Introduction
Anterior não arterítica neuropatia óptica isquêmica (NAION) é uma lesão isquêmica focal da porção anterior do nervo óptico (ON) 1. NAION é a causa mais comum de súbita nervo relacionada perda de visão óptica em indivíduos com idade superior a 50 2. O mecanismo acredita-se ser uma síndrome do compartimento que resulta em edema intraneural, e provoca a compressão dos capilares que abastecem os axónios no interior do nervo óptico 3.
Uma vez que o NO é, na verdade, um aparelho do sistema nervoso central (SNC), o modelo de roedor NAION (rNAION) podem ser usadas para estudar os mecanismos e as respostas a derrames do SNC isolada da substância branca. O modelo rNAION podem portanto ser úteis no dissecando muitos problemas associados com o acidente vascular cerebral relacionado danos à substância branca. Ele pode ser usado para avaliar diferentes estratégias neuroprotectoras e agentes de acidente vascular cerebral em matéria branca.
Uma das características mais atraentes do modelo é que ele é, Um procedimento não invasivo indolor. A energia laser pode ser ajustado para produzir vários graus de dano isquémico. Outra característica é que ele se baseia em radicais superóxido induzida por laser para danificar o endotélio capilar, produzindo uma disfunção progressiva capilar. É esta disfunção progressiva e edema que acredita-se ser muito semelhante ao mecanismo que faz com que NAION. A pesquisa mostrou que ele não causa a coagulação do capilar directa, mas funciona através de pelo menos dois mecanismos: superóxido induzida por morte e de extracção de algum do capilar de células endoteliais 4, e de NFkB (factor nuclear-cadeia kappa-luz-potenciador de células B activadas ) associado regulação inflamatória-se em permanecer endotélio, com o aumento do transporte de fluidos através das membranas celulares para o interstício 5. O encerramento dos capilares nervo óptico e compressão causados por resultado a acumulação de fluido intersticial em isquemia cabeça do nervo óptico. Um diagrama esquemático é mostrado naFigura 2. O modelo rNAION pode ser usado em ambas as espécies de ratos e camundongos 6,7, e pode ser variada no nível da sua gravidade, a partir de uma lesão ligeira a uma destruição total, mas indolor do nervo óptico e da retina, tais como a oclusão da artéria central da retina (OACR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este protocolo foi aprovado pela Universidade de Maryland Animal Care Institucional e Comitê de Utilização (IACUC; Baltimore, MD, EUA)
1. Experimental Set-up
- Faça um costume projetado lente de contato de um grau claro óptica circular 7 mm de diâmetro Plexiglas, de 3 mm de espessura. Corte as lentes circulares com uma imprensa de broca. Use uma broca padrão para fazer a curva interior, e, finalmente, polir as curvas internas e externas usando um polidor de lentes de contato do grão ultrafino (1000/3000).
- Prepare 2,5 mM Rose Bengal (RB) em pH 7,4 tampão fosfato salino (PBS) com antecedência, filtro de esterilização com um filtro de seringa de 0,45 micron e armazenamento de alíquotas de 1 ml em -20 ° C num recipiente à prova de luz até 6 meses.
NOTA: O uso de animais machos exogâmicas albinos, como Sprague Dawley minimiza as diferenças de resposta dependentes de tensão, permite maior facilidade de indução e reduz a variabilidade que pode ocorrer com cycli estrofeminino ng. - Configurar a frequência duplicou granada de alumínio de neodímio-ítrio (Fd-YAG) laser médico oftalmológico, o que gera uma luz laser de 532 nm. Montar o laser sobre uma lâmpada de fenda oftálmica Haag-Streit usando um adaptador de laser oftalmológico padrão. Este dispositivo disponível comercialmente permite a visualização simultânea de aplicação mancha olho e laser do animal. O laser médico também tem um feixe de mira para a focagem adequada e centragem utilizando mesmo tamanho de ponto como indução laser. parâmetros de potência do laser são os seguintes:
- Para a indução rNAION rato: use 500 um ponto de tamanho / 50 do laser mW de potência / 1.000 ms duração / 1.000 intervalo ms.
