Introduction
Nonarteritic iskemisk fremre optikusnevropati (NAION) er et samlings iskemisk lesjon i fremre delen av synsnerven (ON) 1. NAION er den vanligste årsaken til plutselig synsnerverelatert synstap hos personer over 50 år to. Mekanismen antas å være en kupé syndrom som resulterer i intraneural ødem, og fører til kompresjon av kapillærene leverer aksonene innen synsnerven 3.
Siden ON er faktisk en sentralnervesystemet (CNS) kanalen, kan det gnager NAION (rNAION) modellen brukes til å studere mekanismer og reaksjoner på isolerte CNS hvit substans slag. Den rNAION modellen kan derfor være nyttig i å dissekere mange problemer forbundet med hjerneslag relatert skade på hvit substans. Den kan brukes til å evaluere ulike nervecellene strategier og agenter i hvit substans slag.
En av de mest attraktive funksjonene i modellen er at den eren smertefri, ikke-invasiv prosedyre. Lasereffekten kan justeres for å frembringe varierende grad av ischemisk skade. En annen funksjon er at den er avhengig av laser-indusert superoksidradikaler å skade kapillær endotel, som produserer en progressiv kapillær dysfunksjon. Det er denne dysfunksjon og progressiv ødem som antas å være bemerkelsesverdig lik den mekanismen som forårsaker NAION. Forskning har vist at det ikke medfører direkte kapillær koagulering, men virker gjennom minst to mekanismer: superoksyd-indusert død og stripping av noen av de kapillære endotelceller 4, og NFkB (nukleær faktor kappa-lettkjede-enhancer av aktiverte B-celler ) assosiert inflammatorisk opp regulering i resterende endotel, med øket væsketransport tvers over cellemembranene i interstitium 5. Nedleggelsen av synsnerven kapillærene og kompresjon forårsaket av interstitiell væske opphopning resultat i synsnervepapillen iskemi. Et skjematisk bilde er vist iFigur 2. Den rNAION modellen kan brukes i både rotter og mus arter 6,7, og kan varieres i nivået av dens alvorlighetsgrad, fra en mild lesjon til en komplett, men smertefri ødeleggelse av synsnerven og netthinnen, slik som sentral retinal arterie okklusjon (CRAO).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av University of Maryland Institutional Animal Care og Utnyttelse Committee (IACUC, Baltimore, MD, USA)
1. Eksperimentell Set-up
- Lag en tilpasset designet kontaktlinse fra en klar optisk klasse sirkulære 7 mm i diameter pleksiglass, av 3 mm tykkelse. Skjær de sirkulære objektiver med en søyleboremaskin. Bruke en standard borkrone for å gjøre den indre kurve, og til slutt polere de ytre og indre kurver ved bruk av en kontaktlinse og poler av ultrafine grit (1000/3000).
- Fremstille 2,5 mM Rose Bengal (RB) i pH 7,4 fosfatbuffer, saltvann (PBS) på forhånd, filtersteriliser med et 0,45 mikron sprøytefilter og oppbevares 1 ml alikvoter i -20 ° C i en lystett beholder i opp til 6 måneder.
MERK: Bruk av albino utav hanndyr, for eksempel Sprague Dawley minimerer belastningen avhengig respons forskjeller, gir økt brukervennlighet induksjon og reduserer variasjonen som kan oppstå med estrus cycling kvinne. - Sett opp frekvensen doblet Neodymium-yttrium aluminium granat (FD-YAG) oftalmisk medisinsk laser, som genererer en 532 nm laserlys. Monter laseren på en Haag-Streit oftalmisk spaltelampe ved hjelp av en standard oftalmisk laser adapter. Dette kommersielt tilgjengelig anordning muliggjør samtidig visualisering av dyrets øye og laserpunktet anvendelse. Den medisinske laser har også en siktestråle for riktig fokus og sentrering ved hjelp av samme spot størrelse som laser induksjon. Laser effektparametre er som følger:
- For rotte rNAION induksjon: bruke 500 mikrometer spot størrelse / 50 mW laser makt / 1000 msek varighet / 1000 ms intervall.
