ヒドロゲルをゲル微粒子に維持折りたたまれた状態の34で近隣のアミド グループの不可逆的な水素結合形成) が一括 PNIPAM ヒドロゲル (図 6 b)32で見られた一貫しました。さらに、ゲル微粒子が低下するそのオリゴマーの前駆体に戻る時間をかけて腎クリアランス (図 6)32を有効にします。
ヒドラジド修飾 PNIPAM ポリマー アルデヒド官能基化 PNIPAM 架橋続いて温水溶液中の nanoaggregation によって駆動される自己組織化高分子が高い単分散ナノゲルの結果 (多分散性 < 0.1) で、プロセス条件に応じて、180-300 nm のサイズの範囲は、(図 7A)28を使用しました。ナノゲル熱主より架橋ポリマーが追加されました (図 7B) として観察のより低い角度の従来のラジカル架橋 PNIPAM ナノゲルの典型的な感温動作を保持します。ナノゲルを凍結乾燥して粉粒 (図 7C) に変更することがなくできるナノゲル (図 7D) を策定する使用されるオリゴマー前駆体ポリマーを再形成するため加水分解を介して時間をかけて低下と。
反応エレクトロスピニング構造が作成され、仁科ハイドロゲル (図 8A) 〜 300 程度のナノファイバーの直径を持つ nm 可視クラスターイオンビーム粒子存在33なし達成可能な。水で POEGMA ベース ナノファイバーを浸漬急速な水分補給 (約 2 桁、図 8Bは、同じ組成物の一括ゲルと達成よりも高速化) ですが 8-10 週間以上前にナノ形態を維持生理学的な条件で加水分解劣化ヒドラゾン酸触媒付着劣化 (図 8C) 可能性がある期待どおりに、劣化が速くは酸触媒環境で観察されます。ナノ構造、また機械的に堅牢な乾燥と腫れた状態の両方複数のサイクルで取り扱いが容易で繰り返しひずみ (図 8D) を有効にします。
図 5:その場で -ゲル化性バルク分解性感温ハイドロゲル。(A) 代表 POEGMA ゲルのネットワーク組織と一括ヒドロゲル前駆体ポリマー; OEGMA475のモル % 混入の関数としての対応するゲル化時間画像(B ・ C)PO100ヒドロゲル前駆体高分子濃度変化 (B) と (C) モル % 機能グループ設立前駆体ポリマー; あたりでの貯蔵弾性率(D-F)POEGMA ゲル OEGMA475モル % 混入の関数としての生理化学的性質: (D) 貯蔵弾性率 (E) 劣化プロファイル 1 M HCl と温度反応 (F) 体積相転移温度範囲にわたって変更 20-60 ° c.すべての誤差範囲を表す n の標準偏差 = 4 複製測定。エルゼビアの許可を得て参照27から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 反応性マイクロから分解性ゲル微粒子のプロパティ。(A) 水 (精製) ゲル微粒子サイズにパラフィン油流量の影響(上と下の体積相転移温度; 単一熱サイクルの後に水で精製ゲル微粒子の Thermoresponsivity B)(C) 視覚評価 (写真) とゲル浸透クロマトグラフィー トレース (グラフ) ゲル微粒子の劣化を確認するに戻るその前駆体ポリマーのコンポーネント (ここでは、イメージングの時間スケールで加速劣化を促進する 1 M HCl で);スケールバー = 100 μ m. 適合からの参照32。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 反応性から分解性ナノゲルの特性自己集合。(動的光散乱法から異なるアルデヒド: ヒドラジド高分子質量比を使用したナノゲルの A) 粒径分布 (inset: 透過電子顕微鏡写真、ナノゲルの球面の性質を確認する);(B) 感応 (動的光散乱法) からナノゲルの準備に使用されるアルデヒド: ヒドラジド ポリマー間質量比の関数として自己組織化粒子の n の標準偏差を表す誤差 = 4 複製;(C) 視覚確認ナノゲル集計の欠如の前と後の凍結乾燥;(ナノゲルの酸触媒劣化の D) 視覚的に確認 (ここでは上記の他の研究との整合性のため 1 M HCl);(E) ゲル浸透クロマト グラフ トレース ヒドラジドとアルデヒド官能基化前駆体ポリマーに類似性を示すナノゲル分解生成物。参照28から許可を適応します。著作権の 2015 年、アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 分解反応の静電紡糸ナノファイバーのプロパティ。