Introduction
Nonarteritic främre ischemisk optikusneuropati (NAION) är en fokal ischemisk skada i den främre delen av synnerven (ON) 1. NAION är den vanligaste orsaken till plötslig nervrelaterad synförlust hos personer över 50 år 2. Mekanismen tros vara en kompartmentsyndrom som resulterar i intraneural ödem, och orsakar kompression av kapillärerna som levererar axoner i synnerven 3.
Eftersom ON är faktiskt ett det centrala nervsystemet (CNS) tarmkanalen, kan gnagaren NAION (rNAION) modell användas för att studera de mekanismer och responser till isolerade CNS vita substansen stroke. Den rNAION modell kan därför vara användbara i dissekera många problem som är förknippade med stroke relaterade skador på vita substansen. Den kan användas för att utvärdera olika neuroprotektiva strategier och agenter i vit substans stroke.
En av de mest attraktiva funktioner i modellen är att det ären smärtfri, icke-invasiv procedur. Lasereffekten kan justeras för att producera olika grad av ischemisk skada. En annan funktion är att det bygger på laserinducerad superoxidradikaler skada kapillära endotel, som producerar en progressiv kapillär dysfunktion. Det är denna dysfunktion och progressiva ödem som tros vara anmärkningsvärt lik den mekanism som orsakar NAION. Forskning har visat att det inte orsakar direkt kapillär koagulering, men arbetar genom åtminstone två mekanismer: superoxid inducerad död och strippning av en del av den kapillära endotelceller 4, och NFkB (nukleär faktor kappa-lätt-kedja-förstärkare av aktiverade B-celler ) associerad inflammatorisk uppreglering i resterande endotel, med ökad vätsketransport över cellmembranen i interstitium 5. Stängningen av synnerven kapillärerna och kompression som orsakas av interstitiell vätskeansamling resultat i synnerven huvudet ischemi. En schematisk bild visas iFigur 2. Den rNAION modellen kan användas i både råtta och mus arter 6,7, och kan varieras i nivån av dess svårighetsgrad, från en mild lesion till en komplett, men smärtfri nedbrytning av synnerven och näthinnan, såsom som central retinal artärocklusion (CRAO).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av University of Maryland Institutional Animal Care och Utilization kommittén (IACUC, Baltimore, MD, USA)
1. försöksuppställningen
- Gör en specialdesignad kontaktlins från en klar optisk kvalitet cirkulära 7 mm i diameter plexiglas, av 3 mm tjocklek. Skär cirkulära linser med en pelarborrmaskin. Använda ett standardborrkrona för att göra innerkurvan, och slutligen polera de yttre och inre kurvor med användning av en kontaktlins polermaskin av ultrafina slipkorn (1000/3000).
- Förbereda 2,5 mM Rose Bengal (RB) i pH 7,4 fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i förväg, filtersterilisera med en 0,45 mikron sprutfilter och lagra 1 ml alikvoter i -20 ° C i en ljustät behållare i upp till 6 månader.
OBS: Användning av albino avlade handjur, såsom Sprague Dawley minimerar stammen beroende svar skillnader möjliggör ökad enkel induktion och minskar variationen som kan uppstå med brunst cycling hona. - Ställ in frekvensen fördubblats neodym-yttrium aluminium granat (Fd-YAG) ögon medicinsk laser, som alstrar en 532 nm laserljus. Montera lasern på en Haag-Streit ögonspaltlampa med en vanlig ögonlaser adapter. Denna kommersiellt tillgängliga anordning möjliggör samtidig visualisering av djurets öga och laser spot ansökan. Den medicinska laser har också en siktar stråle för korrekt fokusering och centrering med hjälp av samma punktstorlek som laser induktion. Lasereffektparametrarna är som följer:
- För råtta rNAION induktion: använd 500 pm punktstorlek / 50 mW lasereffekt / 1000 ms varaktighet / 1000 ms intervall.
- För mus rNAION induktion: ändra punktstorleken till 300 um för mindre optisk skiva och lämnar andra parametrar på samma sätt som inställningen råtta.
- Använder rutinmässigt en lasereffektmätare för att säkerställa laserns uteffekt.
2. Försöksförfarande
- Slå på lasereffektenoch ställa in lämplig laserparameter. Värma lasern i minst fem minuter före användning.
- Väg djuret för att bestämma den lämpliga dosen för ketamin / xylazin och RB färgämne. Söva djuret genom intraperitoneal injektion av en 1 ml / kg blandning av 80 mg / ml ketamin och 4 mg / ml xylazin.