- For mus rNAION induksjon: endre punktstørrelsen til 300 pm for mindre optisk plate og la andre parametere den samme som den rotte innstilling.
- Rutinemessig bruke en laser makt meter for å sikre laser effekt.
2. Eksperimentell prosedyre
- Slå på laser maktog sette opp riktig laser parameter. Varm laseren i minst fem minutter før bruk.
- Vei dyret å finne riktig dose for ketamin / xylazin og RB fargestoff. Bedøve dyret ved intraperitoneal injeksjon av 1 ml / kg blanding av 80 mg / ml ketamin og 4 mg / ml xylazin.
- La dyret i en oppvarmet bur inntil fullstendig bedøvet. Sjekk for ingen respons på aversive stimuli (hale eller tå klype). Sjekk dyr for anestesidybden hvert 10 min.
- Utvid dyrets elever med 1% tropikamid og bedøve overflaten av øyet med 0,5% proparacaine. Hvis du bruker pigmenterte dyr, for eksempel Long Evans, vil en 2,5% neosynephrine okulær dråper øke elevens utvidelse.
- Bruk saks til å klippe kinnskjegg nær snuten på siden for å bli overtalt til å unngå å blokkere utsikten.
- Ta en dråpe 1% metylcellulose eller annen øyen kobling slippe til på innsiden av skreddersydde kontaktlinse, og deretter bruke objektivet på than rotte øyet.
- Plasser dyret på en plattform justert til høyden på spaltelampe. Still dyrets hode ved en 45 ° vinkel, slik at øyet er vinkelrett på spaltelampe og laserstrålen.
- Visual øyet gjennom oftalmisk spaltelampe. Kontroller at sikter strålen er riktig størrelse samt fokusert og sentrert direkte på visualisert synsnerven. Fotografere retinal fundus ved hjelp av et digitalt kamera med høy ASA (1200 - 2000) Hastighet montert på en av øyet stykker av spaltelampe med en spesiallaget adapter.
MERK: Evnen til å se koroidal fartøy avslører åpenhet av netthinnen. Dette er et viktig tegn for å være i stand til å detektere senere retinal ischemi, noe som kan forvirre tolkningen hvis det forekommer. rNAION er synsnerven iskemi, noe som resulterer i isolert RGC tap, mens retinal ischemi resulterer i retinal skade som påvirker alle cellene i de indre retinal lag. - Eventuelt ytterligere bilde på netthinnen ogsynsnerven ved hjelp av en spektral domene-optisk koherens tomografi (SD-8 oktober) for å evaluere un-indusert øyet. Skanne en face (figur 3B) samt 7 tverrsnitts skanner gjennom netthinnen (figur 3C). SD-oktober bildebehandling bruker samme kontaktlinser som brukes for laser induksjon.
- Injiser 1 ml / kg RB intravenøst gjennom halevenen, og vent i 30 sekunder, og deretter aktivere laser makt. Denne tidsforsinkelse gjør det mulig for RB for å fordele jevnt i sirkulasjon. Vi bruker en 50 mW laserpuls på en sec / puls. Større energier (≥ 60 MW) kan skade netthinnen eller forårsake retinal vaskulær iskemi.
Forsiktig: Pass på at alle har et par av laser sikkerhet filtrering glass passende blokkerings bølgelengde for å hindre bortkommen laser lys inn etterforsker øye.