(A) 走査電子顕微鏡、ドライでナノファイバーの画像状態 (左)、水 (中間、薄いフィルム) に浸漬半分と完全に (右、厚い足場); 一晩水に浸した(B) 同じ組成のバルク ハイドロゲル (青) を基準にして (赤) 仁科ハイドロゲルの腫れ、誤差範囲 n の標準偏差を表す = 4 複製;(C) 走査型電子顕微鏡および (インセット) 視覚イメージ 1 M 塩酸; ナノファイバーの酸触媒劣化の追跡(ドライ (80 サイクル、20% 伸長/サイクル) の D) 引張サイクリングや腫れ (325 サイクル、10% 伸長/サイクル 10 mm PBS) エレクトロスピニング仁科ヒドロゲル。図は参照33から変更され、王立化学会から許可を得て再現します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
PNIPAM と POEGMA; 上記の詳細で説明する方法の微妙な違いだけを使用して複数のポリマー システムにこれらのすべての加工技術を適用した正常に我々ただし、これらのプロトコルのユーザーは、これらのプロセスに他のポリマーに置換する際に生じる可能性のある潜在的な問題を認識しなければなりません。特に、2 前駆体ポリマーの混合の効率と同様、両方の加工性 (特にマイクロ法) で、前駆体ポリマーの粘度を増加することができます悪影響。さらに、高分子のゲル化時間は流れを阻害、または目的を形成する不可欠な反応前ポリマーの拡散を防ぐため、早期のゲル化を避けるためにターゲット形態に依存率で制御する必要があります。均質ゲル構造。それぞれの戦略だけでなく、我々 は各加工長さスケールでこのような制限に対処するためのこれらのアプローチに適応する使用しているアプローチの具体的な制限は次のとおりです。
ダブル バレル注射器共押出によるヒドロゲルを一括します。
ゲル化時間一括ヒドロゲルを形成するためダブル バレル シリンジ法の有効性を確保するためのコントロールにキーの変数です。お問い合わせの時にあまりにも速くゲル高分子 (< 1 2 s) スタティック ミキサーでは、流れを完全に停止または注射器から押し出されて 2 つの前駆体ポリマーの非化学量論的量でその結果を詰まらせることができます。そのゲル化時間がわかった > 5 s が望ましい (必須でない) がこのテクニックを使用するためこれは各ハイドロゲル キャストが同じ組成を持っていることを確認する物理的または機械的分析のため複製ヒドロゲルをキャストされている場合に特に重要です。ゲル化時間は 1 つの反応性官能基の密度を変更することによって簡単に変更できますまたは前駆体ポリマー (遅いゲル化につながる官能基密度が低い) または前駆体高分子の濃度を変更することの両方を使用する形式のゲル (遅いゲル化につながる濃度を下げる)21。代わりに、結果ハイドロゲル35 の構成を大幅に変更せずゲル化時間が短縮されます (反応が弱い) ケトン基とゲル化のペアの求電子剤として大幅 (反応) のアルデヒド グループを置き換える;ポリマーは、アルデヒドの混合調製、使用される前駆体高分子の濃度 (そして形成されたゲル中の固形物の量の割合) を変更することがなく必要に応じてゲル化時間をチューニングするケトン単量体前駆体を使用できます。
また、最初のハイドロゲル キャストがないこと常に後続ヒドロゲル、キャストで 2 つのバレルの内容は実際にスタティック ミキサーを到達速度の差に起因する観察と同じプロパティを注意すると思います。通常にダブル バレル注射器を押し出して小さなプライム結果として (< 0.3 mL) そのような変動を最小限に抑えるために、鋳造を開始する前にゲルのほんの一部。最後に中通常問題オリゴマーの合成前の高分子を使用する場合、1 つまたは複数の前駆体高分子溶液の粘度は両方の親指シンプルなうつ病を使用してフローを促進する観点から、この技術のコンテキストで挑戦を提起することができます。効果的なスタティック ミキサー内で混合を促進します。ただし、多少、驚くこともはっきりと異なる粘度による高分子溶液の前駆体まだ形成比較的均質ゲルのパーツリストに記載されているスタティック ミキサーの添付ファイルの使用 (例えばPNIPAM 高分子重量炭水化物26)、粘度のミスマッチの結果として非効率的な混合について懸念を示唆でないかもしれない重要な少なくともバルク スケール。必要な場合、ドライブの流れに (親指) の代わりにシリンジ ポンプの使用および/または出口より大きいゲージの針の使用がこれらのシステムで、押出し加工性に関連する問題を克服する助けることができます。
反応性マイクロ流体を介してマイクロ ヒドロゲル