- Para a indução rNAION mouse: alterar o tamanho do ponto a 300 mm para disco óptico menor e deixar outros parâmetros o mesmo que a configuração do rato.
- Rotineiramente usar um medidor de potência do laser para assegurar a potência do laser.
2. Procedimento Experimental
- Ligue a potência do lasere configurar o parâmetro do laser apropriado. Aquecer a laser para, pelo menos, cinco minutos antes da utilização.
- Pesa-se o animal para determinar a dose apropriada para a cetamina / xilazina e corante RB. Anestesiar o animal por injecção intraperitoneal de uma mistura de 1 ml / kg de 80 mg / ml de cetamina e 4 mg / ml de xilazina.
- Deixe o animal em uma gaiola aquecida até que esteja totalmente anestesiado. Verifique se há nenhuma resposta a estímulos aversivos (cauda ou pitada dedo do pé). Verifique animais para a profundidade da anestesia a cada 10 min.
- Dilatar as pupilas do animais com tropicamida a 1% e anestesiar a superfície do olho com 0,5% de proparacaina. Se o uso de animais pigmentados, como Long Evans, um 2,5% gotas oculares neosynephrine vai aumentar a dilatação da pupila.
- Use a tesoura para cortar os bigodes perto do focinho do lado para ser induzido para evitar o bloqueio a vista.
- Coloque uma gota de 1% de metilcelulose ou outra gota de acoplamento oftálmica para o interior da lente de contato feito por encomenda, e depois aplicar a lente em tele olho de rato.
- Colocar o animal sobre uma plataforma ajustada para a altura da lâmpada de fenda. Definir a cabeça do animal em um ângulo de 45 °, de modo que o olho é perpendicular à lâmpada de fenda e feixe de laser.
- Visualize no olho através da lâmpada de fenda oftálmica. Verifique se o feixe de mira é o tamanho certo, bem como focado e centrado diretamente sobre o nervo óptico visualizado. Fotografar o fundo da retina usando uma câmera digital com alta ASA (1.200 - 2.000) Velocidade montado em uma das peças oculares da lâmpada de fenda com um adaptador personalizado feito.
NOTA: A capacidade de ver os vasos da coróide revela a transparência da retina. Este é um sinal importante, a fim de ser capaz de detectar a isquemia retiniana mais tarde, que podem confundir a interpretação, se ocorrer. rNAION é a isquemia do nervo óptico, o que resulta na perda de CGR isolado, enquanto isquemia retinal resulta em danos na retina que afecta todas as células das camadas internas da retina. - Opcionalmente, ainda mais a imagem da retina enervo óptico usando um domínio de óptica espectral coerência tomógrafo (SD-08 de outubro) para avaliar o olho induzida por un. Digitalizar en face (Figura 3B), bem como 7 varreduras em corte transversal através da retina (Figura 3C). O SD-OCT imagem usa a mesma lente de contato usado para indução laser.
- Injectar 1 ml / kg RB por via intravenosa através da veia da cauda, e aguarde 30 segundos, em seguida, ativar o poder do laser. Este atraso de tempo permite que a RB para distribuir uniformemente por toda a circulação. Nós usamos um pulso de laser de 50 mW em um seg / pulso. energias maiores (≥ 60 mW) pode danificar a retina ou causar isquemia vascular da retina.
Cuidado: Certifique-se de toda a gente tem um par de óculos de filtragem de segurança do laser do comprimento de onda de bloqueio adequada para evitar a luz do laser de rua entrando olho do investigador.