- Låt djuret i en uppvärmd bur tills den är helt sövd. Kontrollera om inget svar på aversiva stimuli (svans eller tå nypa). Kolla djur för anestesidjupet var 10 min.
- Dilatera djurets elever med 1% tropikamid och söva ytan av ögat med 0,5% proparakain. Om du använder pigmente djur, såsom Long Evans, kommer en 2,5% neosynephrine okulära droppar öka elev utvidgning.
- Använd sax för att klippa morrhåren nära nosen på den sida som ska förmås att undvika att blockera vyn.
- Sätt en droppe 1% metylcellulosa eller annan ögonkopplings falla till insidan av skräddarsydda kontaktlins, och sedan använda linsen på than råtta ögat.
- Placera djuret på en plattform justeras till höjden av spaltlampan. Ställa djurets huvud vid en 45 ° vinkel så att ögat är vinkelrät mot spaltlampan och laserstråle.
- Visualisera ögat genom den oftalmiska spaltlampa. Se till att sikta strålen är rätt storlek samt fokuserad och centrerad direkt på visualiseras synnerven. Fotografera näthinnans fundus med en digitalkamera med hög ASA (1200 - 2000) Hastighet monterad på ett av ögon bitar av spaltlampan med en skräddarsydd adapter.
OBS: Förmågan att se koroidala kärl avslöjar insyn i näthinnan. Detta är ett viktigt tecken för att kunna detektera senare retinal ischemi, som kan förbrylla tolkningen om det inträffar. rNAION är synnerven ischemi, vilket resulterar i isolerade RGC förlust, medan retinal ischemi resulterar i skada på näthinnan påverkar alla celler i de inre retinaskikt. - Eventuellt ytterligare bild näthinnan ochsynnerven använder en spektral domän-optisk koherens Tomografer (SD-8 oktober) för att utvärdera FN-inducerad ögat. Skanna en face (figur 3B) liksom 7 tvärsnitts avsökningar genom näthinnan (Figur 3C). SD-oktober avbildning använder samma kontaktlins som används för laser induktion.
- Injicera 1 ml / kg RB intravenöst genom svansvenen, och vänta i 30 sekunder, sedan aktivera lasereffekt. Denna tidsfördröjning gör att RB att fördela jämnt i cirkulationen. Vi använder en 50 mW laserpulsen vid en s / puls. Större energier (≥ 60 mW) kan skada näthinnan eller orsaka retinal vaskulär ischemi.
Varning: Se till att alla har ett par lasersäkerhet filtrerings glas lämplig blockerande våglängd för att förhindra strölaserljus in utredare öga.
OBS: Laser administration måste ges snabbt efter IV RB injektion eftersom färgen elimineras snabbt från cirkulationen. Ju längre laser induktion, desto allvarligare synnerven ischemi. Generellt är djur som fått 7 - 12 sek pulser i en snabb följd. Kontakten mellan laserljuset med den cirkulerande färgen ger synnerven kärlen en vacker gyllene glöd som kan ses genom spaltlampan (Figur 4B). Detta bevisar färgämnet injicerades systemiskt och fördelas in i blodströmmen. Om glöd är svag, eller ingen alls (Figur 4A), var färgen inte injiceras intravenöst. I det här fallet, inte ge en andra injektion omedelbart, eftersom djuret kommer att behöva återhämta sig under minst två dagar före återinjektion. - Omedelbart efter induktion, ta bort kontaktlinsen. Täck båda ögonen med ögon trippel antibiotika (Neosporin / polymyxin / bacitracin) salva med dexametason, och placera djuret på en 37 ° C värmedyna i en enda inrymt bur under noggrann uppsikt tills full återhämtning.
- Rengör kontaktlins med destillerat watten och torka torrt med en icke-slipande rengöringsduk för framtida bruk.
- Två dagar efter induktion utvärdera synnerven ödem både ögonbotten färgfotografering och SD-oktober analys 8.
OBS: Vid jämförelse av graden av synnerven ödem ger en uppskattning av svårighetsgrad av synnerven ischemi. Vid två dagar, synnerven skivan marginal suddig och retinala vener är något vidgade, jämfört med den kontralaterala (un-inducerad) ögat. Utför elektroretinografi (ERG) och blixt visuellt framkallat potential (VEP 11) vid två och fyra veckor efter induktion för elektrofysiologi analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontaktlinser aktiverat centrala näthinnan visualisering (Figur 1). Brännlaserfläcken belyser den optiska skivan på baksidan av näthinnan (Figur 2). Den normala un-inducerad näthinnan visas avbildas av spaltlampa bio-mikroskop (figur 3A) och genom SD-oktober (figur 3B och 3C). Under laser induktion, när inget färgämne finns närvarande i cirkulationen, laserljus resulterar inte i kärlet och disk fluorescens (Figur 4A). Intravenös RB och laserljusbelysning på de optiska skivresulterar i en gyllene färg fluorescens på synnerven (Figur 4B). Två dagar efter rNAION induktion, är synnerven svullna (Figur 5A). En ansikte och tvärsnitts SD-oktober avslöja disken svullnad (figur 5B) och expansion av synnerven (figur 5C).