MERK: Laseren administrasjonen må gis raskt etter IV RB injeksjon siden fargestoff elimineres raskt fra sirkulasjonen. Jo lengre laseren induksjon, jo mer alvorlig synsnerven iskemi. Vanligvis blir dyrene gitt 7 - 12 sek pulser i en rask rekkefølge. Kontakten av laserlyset med den sirkulerende fargestoff gir på synsnerven fartøyene en vakker gull glød som kan sees gjennom den spaltelampe (figur 4B). Dette beviser fargestoffet ble injisert systemisk og distribuert inn i blodstrømmen. Hvis gløden er svak, eller ingen i det hele tatt (figur 4A), ble fargestoffet ikke injiseres intravenøst. I dette tilfellet, ikke gi en andre injeksjon umiddelbart, ettersom dyret vil måtte komme i minst to dager før reinjisering. - Umiddelbart etter induksjon, fjern kontaktlinsen. Dekk begge øynene med øyen trippel antibiotika (Neosporin / polymyxin / bacitracin) salve med deksametason, og plasserer dyret på en 37 ° C oppvarming puten i en enkelt plassert bur under nøye observasjon før full gjenoppretting.
- Rengjør kontaktlinse med destillert water og tørk av med en ikke-slipende pusseklut for fremtidig bruk.
- To dager etter induksjon evaluere synsnerven ødem av både fundus fargefotografering og SD-oktober analyse 8.
MERK: Sammenligning av graden av synsnerven ødem gir et anslag av hvor alvorlig synsnerven iskemi. På to dager, er synsnerven disk margin uskarpt, og netthinnens årer er noe utvidet, sammenlignet med den kontralaterale (un-indusert) øyet. Utfør elektroretinografi (ERG) og flash visuell fremkalt potensial (VEP 11) på to og fire uker etter induksjon for elektro analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontaktlinsen aktivert sentrale netthinnen visualisering (Figur 1). Det sentrale laser spot lyser papillen på baksiden av netthinnen (figur 2). Den normale un-indusert hinnen er vist avbildet med spaltelampe bio-mikroskop (figur 3A) og av SD-oktober (figur 3B og 3C). Under laser induksjon, når ingen fargestoff er til stede i sirkulasjonen, laserlyset ikke resulterer i kar og disk fluorescens (figur 4A). Intravenøs RB og laser lys belysning på de optiske disken resulterer i en gylden farge fluorescens på synsnerven (figur 4B). To dager etter rNAION induksjon, er synsnerven hovne (figur 5A). En face og tverrsnitts SD-oktober avsløre disk hevelse (figur 5B) og utvidelse av synsnerven (figur 5C).
t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1. Skjematisk av Rat Planoconcave Contact Lens. Den skreddersydde kontaktlinse er laget av 3 mm plexiglass (utforming vist), med ytre diameter 7 mm, indre diameter 5 mm. Dette objektivet er laget for å passe over hornhinnen i rotte øyet, og muliggjør direkte visualisering av netthinnen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk av rNAION modell. Lengdesnitt gjennom den bakre del av øyet. Laseren spot er sentrert på papillen (grønne piler). Den grønne celle og axon representerer gangliecelle nevron. Umiddelbart etter intravenøs RB Administrasjon, sirkulerer RB gjennom vaskulaturen i den bakre del av øyet og synsnerven. Laserstrålen blir brukt til å belyse platen for 7-12 sek avhengig av iskemisk alvorlighetsgrad ønsket. Laseren aktiverer fotosensibiliserende RB å generere superoksidradikaler, noe som fører til kapillær nedleggelse i fremre på hodet (aksonal iskemi, sett på venstre side av nerve som tap av små røde linjer) mens sparsom de større intraretinal fartøy fremvoksende fra på hodet inn i øyet. Det sentrale iskemi produserer lokaliserte aksonal dysfunksjon (enebolig grønn linje). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Baseline Normal Retina (RET) og Optic Nerve (ON) Analyse ved hjelp av fargefotografi og SD-oktober A. Bilde av en normal Sprague-Dawley rotte retinal fundus av spaltelampe fundusfotografering. De retinalkar dukke opp fra den optiske platen til å forsyne de indre lag av netthinnen. Platen har en klar grense og en rødlig rundt hue (koroidal flush). De retinalkar er tynne og jevnt fordelt. Synsnerven disk margin er vanligvis godt avgrenset før rNAION induksjon. B. Bilde av en normal fundus av en face SD-oktober bildebehandling. Individuelle snittbilder av netthinnen vist i panel C genereres fra i den grønne boksen. Scan retning er vist med en grønn pil. C. Enkelt SD-oktober tverrsnitt skanning av normal netthinnen og optisk plate som viser netthinnens lag. Den retinal nerve fiber lag (RNFL, liten hvit pil) har en gråaktig utseende, men er lettere enn den underliggende ytre kjernefysiske lag (onl, liten hvit pil). Den RNFL er flatt mot synsnerven. Den optiske nerven skygge er smal (angi d av to piler). ON: synsnerven. RNFL: gangliecelle / nerve fiber lag. Onl: Ytre atom lag. Skala:. 200 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. rNAION Induksjon Utseende. A. 532 nm / 500 nm flekk laser belysning av synsnerven platen og netthinnen uten systemisk RB injeksjon. Synsnerven platen og netthinnen er mørke. B. 532 nm laser belysning 30 sek etter systemisk RB injeksjon. PÅ viser en gyllen glød i løpet av de skipene som kommer ut disken på laser spot området, noe som indikerer systemisk RB i blodet opplyst av grønt laserlys.g "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Netthinne og Optic Nerve Analyse 2 dager etter rNAION induksjon. A. Color fundus bildet viser ON hevelse og optisk plate blekhet, med tap av den omkringliggende koroidal flush. Venene er vanligvis forstørret og buet, noen ganger med eske (avbrutt flyt) årer. B. En face SD-oktober bilde post-induksjon viser plate ødem og venøs dilatasjon. Individuell tverrsnitt er generert fra innenfor den grønne boksen. Scan retning er vist med en grønn pil. C. Tverrsnitt viser ON disk ødem, som gjenspeiles av økt tykkelse av RNFL og redusert grå intensitet (mer hvitt, i samsvar med høyere vanninnhold). Diameteren av den intra-retinal ON (indikert mellom blACK piler) er økt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens det er en rekke modeller av synsnerveskader (synsnerven knuse 12, synsnerven tran 13, og PION 14), er rNAION modell human, tilpasningsdyktig til både rotter og mus. Det ligner nærmere den menneskelige kliniske tilstand NAION. Denne tilstanden inkluderer progressive fremre synsnerven ødem, en fremre synsnerven kompartmentsyndrom, focal aksonal iskemi, isolert gangliecelle aksonal skade og tap over en lengre tid selvfølgelig. Denne rapporten gir de nødvendige skritt for rNAION induksjon, diskuterer mulige problemer under induksjon, og beskrev tidlig post induksjon analyser som kan brukes til å vurdere kvaliteten av den induserte lesjon før data inkludering. Fordelen med den rNAION modellen er at med praksis, kan relativt konsekvent nivåer av skade oppnås. Typisk 10 - 11 sek eksponering resulterer i 40 - 65% RGC tap. Suksessraten kan variere fra individ til individ, deventende på erfaring og dyktighet, men en erfaren etterforsker kan oppnå nesten en induksjon sats 100%.