NOTA: A administração de laser deve ser administrado rapidamente após a injecção IV RB desde que o corante é rapidamente eliminado da circulação. Quanto mais tempo a indução de laser, quanto mais grave a isquemia do nervo óptico. Geralmente, os animais são dadas 7 - 12 s impulsos numa sucessão rápida. O contacto da luz laser com o corante circulante dá os vasos do nervo óptico uma bela brilho de ouro que pode ser visto através da lâmpada de fenda (Figura 4B). Isto prova que o corante foi injectada sistemicamente e distribuída para a corrente sanguínea. Se o brilho é fraco, ou nenhum (Figura 4A), o corante não foi injetado por via intravenosa. Neste caso, não dão uma segunda injecção imediatamente, uma vez que o animal vai necessitar de recuperar durante pelo menos dois dias antes da reinjecção. - Imediatamente após a indução, retire a lente de contato. Cubra os dois olhos com pomada oftálmica antibiótica triplo (Neosporin / polimixina / bacitracina) com dexametasona, e colocar o animal em uma almofada de aquecimento de 37 ° C em uma única gaiola alojados sob observação até a recuperação completa.
- Limpe a lente de contato com água destilada water e seque com um pano de limpeza não abrasivo para uso futuro.
- Dois dias após a indução avaliar o edema do nervo óptico por ambos cor fotografia fundo e SD-OCT análise 8.
NOTA: Comparando o grau de edema do nervo óptico dá uma estimativa da gravidade da isquemia do nervo óptico. Em dois dias, a margem de disco nervo óptico é turva, e as veias da retina são ligeiramente dilatada, em comparação com o olho contralateral (induzida por un). Execute eletrorretinografia (ERG) e flash potencial evocado visual (VEP 11) em duas e quatro semanas após a indução para análise de eletrofisiologia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A visualização da lente de contato habilitado central de retina (Figura 1). O ponto de laser focal ilumina o disco óptico na parte posterior da retina (Figura 2). A retina normal, induzida por un é mostrado fotografada pela lâmpada de fenda bio-microscópio (Figura 3A) e pela SD-OCT (Figura 3B e 3C). Durante a indução do laser, quando não está presente corante está presente na circulação, de luz laser não resulta em vaso e fluorescência de disco (Figura 4A). RB intravenosa ea iluminação de luz laser sobre os resultados de disco óptico em uma fluorescência cor dourada sobre o nervo óptico (Figura 4B). Dois dias após a indução rNAION, o nervo óptico está inchado (Figura 5A). En face e em corte transversal SD-OCT revelar disco inchaço (Figura 5B) e a expansão do nervo óptico (Figura 5C).
t "fo: manter-together.within-page =" 1 ">
Figura 1. Esquema do Rat plano-convexa da lente de contato. O costume fez lente de contato é feito a partir de 3 Plexiglas mm (desenho mostrado), com diâmetro externo 7 mm, diâmetro interno de 5 mm. Esta lente é projetado para caber sobre a córnea do olho de rato, e permitir a visualização direta da retina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Modelo esquemático de rNAION. Secção transversal longitudinal através da parte traseira do olho. O ponto de laser está centrada no disco óptico (setas verdes). A célula verde e axônio representa o neurônio células ganglionares da retina. Imediatamente após admi RB intravenosanistração, a RB circula através da vasculatura na parte posterior do olho e do nervo óptico. O feixe de laser é usada para iluminar o disco durante 7-12 segundos, dependendo da gravidade isquémica desejado. O laser ativa o RB fotossensibilizante para gerar radicais superóxido, o que causa o fechamento capilar no anterior na cabeça (isquemia axonal; visto no lado esquerdo do nervo como a perda de pequenas linhas vermelhas), poupando os vasos intra-retinianas maiores emergentes da cabeça ON para dentro do olho. A isquemia focal produz disfunção axonal localizada (independente linha verde). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. linha de base normal Retina (RET) e Nervo Óptico (ON) Análise usando a fotografia a cores e SD-outubro A. Imagem de um rato Sprague-Dawley fundo de olho normal da retina por retinografia lâmpada de fenda. Os vasos retinianos emergem a partir do disco óptico para fornecer as camadas internas da retina. O disco tem uma fronteira clara e uma tonalidade avermelhada circundante (nivelada coróide). Os vasos retinianos são finas e uniformemente distribuída. A margem de disco do nervo óptico é geralmente bem demarcada antes da indução rNAION. B. Imagem de um fundo normal por en face SD-OCT imagem. Individuais imagens das secções transversais da retina mostra o painel C são gerados a partir de dentro da caixa verde. Direção da digitalização é mostrado com uma seta verde. Varredura secção C. Único SD-OCT cruz de retina normal e disco óptico que mostra as camadas da retina. A camada de fibras nervosas da retina (CFNR, pequena seta branca) tem uma aparência acinzentada, mas é mais leve do que a camada subjacente exterior nuclear (ONL, pequena seta branca). A CFN é plana contra o nervo óptico. A sombra do nervo óptico é estreita (indicar d por duas setas). ON: nervo óptico. CFNR: camada de fibra de células / nervos ganglionares da retina. ONL: camada nuclear exterior. Barra de escala:. 200 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. rNAION Indução Aparência. A. 532 nm / 500 mm local iluminação do laser do disco do nervo óptico e da retina sem injecção RB sistêmica. O disco do nervo óptico e da retina são escuros. B. 532 nm iluminação do laser de 30 segundos após a injecção RB sistêmica. A ON mostra um brilho dourado no interior dos vasos emergentes a partir do disco no local do ponto do laser, indicando RB sistémica na corrente sanguínea iluminado pela luz laser verde.g "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Retinal e Optic Nerve Análise de 2 dias após imagem fundus rNAION indução. A. Cor mostra ON inchaço e palidez do disco óptico, com perda de o flush coróide circundante. As veias geralmente são ampliadas e curvo, às vezes com (fluxo interrompido) veias encaixotados. B. rosto En SD-OCT imagem pós-indução mostra edema do disco e dilatação venosa. seção transversal individual é gerada a partir de dentro da caixa verde. direção da digitalização é mostrado com uma seta verde. C. secção transversal mostra sobre o edema do disco, como evidenciado pelo aumento da espessura do CFN e reduzida intensidade de cinzento (mais branca, consistente com maior teor de água). O diâmetro do ON intra-retinal (indicado entre o blsetas ACK) é aumentada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embora haja um certo número de modelos de lesão do nervo óptico (esmagamento do nervo óptico 12, a transecção do nervo óptico 13, e PION 14), o modelo rNAION é humano, adaptável a ambos os ratos e ratinhos. Assemelha-se mais de perto a situação clínica humana de NAION. Esta condição inclui anterior progressiva edema do nervo óptico, uma síndrome do compartimento anterior do nervo óptico, isquemia focal axonal, isolado lesão axonal de células ganglionares da retina e perda de mais de um curso de tempo prolongado. O relatório de corrente dá os passos adequados para a indução rNAION, discute os problemas durante a indução, e analisa a indução precoce pós descrito que pode ser usado para avaliar a qualidade da lesão induzida antes da inclusão de dados. A vantagem do modelo rNAION é que com a prática, níveis relativamente consistentes de danos pode ser alcançado. Tipicamente 10 - 11 resultados de exposição sec em 40 - perda de RGC 65%. A taxa de sucesso pode variar de indivíduo para indivíduo, dependente na experiência e habilidade, mas um investigador experiente pode conseguir quase uma taxa de indução de 100%.