t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1. Schematisk av Rat plankonkav kontaktlins. Den specialtillverkade kontaktlinsen är gjord av 3 mm plexiglas (utformning visad), med ytterdiameter 7 mm, innerdiameter 5 mm. Detta objektiv är utformad för att passa över hornhinnan i råtta ögat, och möjliggör direkt visualisering av näthinnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk bild av rNAION Model. Längsgående tvärsnitt genom baksidan av ögat. Laserpunkten är centrerad på den optiska skivan (gröna pilar). Den gröna cellen och axon representerar näthinneganglieceller neuron. Omedelbart efter intravenös RB administration, cirkulerar RB genom kärlsystemet i bakre delen av ögat och synnerven. Laserstrålen används för att belysa skiva för 7-12 sekunder beroende på ischemisk svårighetsgrad önskas. Lasern aktiverar fotosensibiliserande RB att generera superoxidradikaler, vilket orsakar kapillär stängning i främre på huvudet (axonal ischemi, ses på den vänstra sidan av nerven som förlust av små röda linjer) utan att skada de större intraretinal fartyg som framkommit på huvudet in i ögat. Bränn ischemi producerar lokaliserad axonal dysfunktion (villa grön linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Baseline Normal Retina (RET) och synnerven (ON) Analys med hjälp av färgfotografi och SD-oktober A. Bild av en normal Sprague-Dawley-råtta retinal fundus genom spaltlampa ögonbottenfotografering. De retinala kärl kommer ut från den optiska skivan för att förse de inre skikten hos näthinnan. Skivan har en tydlig gräns och en rödaktig omgivande nyans (koroidal flush). Näthinnans kärl är tunna och jämnt fördelade. Synnerven skivan marginal brukar väl avgränsade före rNAION induktion. B. Bild på en normal fundus genom en face SD-oktober avbildning. Individuella tvärsnittsbilder av näthinnan som visas i panel C genereras inifrån den gröna rutan. Avsökningsriktningen visas med en grön pil. C. Single SD-oktober tvärsnitt genomsökning av normal retina och optisk skiva som visar retinaskikt. Näthinnans nervfiberlager (RNFL, liten vit pil) har en gråaktig utseende, men är lättare än den underliggande yttre nukleära lagret (ENDA, liten vit pil). Den RNFL är platt mot synnerven. Synnerven skugga är smal (ange d med två pilar). ON: synnerven. RNFL: retinal ganglion cell / nervfiberskiktet. ENDA: yttre kärnskiktet. Skala bar:. 200 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. rNAION Induktions Utseende. A. 532 nm / 500 um fläck laserbelysning av synnerven skiva och näthinnan utan systemisk RB injektion. Synnerven skiva och näthinnan är mörkt. B. 532 nm laserbelysning 30 sek efter systemisk RB injektion. ON visar en gyllene glöd i kärlen som fram skivan vid laserpunkt platsen, vilket tyder på systemisk RB i blodet upplyst av grönt laserljus.g "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. näthinnan och synnerven Analys 2 dagar efter rNAION induktion. A. Färg fundus bilden visar PÅ svullnad och optisk skiva blekhet, med förlust av omgivande koroidala flush. De vener är oftast förstoras och böjda, ibland med boxed (avbruten flöde) vener. B. En face SD-oktober bild efter induktion visar skiva ödem och venösa utvidgning. Individuell tvärsnitt genereras inifrån den gröna rutan. Avsökningsriktningen visas med en grön pil. C. Tvärsnitt visar på disk ödem, vilket framgår av ökad tjocklek av RNFL och reducerad grå intensitet (mer vitt, i överensstämmelse med högre vattenhalt). Diametern hos den intra-retinala ON (indikerat mellan black pilar) ökas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan det finns ett antal modeller av optisk nervskada (synnerven krossa 12, synnerven transection 13, och PION 14), är rNAION modellen human, anpassningsbara till både råttor och möss. Den mer liknar den humana kliniska tillstånd av NAION. Detta tillstånd omfattar progressiv främre synnerven ödem, en främre synnerven kompartmentsyndrom, fokal axonal ischemi, isolerade retinal gangliecell axonal skada och förlust under en längre tidsförlopp. Den aktuella rapporten ger lämpliga åtgärder för rNAION induktion, diskuterar eventuella problem under induktion, och beskrivs tidigt efter induktion analyser som kan användas för att bedöma kvaliteten på den inducerade skadan innan uppgifter integration. Fördelen med den rNAION modellen är att med praktiken kan åstadkommas relativt konsekventa nivåer av skador. Typiskt 10 - 11 sek exponering resulterar i 40-65% RGC förlust. Framgången kan variera från individ till individ, deavvaktan på erfarenhet och skicklighet, men en erfaren utredare kan uppnå nästan en 100% induktionseffekt.