ゲル微粒子の作製のためのマイクロ流体アプローチに関連付けられている重要な 2 つの反応性高分子マイクロ流路チップの起爆剤です。差圧が貯水池に 1 前駆体高分子溶液の逆流を運転できる場合はポリマーは、チップにさまざまな圧力または異なるレートで配信される、(または少なくとも貯水池に向かって) 他の前駆体ポリマーの。これは、結果、上流をゲル化、粒子の形成の流れを効果的に遮断、したがって切りくず処理を必要とするから。各貯水池とミキシングのポイント捺印拷問パス逆流; に大きな抵抗を作成しますただし、安定供給体制を実現するためにも訓練を受けたオペレーターはチップをゲル時折。我々 の経験を基に、1-2 分間 (時間をかけて比較的多ゲル微粒子が生成されます)。 液滴形成の開始に続く流れを安定させるために通常必要です。操作の最初の 5 〜 10 分内で問題が発生しないこと場合、は、連続単分散粒子生産のいくつかの時間が得られることが考えられます。非瞬時ゲル化時間と同様、比較的よく一致した粘度と前駆体ポリマーの使用 (少なくとも > 15 s が望ましい) でこのような問題を回避し、安定したフローの形成の推進を支援します。
メモこと、0.01 0.1 に至る様々 な流量 mL 水相中に h と油相に 1.1 5.5 mL/h は 25 〜 100 のサイズの範囲の粒子の作製につながる、このチップの設計を使用してテストされている/μ m で適用せん断によると、ジャンクションの流れ中心;高いせん断速度で流れを同一視して31,32に形成される小さい粒子。総水の流れの率が低い (~0.03 mL/h、プロトコルに引用として) が状単分散またはデバイスの寿命を損なうことがなくゲル微粒子のサイズを制御する最も効率的なことが判明した保っている間オイル流量を変化させ、どちらが引用全水系流量のより高い終わりを大幅に削減することが観察。大きな油流量 (> 5.5 mL/h) 小さい粒子を作成する可能チップはく離 (プラズマ接合 PDMS マイクロ流体チップで発生した一般的な制限) のリスクを増加させるが。別の方法を使用してチップを接着流れの速度でおよびこうしてより小さいゲル微粒子の生産、探っています現在戦略を有効にします。ノズルのサイズを小さく粒子を形成する前の早期のゲル化の高まりリスクではある生成可能性が微粒子のサイズを小さくことができます。流れの不安定性とこうしてより高い polydispersities とチップのゲル化; のリスクの増加につながる傾向が低速の流量高い安定性とこのプロトコルで使用される標準的なシリンジ ポンプより高い解像度を持つマルチ チャンネルのマイクロ フロー コントロール システムを使用してこの制限を克服できます。
オイルの選択は重いオイル (コレクション後ゲル微粒子の凝集を予防する上で有利な) としてこのプロトコルの成功にとって重要で報告された光シリコン オイルよりもノズルで大いにより少なく一貫した粒子の形成につながったプロトコル。我々 はこの減少を仮説再現性混合時点より変数せん断につながる重いオイルのシリンジ ポンプの一貫性は低くの結果であります。挑戦、特にすぐにその時点でその場でゲル化はなかった完全な大きい数字の反応マイクロ流体デバイスからの出口もあったコレクション フラスコでゲル微粒子の凝集を避ける機能グループは、フォーム コレクション バスに衝突する粒子の間に橋が利用できました。によりこのような課題が解決される: 増加するマイクロ流体チップ自体に出口チャネルの長さ、; より完全なゲル化を促進するために時間の長い期間のため層流ゲル微粒子を維持ノズル自体または粒子生産率; せん断場に影響を与えずにこのポスト混合チャネルでゲル微粒子チップとこより良い個別に多くの石油を供給するノズルの後側のチャンネルを追加します。ゲル微粒子の沈降を避けるためにコレクション フラスコに磁気ミキサーを追加し、隣接粒子間のより大きい平均分離を維持します。非常に遅いゲル化ポリマーだろう可能性が高いデバイスの安定性を向上、プライミングの問題を最小限に抑えるため、このようなシステムも観察された反応機能グループの大きい数としてのゲル微粒子凝集の危険性を大幅に向上未反応 (およびこうしてフォーム粒子間橋こと) のまま時間の長い期間にわたって。ゲル化時間 15-60 s の順序がこの手法に最適のように見えるよう、: 遅いプライミングが十分に速くほとんど反応性官能基を確実に有効にするのには十分に流チャネルを終了するゲル微粒子の前に消費される、コレクションのフラスコ。