Além da sua facilidade de indução, o campo de gravidade e tempo da lesão pode ser facilmente monitorizado. Uma primeira parte importante do controle de qualidade no modelo rNAION, que pode adicionar para modelar vantagens, é a análise de indução pós cedo. Nós normalmente avaliar os animais de dois dias após a indução, quando o edema do nervo óptico é máxima. O rNAION é caracterizada por edema do nervo óptico que resolve ao longo de um período de cinco dias (cerca de 5 vezes mais rapidamente do que o que ocorre em seres humanos), seguido pela palidez do nervo óptico e perda de células ganglionares da retina isolada. Pode-se identificar isquemia da retina (como distinto de isquemia do nervo óptico), através da perda de transparência da retina e branqueamento da retina. a isquémia retinal é funcionalmente confirmada pela perda de sinal da retina interna com eletroretinografia (ERG). Se houver perda generalizada de transparência da retina e brancoNing da retina, isquemia da retina sugere difusa, o que é consistente com a oclusão da veia retinal central, e não rNAION sozinho. Se os resultados de indução de isquemia retiniana em um número de animais (caracterizado pelo branqueamento da retina corte ou total), os parâmetros de indução pode ser reduzida por um ou dois segundos de tempo de exposição. Desta forma, pode-se optimizar tanto o grau de lesão do nervo óptico, e obter a consistência de indução em animais. Os animais com uma perda significativa de sinal ERG devem ser eliminados do estudo. Perda isolada da função do nervo óptico pode ser confirmado pelo flash visuais de medição de potencial evocado (VEP).
Há uma série de variáveis a serem mantidos em mente quando se utiliza o modelo rNAION. Os animais individuais podem diferir na gravidade global da lesão, de modo que vários animais precisam de ser usados nos ensaios neuroprotectores, e uma análise de potência deve ser realizada para determinar o número mínimo de animais necessários para alcançar uma STAestatisticamente resultados válidos, particularmente quando um efeito protetor mais modesto é visto ou previsíveis. Verificou-se que 10 - 15, os animais são necessários para a determinação de um efeito protector de 25% das CGR em ratos, e 15 - 20 animais quando os ratos são usados. Uma vez que o corante RB utilizado na indução é rapidamente eliminado, uma vez que o animal é injectado, a variabilidade também pode ser dependente da velocidade do tempo necessário para realizar a indução. Pequenas diferenças no foco sobre o disco óptico, diferenças no ângulo de iluminação a laser, e uma diferença na velocidade de indução também pode afetar o resultado. Um indivíduo dedicado deve ser seleccionado para realizar a técnica em cada um laboratório, para reduzir ainda mais a variabilidade. Cerca de 10 - 15% de animais induzidos podem precisar de ser eliminado após a avaliação pós-indução precoce, devido à gravidade da indução (oclusão da veia retinal central ou ramo). Este relatório não discute uma miríade de outras variáveis intrínsecas que podem influenciar resultados, como de diferenças de sexo,ritmo circadiano, e deterioração ou o esforço diferenças. Estas questões devem ser satisfeitas pelo investigador individual. Existem outros parâmetros modificados recentemente relatadas, tais como 80 mW de potência de laser 15. Estas modificações usadas lentes de contato diferente ou comprimento de onda do laser, mas resultou em resultados semelhantes.
É importante perceber que, apesar das semelhanças de rNAION para muitos aspectos de NAION clínica, rNAION é um modelo, e nenhum modelo é uma duplicata perfeita de uma doença humana, uma vez que os factores causais reais em NAION são desconhecidos, e o vascular e inflamatórias controle fisiológico da retina de roedores e nervo óptico são diferentes em muitos aspectos, do primata humanos e não humanos. Resultados gerados pelo modelo precisa ser interpretada à luz dessas diferenças. Independentemente disso, o modelo rNAION é um método valioso de dissecar rapidamente muitos dos potenciais mecanismos fisiopatológicos responsáveis pela perda visual e abordagensa neuroprotecção num sistema de mamífero vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos aos muitos estudantes e companheiros que trabalharam sobre este modelo para melhorar a sua eficácia, e compreender seus mecanismos. Agradecimentos especiais são devidos a Dr de. Mary Johnson (Universidade de Maryland-Baltimore), Nitza Goldenberg-Cohen (Schneiderman Childrens Hospital, Petah-Tikva, Israel), Charles Zhang (Einstein Medical College, Bronx, NY), e Valerie Touitou (Hopital Salpetrie, Paris, França). Este estudo foi financiado em parte por RO1 EY015304 para SLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mW 532 nm laser | Iridex | Standard Ophthalmic Laser | |