Förutom dess lätthet att induktion, kan svårighetsgraden och tidsförloppet av lesionen lätt övervakas. En viktig början av kvalitetskontrollen i rNAION modellen, som kan lägga till att modellera fördelar, är tidigt efter induktion analys. Vi utvärderar normalt djuren två dagar efter induktion, när synnerven ödem är maximal. Den rNAION kännetecknas av synnerven ödem som löser under fem dag (ungefär 5 gånger snabbare än vad som förekommer hos människa), följt av synnerven blekhet och isolerade retinal ganglion cellförlust. Man kan identifiera retinal ischemi (till skillnad från synnerven ischemi) genom förlust av retinal transparens och blekning av näthinnan. Retinal ischemi funktionellt bekräftas av förlust av inre retinal signal med elektroretinografi (ERG). Om det finns en utbredd förlust av retinal öppenhet och vittning av näthinnan, föreslår den diffus retinal ischemi, vilket är förenligt med central retinal venocklusion, och inte rNAION ensam. Om induktionsresulterar i svår retinal ischemi i ett antal djur (som kännetecknas av sektions eller total retinal whitening), kan induktionsparametrarna minskas med en eller två sekunder exponeringstid. På detta sätt kan man optimera både graden av optisk nervskada och få konsekvens av induktion i djur. Djur med betydande förlust av ERG signal bör elimineras ur studien. Isolerad förlust av synnerven funktion kan bekräftas genom flash visuellt framkallat potentialmätning (VEP).
Det finns ett antal variabler som ska hållas i åtanke när du använder rNAION modell. Individuella djur kan skilja sig i den totala svårighetsgraden av skadan, så att flera djur måste användas i neuroprotektiva analyser, och en maktanalys bör utföras för att bestämma det minsta antalet djur som behövs för att uppnå en staiskt giltiga resultat, i synnerhet när en mer blygsam skyddande effekt ses eller förutsedda. Vi har funnit att 10 - 15 djur krävs för att bestämma en 25% RGC skyddande effekt på råttor, och 15 - 20 djur när möss används. Eftersom RB färgämne som används i induktions elimineras snabbt, så snart djuret injiceras, variabilitet kan också vara beroende av hastigheten av den tid som krävs för att utföra induktion. Små skillnader i fokus på den optiska skivan, skillnader i vinkel laserbelysning, och en skillnad i hastighet induktion kan också påverka resultatet. En dedikerad individ bör väljas för att utföra tekniken i varje labb, för att ytterligare minska variabilitet. Ungefär 10-15% av inducerade djur kan behöva tas bort efter tidigt efter induktion utvärdering på grund av svårighetsgraden av induktion (central eller filial retinal ocklusion). Denna rapport diskuterar inte otaliga andra inneboende variabler som kan påverka resultatet, exempelvis från könsskillnader,dygnsrytmen, och ålder eller stamskillnader. Dessa frågor måste uppfyllas av den enskilde forskaren. Det finns andra modifierade parameterinställningar nyligen rapporterats, såsom 80 mW lasereffekt 15. Dessa ändringar använt olika kontaktlins eller laservåglängd men resulterade i liknande resultat.