最後に、テンプレートの油の除去は、結果として得られる粒子のスマート プロパティは追加前の高分子の組成に基づいて予想される維持し、生体のコンテキストでこれらの粒子の使用を有効にするのに不可欠です。洗浄手順ペンタンは一般的なゲル微粒子の生産のためにこの点で非常に効果的だった。ただし、直接生体文脈 (例えば、オンチップ細胞のカプセル化) でこの技術のアプリケーションには、このプロトコルの再評価が必要となります。連絡のコンテキストでより不活性油細胞36、分散剤として示唆されたオリーブ オイルの使用もしてきました。粒子の形成は可能でしたが、ゲル微粒子の集団は現在のチップ設計と、少なくとも鉱物油で達成できるよりもより多くの多を有意.したがって、チップは、合成高分子、天然高分子ゲル微粒子形成31の両方に適応するのに見えますが、変更されたデザインは材料のすべての組み合わせの間でより広くこのテクニックを悪用する必要があります。
ナノスケール ゲル反応による自己集合
シード高分子濃度の異なるを含む条件の処理の非常に広い範囲を使用して形成されたナノゲル (0.5-2 wt %)、crosslinking:seed 高分子 (0.05-0.2)、異なる温度 (40-80 ° C)、異なる混合速度 (比が異なる200-800 rpm)、およびさらに架橋ポリマー (2 60 分)28回異なる暖房。濃度、傾向は crosslinker:seed ポリマーのより高い比率の架橋密度は高くナノゲルへつながるし、低くなる種子高分子の高濃度を大きくナノゲルへリードとして予測が一般的にthermoresponsivities。それは高すぎる濃度は最終的に一括集約 nanoaggregation、形成するため従来の遊離基析出過程で観察されるものと一貫性のあるのとは対照的につながる種子ポリマーを増やすとを強調する必要があります。感温ナノゲル3。加熱時間の短縮はより小さいを形成しより多くの単分散粒子の良好な状況がまた発見されました。我々 は前駆体ポリマーの一方または両方が相対的にヒドラゾン結合の疎水性が増加ナノゲル衝突に集計の確率を高める LCST 上の温度で長い時間で、nanoaggregate を開催するその仮説します。いずれかの前駆体アルデヒドやヒドラジドする官能基この集約の架橋達成度が増加する可能性が高い。最終的には、加熱時間の短縮は、プロセスの観点から有利な架橋ポリマー添加; 後 2 分ほどで単分散ナノゲル人口を形作ることができます。10 分は、一貫して高架橋ナノゲルの生産もしながら単分散ナノゲルを作り出すことができる最長の時間をことが判明しました。興味深いことに、メソッドは、ほぼ同じ粒径と粒径分布が異なる速度で混合またはも大量にプロセスのスケーリングから生じる混合に非常に敏感ではありません。当初、この結果で驚いている間そう話すナノゲルの生産を調整する熱力学の主要な役割。
低 polydispersities を達成するためにコロイドの安定性と、nanoaggregate の水和の程度は、キーの変数のように見えます。たとえばより少なく親水性アルデヒド官能基化ポリマーではなく種として親水性酸ヒドラジド機能性高分子を用いたハイパーラマンは有意に低い polydispersities とナノゲルに します。実験アセンブリ温度と種子高分子の LCST の差も重要です。シード高分子 LCST 直上の温度で動作 ((T-LCST) < 5 ° C) 単分散ナノゲル形成の最も高い確率を提供していますLCST 結果を効果的にすることができない比較的コンパクトな種子ポリマーで以下の動作中に集計し、架橋するほど可能性が高くより多くの疎水性と折りたたまれたハイパーラマンを作成、LCST を上回る営業または再現性をもって架橋。状単分散粒子の最良の予測の最初核ポリマーの LCST 発症を測定する紫外/可視スキャンを実行してその後 1-2 ° C の温度で自己組織化プロセスを実行することをお勧めその LCST 上。
ナノゲルのこのメソッドを使用して生成の凍結乾燥し、コロイド安定性、自己組織化構造や架橋安定化手法に起因する我々 のビューでしばしば不可能に変更せず粉できることに注意してください。また種子ポリマーのみが動作するこのメソッドの感温する必要があると見込んでください。非対応または他の刺激への応答は、ポリマーを架橋の使用はさらにこの方法の究極の適用を広げるかもしれない。最後に、2 つの反応前駆体ポリマーの混合ですのでこの場合とは対照的なゲル化時間パッシブは説明他の製造方法に対するプロセス制御の面で大いにより少なく重要。ただし、この手法でさえ総架橋時間を維持する < 30 分は粒子凝集の危険性を最小限にすることが望ましい。
反応性エレクトロスピニング仁科ヒドロゲル