| 0 - 100 mW 532 nm laser | Laserglow technologies | Substitute for iridex | |
| Laser slit lamp adapter | Iridex | SMA coupled adapter for laser output | |
| Coherent Fieldmate laser meter with thermopile sensor | Coherent | others also appropriate | |
| Ophthalmic Examing Slit lamp biomicroscope | Various | Haag-Streit is the best; cheaper versions available on ebay | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Photoinducing agent |
| Fundus Contact lens or glass cover slip | custom/Cantor and Nissel (UK) | Custom designed planoconvex plastic lens for eye exam and induction | |
| Tropicamide 1% | |||
| Tamiya polishing compound | Tamiya, INC | 87068 | polishing contact lens |
| 2.5% Hypromellose (Goniovisc)/1% Methycellulose | HUB Pharmaceuticals | contact lens coupling agent | |
| 2.5% Neosynephrine Ophthalmic drops | Alcon labs | pupil dilating agent | |
| Tropicamide 1% | Alcon labs | pupil dilating agent | |
| 0.5% Proparacaine | Alcon labs | topical Anesthetic | |
| 30 G fused needle insulin syringe | Various | Various | for intravenous injection of rose bengal |
| Ophthamic Antibiotic ointment with dexamethasone added (Triple antibiotic ointment) | Various | Various | Apply after induciton to minimize corneal scarring |
| Heidelberg Corporation Spectral domain-Optical Coherence Tomograph | Heidelberg Corporation | For Optical coherence measurements baseline and post-induction; not essential for induction |
References
- Banik, R. Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy: An Update on Demographics, Clinical Presentation, Pathophysiology, Animal Models, Prognosis, and Treatment. J. Clin. Experimental Ophthalmol. 10, 1-5 (2013).
- IONDT study group. Characteristics of patients with nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy eligible for the Ischemic Optic Neuropathy Decompression Trial. Arch Ophthalmol. 114, 1366-1374 (1996).
- Tesser, R. A., Niendorf, E. R., Levin, L. A. The morphology of an infarct in nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Ophthalmology. 110, 2031-2035 (2003).
- Bernstein, S. L., Johnson, M. A., Miller, N. R. Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) and its experimental models. Prog Retin Eye Res. 30, 167-187 (2011).
- Nicholson, J. D., et al. PGJ2 Provides Prolonged CNS Stroke Protection by Reducing White Matter Edema. PLoS One. 7 (12), (2012).
- Goldenberg-Cohen, N., et al. Oligodendrocyte Dysfunction Following Induction of Experimental Anterior Optic Nerve Ischemia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 2716-2725 (2005).
- Bernstein, S. L., Guo, Y., Kelman, S. E., Flower, R. W., Johnson, M. A. Functional and cellular responses in a novel rodent model of anterior ischemic optic neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 4153-4162 (2003).
- Berger, A., et al. Spectral-Domain Optical Coherence Tomography of the Rodent Eye: Highlighting Layers of the Outer Retina Using Signal Averaging and Comparison with Histology. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Huang, T. L., et al. Protective effects of systemic treatment with methylprednisolone in a rodent model of non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION). Exp Eye Res. 131, 69-76 (2015).
- Mantopoulos, D., et al. An Experimental Model of Optic Nerve Head Injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, 6222 (2014).
- You, Y., et al. Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination. J. Vis. Exp. (101), e52934 (2015).
- Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol Vis. 18, 2147-2152 (2012).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System. J Vis Exp. (51), e2241 (2011).
- Wang, Y., et al. A Novel Rodent Model of Posterior Ischemic Optic Neuropathy. JAMA Ophthalmol. 131 (2), 194-204 (2013).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Chang, S. W., Lin, K. H., Tsai, R. K. Efficacy of Intravitreal Injections of Antivascular Endothelial Growth Factor Agents in a Rat Model of Anterior Ischemic Optic Neuropathy. IOVS. 56, 2290-2296 (2015).