Det är viktigt att inse att trots likheterna rNAION till många aspekter av kliniska NAION är rNAION en modell, och ingen modell är en perfekt kopia av en human sjukdom, eftersom de faktiska orsaksfaktorer i NAION är okända, och det vaskulära och inflammatorisk fysiologisk kontroll av gnagare näthinnan och synnerven skiljer sig på många sätt från den humana och icke-humana primater. Rön som genereras av modellen måste tolkas i ljuset av dessa skillnader. Oavsett detta är rNAION modellen en värdefull metod för snabbt dissekera många av de potentiella patofysiologiska mekanismer som ansvarar för synnedsättning och metodertill neuroprotektion i en levande däggdjurssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar de många studenter och kamrater som har arbetat med denna modell för att förbättra sin effektivitet och att förstå dess mekanismer. Särskilda tack till Dr-talet. Mary Johnson (University of Maryland-Baltimore), Nitza Goldenberg-Cohen (Schneiderman Childrens Hospital, Petah-Tikva, Israel), Charles Zhang (Einstein Medical College, Bronx, NY), och Valerie Touitou (Hopital Salpetrie, Paris, Frankrike). Denna studie har finansierats delvis av RO1 EY015304 till SLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mW 532 nm laser | Iridex | Standard Ophthalmic Laser | |
| 0 - 100 mW 532 nm laser | Laserglow technologies | Substitute for iridex | |
| Laser slit lamp adapter | Iridex | SMA coupled adapter for laser output | |
| Coherent Fieldmate laser meter with thermopile sensor | Coherent | others also appropriate | |
| Ophthalmic Examing Slit lamp biomicroscope | Various | Haag-Streit is the best; cheaper versions available on ebay | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Photoinducing agent |
| Fundus Contact lens or glass cover slip | custom/Cantor and Nissel (UK) | Custom designed planoconvex plastic lens for eye exam and induction | |
| Tropicamide 1% | |||
| Tamiya polishing compound | Tamiya, INC | 87068 | polishing contact lens |
| 2.5% Hypromellose (Goniovisc)/1% Methycellulose | HUB Pharmaceuticals | contact lens coupling agent | |
| 2.5% Neosynephrine Ophthalmic drops | Alcon labs | pupil dilating agent | |
| Tropicamide 1% | Alcon labs | pupil dilating agent | |
| 0.5% Proparacaine | Alcon labs | topical Anesthetic | |
| 30 G fused needle insulin syringe | Various | Various | for intravenous injection of rose bengal |
| Ophthamic Antibiotic ointment with dexamethasone added (Triple antibiotic ointment) | Various | Various | Apply after induciton to minimize corneal scarring |
| Heidelberg Corporation Spectral domain-Optical Coherence Tomograph | Heidelberg Corporation | For Optical coherence measurements baseline and post-induction; not essential for induction |
References
- Banik, R. Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy: An Update on Demographics, Clinical Presentation, Pathophysiology, Animal Models, Prognosis, and Treatment. J. Clin. Experimental Ophthalmol. 10, 1-5 (2013).
- IONDT study group. Characteristics of patients with nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy eligible for the Ischemic Optic Neuropathy Decompression Trial. Arch Ophthalmol. 114, 1366-1374 (1996).
- Tesser, R. A., Niendorf, E. R., Levin, L. A. The morphology of an infarct in nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Ophthalmology. 110, 2031-2035 (2003).
- Bernstein, S. L., Johnson, M. A., Miller, N. R. Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) and its experimental models. Prog Retin Eye Res. 30, 167-187 (2011).
- Nicholson, J. D., et al. PGJ2 Provides Prolonged CNS Stroke Protection by Reducing White Matter Edema. PLoS One. 7 (12), (2012).
- Goldenberg-Cohen, N., et al. Oligodendrocyte Dysfunction Following Induction of Experimental Anterior Optic Nerve Ischemia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 2716-2725 (2005).
- Bernstein, S. L., Guo, Y., Kelman, S. E., Flower, R. W., Johnson, M. A. Functional and cellular responses in a novel rodent model of anterior ischemic optic neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 4153-4162 (2003).
- Berger, A., et al. Spectral-Domain Optical Coherence Tomography of the Rodent Eye: Highlighting Layers of the Outer Retina Using Signal Averaging and Comparison with Histology. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Huang, T. L., et al. Protective effects of systemic treatment with methylprednisolone in a rodent model of non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION). Exp Eye Res. 131, 69-76 (2015).
- Mantopoulos, D., et al. An Experimental Model of Optic Nerve Head Injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, 6222 (2014).
- You, Y., et al. Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination. J. Vis. Exp. (101), e52934 (2015).
- Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol Vis. 18, 2147-2152 (2012).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System. J Vis Exp. (51), e2241 (2011).
- Wang, Y., et al. A Novel Rodent Model of Posterior Ischemic Optic Neuropathy. JAMA Ophthalmol. 131 (2), 194-204 (2013).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Chang, S. W., Lin, K. H., Tsai, R. K. Efficacy of Intravitreal Injections of Antivascular Endothelial Growth Factor Agents in a Rat Model of Anterior Ischemic Optic Neuropathy. IOVS. 56, 2290-2296 (2015).