反応性の前の高分子のゲル化時間の制御は再びゲル ナノファイバー製造の成功に不可欠であります。特に、約一括ゲル化と (ダブルバレル シリンジと同様に長さとスタティック ミキサーの蛇行からソリューションの流量を変更することによって制御される) スタティック ミキサーは、前駆体ポリマーの滞留時間のマッチング前駆体ポリマーの時は針とコレクター間の紡糸繊維の効果的な架橋を確保できるよう曳糸性の維持の両方に不可欠です。高速ゲル化効果がテイラーの円錐形の開発につながる、従って遅いゲル化結果が広がり、その結果コレクターを打つゲルの代わりに水溶液で中の貧しい曳糸性と薄膜形成の究極の代わりにゲルナノファイバー。一括ゲル化時間滞留時間弱で働いてが有効 (および確かに針の目詰まりのリスクを軽減することが望ましい) をまた発見されています水の蒸発ソリューションは、効果的に回されるように集中して前駆体高分子のため、ストリームし、回転処理中にゲル化速度を加速します。高針・ コレクターの距離でこれと同じ調子で (> 10 cm) はこのプロセスで一般的に良好な短い距離水の蒸発時間を削減し、したがって関係でより厳格なコントロールを必要と滞留時間とゲル化時間ナノ製品を維持するために。
注意してください PEO の使用 (または別高分子量かつ容易にエレクトロスパンナノファイバー高分子) 短くて高い分岐 POEGMA オリゴマーを誘発するエンタングルメントの適切な学位を達することができない単独では、ナノファイバーの形成を促進するためにこのプロトコルで必要であります。エレクトロスピニング;代わりに、エレクトロ スプレーの結果はすべてで (ただし、これは、この同じ化学を用いた分解性ゲル粒子を作るためのアプリケーションもあります) POEGMA 専用製剤のテスト条件を処理します。1 wt % (1 MDa 分子量) の最小 PEO 濃度が完全にナノ形態を維持するために必要です。仁科ネットワークの整合性を中断させることがなく次の簡単な浸漬手順 (脱イオン水, 24 h) 繊維から、PEO を削除できることに注意してください。このように、PEO は最終的なナノ製品の不可欠なコンポーネントよりも過渡エレクトロスピニング援助としてより機能します。この同じと組み合わせて、さまざまな種類 (浸漬時にコレクターから剥離できる薄層ゲルを作成する) にシンプルなアルミ箔、アルミ円板 (厚い足場を作成) するなど、コレクターのことにも注意してください。法、ゲル化の速度、エレクトロスピニング法, 率とエレクトロスピニングの中に水の蒸発速度を制御する他のプロセス変数のまま不変です。
興味深いことに、異なる形態を準備するために使用する方法、に応じて同じヒドロゲル前駆体から作製したハイドロゲルの劣化時に有意な差を観測されています。たとえば、POEGMA ナノ ヒドロゲルは有意に高い表面積およびこうしてヒドラゾン結合を加水分解する水へのアクセスにもかかわらず同じ組成のバルク POEGMA ゲルより遅い低下します。我々 の関係間混合前駆体ポリマー内部のゲルの homogeneities につながる可能性がありますやが大幅に異なる形態やでの幾何学の観点から記述されていたプロトコル固有の対照のこれらの違いその場ゲル化、同時の水の蒸発とこのプロセスにおいて架橋によるエレクトロスピニングに特に関連として同じ時間スケールでポリマー前駆体の濃度。一方、各プロトコルで使用するターゲットが 1 つのポリマーの場合、前駆体ポリマーの選択これにやや複雑になる、それも 1 つの化学組成が非常に異なった物理的性質のゲルを作るという点で技術的な機会を提供するかもしれない。
全体的にみて、説明方法は感温性高分子 (一括、マイクロ、ナノ) 複数の長さスケールと複数の種類の内部構造の分解 (または少なくとも renally クリア可能な) 類縁体を製造するための戦略を提供する (粒子または繊維)。このようなプロトコル アドレス バイオメディカル分野に従来準備合成感温材料の巧妙な翻訳に重要な障壁: injectability と分解。薬剤配達および組織エンジニア リング アプリケーションの癌、物理ターゲットに至る血液脳関門、蛋白質の治療薬デリバリー薬物の輸送の両方でそのような材料の応用の探索を進めています目、その他のアプリケーションの間で、細胞の分化と組織の一方向成長可逆接着の背面。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