I tillegg til sin enkle induksjon, kan alvorlighetsgraden og tidsforløpet av lesjonen lett kan overvåkes. Et viktig første del av kvalitetskontrollen i rNAION modell, som kan legge til modellen fordeler, er tidlig post induksjon analyse. Vi normalt evaluere dyrenes to dager etter induksjon, når den optiske nerven ødem er maksimal. Den rNAION er karakterisert ved synsnerven ødem som løser over en fem dagers periode (ca. 5 ganger raskere enn den som forekommer hos mennesker), etterfulgt av synsnerven blekhet og isolert gangliecelle tap. Man kan identifisere retinal ischemi (til forskjell fra synsnerven iskemi) ved tap av retinal åpenhet og bleking av netthinnen. Retinal ischemi er funksjonelt bekreftet av tap av indre retinal signal med elektroretinografi (ERG). Hvis det er utbredt tap av retinal åpenhet og hvittning av netthinnen, tyder det diffuse retinal ischemi, som er konsistent med sentrale retinal vene okklusjon, og ikke rNAION alene. Dersom induksjons resulterer i alvorlige retinal ischemi i et antall dyr (karakterisert ved snitt eller total retinal hvithet), kan induksjons parametrene bli redusert med ett eller to sekunder eksponeringstid. På denne måten kan man optimalisere både graden av synsnerveskader, og få konsistensen av induksjon i dyr. Dyr med betydelig tap av ERG signalet skal bli eliminert fra studiet. Isolert tap av synsnerven funksjon kan bekreftes ved flash visuell fremkalt potensial måling (VEP).
Det finnes en rekke variabler som skal holdes i bakhodet når du bruker rNAION modell. Individuelle dyr kan variere i den samlede alvorlighetsgrad av lesjonen, slik at flere dyr som trenger å bli brukt i de nevrobeskyttende analyser, og en strøm analyse skal utføres for å bestemme minimum antall dyr som nødvendig for å oppnå en statistically gyldige resultater, spesielt når en mer beskjeden beskyttende effekt er sett eller spådd. Vi har funnet at 10 - 15 dyr er nødvendig for å bestemme en 25% RGC beskyttende effekt i rotter, og 15 - 20 dyr når mus brukes. Siden RB fargestoff som brukes i induksjons elimineres raskt, når dyret er injisert, variasjon kan også være avhengig av hastigheten av den tid som kreves for å utføre induksjons. Små forskjeller på fokus på papillen, forskjeller i vinkelen av laser belysning, og en forskjell i hastigheten på induksjon kan også påvirke utfallet. Ett bestemt individ bør velges for å utføre teknikken i hvert laboratorium, for ytterligere å redusere variabilitet. Omtrent 10-15% av induserte dyr kan trenge å bli eliminert etter post-induksjon evaluering tidlig på grunn av alvorlighetsgraden av induksjon (sentral eller gren retinal vene okklusjon). Denne rapporten drøfter ikke utallige andre iboende variabler som kan påvirke utfallet, for eksempel fra kjønnsforskjeller,døgnrytme, og alder eller belastning forskjeller. Disse spørsmålene må være oppfylt av den enkelte etterforsker. Det er andre endret parameterinnstillingene nylig rapportert, for eksempel 80 mW laser makt 15. Disse endringene brukt ulike linser eller laser bølgelengde, men resulterte i lignende utfall.