自然科学工学研究会議のカナダ (レベル)、レベルの作成から資金調達-同上 (細胞外マトリックスの統合デザイン) プログラム 20/20: レベル眼生体材料研究ネットワーク、およびオンタリオ研究省と技術革新の初期研究者賞プログラムが認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 2,2 - azobisisobutryic acid dimethyl ester | Wako Chemicals | 101138 | |
| Di(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (M(EO)2MA) | Sigma Aldrich | 447927 | 188.2 g/mol, n=2 ethylene oxide repeat units |
| Oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate (OEGMA475) | Sigma Aldrich | 447943 | 475 g/mol, n=8-9 ethylene oxide repeat units |
| Acrylic acid (AA), 99% | Sigma Aldrich | 147230 | |
| Thioglycolic acid (TGA), 98% | Sigma Aldrich | T3758 | |
| Dioxane, 99% | Caledon Labs | 360481 | |
| Nitrogen, UHP grade | Air Liquide | Alphagaz1 765A-44 | |
| Adipic acid dihydrazide (ADH), 98% | Alfa Aesar | A15119 | |
| N'-ethyl-N-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC, x%) | Carbosynth | FD05800 | |
| Hydrochloric acid (HCl), 37% | Sigma Aldrich | 320331 | |
| Sodium hydroxide (NaOH), 97% | Sigma Aldrich | 221465 | |
| Aminoacetyl aldehyde dimethyl acetal, 99% | Sigma Aldrich | 121967 | |
| 4-Hydroxy-TEMPO, 97% | Sigma Aldrich | 176141 | |
| Methacryloyl chloride,97x% | Sigma Aldrich | 523216 | |
| Petroleum ether, 95% | Sigma Aldrich | 32047 | |
| Magnesium sulfate, 99.5% | Sigma Aldrich | M7506 | |
| tert-Butyl methyl ether, >99.0% | Sigma Aldrich | 443808 | |
| Phosphate buffered saline | BioShop | PBS405.1 | 1x, pH 7.3-7.5 |
| N-isopropylacrylamide, 99% | J&K Scientific | 258717 | Recrystallized from 60% hexanes/40% toluene |
| Ethanol, anhydrous | Commerical Alchols | P016EAAN | |
| Span 80 | Sigma Aldrich | S6760 | |
| Heavy paraffin oil | Caledon Labs | 1326197 | |
| Pentane, reagent grade | Caledon Labs | 1/10/7800 | |
| Poly (ethylene oxide) average Mv 600,000 | Sigma Aldrich | 182028 | |
| Supplies essential for synthesis and hydrogel fabrication | |||
| Rotary evaporator | Heidolph | G3 | |
| Dialysis tubing (3500 Da molecular weight cut-off) | Spectrum Labs | 28170-166 | Vol/length= 6.4mL/cm |
| Double barrel syringe | Medmix | L series | L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio |
| Static mixer | Medmix | L series | L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio, 1.5" length |
| Silicone rubber sheet, 1/16" thickness | McMaster-Carr | 9010K12, 30A Durometer (Super Soft) | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS Legato 200 | Infuse Only Dual Syringe Pump |
| High voltage power supply | Spellman | 230-20R | 0 to 20 kV |
| Microfluidic Chip Fabrication | |||
| Silicon wafer | University Wafer | 2080 | D = 76.2 mm; 380 µm thickness; P-doped; <100> orientation |
| SU-8 100 | MicroChem | Y131273 | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | |
| Custom 2.5" spincoater | Built in-house | N/A | |
| Mask Aligner | KARL SUSS | MJB3 UV400 (with a 276 W lamp) | |
| Masterflex L/S 13 Silicone Tubing | Cole Parmer | OF-96400-13 | Peroxide-cured |
| Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Base | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| High Power Plasma Cleaner | Harrick | PDC-002-HP | |
| Characterization Instruments | |||
| Mach 1 micromechanical tester | Biomomentum | LB007-EN | |
| Cellstar tissue culture 12 well plate | Greiner Bio-one | 665 180 | |
| Cell culture insert for 12 well plate | Corning | 08-771-12 | 8 µm pore size |
| Optical microscope | Olympus BX51 optical microscope | BX51 | |
| Temperature-controlled microscope stage | Linkam Scientific | THMS600 | |
| Gel permeation chromatograph (GPC) | Waters | 590 HPLC Pump | Waters Styragel columns (HR2, HR3, HR4; 30 cm x 7.8 mm (ID); 5 mm particles), Waters 410 refractive index detector |
| Dynamic light scattering (DLS) | Brookhaven | 90Plus Particle Size Analyzer | |
| Transmission electron microscopy (TEM) | TEMSCAN | JEOL 1200EX | Accelerating voltage 100 kV |
| Scanning electron microscopy (SEM) | Tescan | Vega II LSU | Accelerating voltage 10 kV |
| Microsquisher | CellScale Biomaterials Testing | MS-50M-01 |
References
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