Det er viktig å innse at til tross for likhetene i rNAION til mange aspekter av klinisk NAION, er rNAION en modell, og ingen modell er en perfekt kopi av en human sykdom, ettersom selve årsaksfaktorer i NAION er ukjente, og de vaskulære og inflammatoriske fysiologiske kontroll av gnagere netthinnen og synsnerven er forskjellige på mange måter fra menneskelig og ikke-menneskelig primat. Funn generert av modellen må tolkes i lys av disse forskjellene. Uavhengig av dette, er det rNAION modellen en verdifull metode for raskt dissekere mange av de potensielle patofysiologiske mekanismene som er ansvarlig for synstap og tilnærmingertil nevrobeskyttelse i en levende pattedyrsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker de mange studenter og stipendiater som har jobbet på denne modellen til å forbedre sin effektivitet, og å forstå dens mekanismer. Spesiell takk skyldes Dr. Mary Johnson (University of Maryland-Baltimore), Nitza Goldenberg-Cohen (Schneiderman Childrens Hospital, Petah-Tikva, Israel), Charles Zhang (Einstein Medical College, Bronx, NY), og Valerie Touitou (Hopital Salpetrie, Paris, Frankrike). Denne studien ble finansiert delvis av RO1 EY015304 til SLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mW 532 nm laser | Iridex | Standard Ophthalmic Laser | |
| 0 - 100 mW 532 nm laser | Laserglow technologies | Substitute for iridex | |
| Laser slit lamp adapter | Iridex | SMA coupled adapter for laser output | |
| Coherent Fieldmate laser meter with thermopile sensor | Coherent | others also appropriate | |
| Ophthalmic Examing Slit lamp biomicroscope | Various | Haag-Streit is the best; cheaper versions available on ebay | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Photoinducing agent |
| Fundus Contact lens or glass cover slip | custom/Cantor and Nissel (UK) | Custom designed planoconvex plastic lens for eye exam and induction | |
| Tropicamide 1% | |||
| Tamiya polishing compound | Tamiya, INC | 87068 | polishing contact lens |
| 2.5% Hypromellose (Goniovisc)/1% Methycellulose | HUB Pharmaceuticals | contact lens coupling agent | |
| 2.5% Neosynephrine Ophthalmic drops | Alcon labs | pupil dilating agent | |
| Tropicamide 1% | Alcon labs | pupil dilating agent | |
| 0.5% Proparacaine | Alcon labs | topical Anesthetic | |
| 30 G fused needle insulin syringe | Various | Various | for intravenous injection of rose bengal |
| Ophthamic Antibiotic ointment with dexamethasone added (Triple antibiotic ointment) | Various | Various | Apply after induciton to minimize corneal scarring |
| Heidelberg Corporation Spectral domain-Optical Coherence Tomograph | Heidelberg Corporation | For Optical coherence measurements baseline and post-induction; not essential for induction |
References
- Banik, R. Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy: An Update on Demographics, Clinical Presentation, Pathophysiology, Animal Models, Prognosis, and Treatment. J. Clin. Experimental Ophthalmol. 10, 1-5 (2013).
- IONDT study group. Characteristics of patients with nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy eligible for the Ischemic Optic Neuropathy Decompression Trial. Arch Ophthalmol. 114, 1366-1374 (1996).
- Tesser, R. A., Niendorf, E. R., Levin, L. A. The morphology of an infarct in nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Ophthalmology. 110, 2031-2035 (2003).
- Bernstein, S. L., Johnson, M. A., Miller, N. R. Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) and its experimental models. Prog Retin Eye Res. 30, 167-187 (2011).
- Nicholson, J. D., et al. PGJ2 Provides Prolonged CNS Stroke Protection by Reducing White Matter Edema. PLoS One. 7 (12), (2012).
- Goldenberg-Cohen, N., et al. Oligodendrocyte Dysfunction Following Induction of Experimental Anterior Optic Nerve Ischemia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 2716-2725 (2005).
- Bernstein, S. L., Guo, Y., Kelman, S. E., Flower, R. W., Johnson, M. A. Functional and cellular responses in a novel rodent model of anterior ischemic optic neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 4153-4162 (2003).
- Berger, A., et al. Spectral-Domain Optical Coherence Tomography of the Rodent Eye: Highlighting Layers of the Outer Retina Using Signal Averaging and Comparison with Histology. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Huang, T. L., et al. Protective effects of systemic treatment with methylprednisolone in a rodent model of non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION). Exp Eye Res. 131, 69-76 (2015).
- Mantopoulos, D., et al. An Experimental Model of Optic Nerve Head Injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, 6222 (2014).
- You, Y., et al. Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination. J. Vis. Exp. (101), e52934 (2015).
- Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol Vis. 18, 2147-2152 (2012).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System. J Vis Exp. (51), e2241 (2011).
- Wang, Y., et al. A Novel Rodent Model of Posterior Ischemic Optic Neuropathy. JAMA Ophthalmol. 131 (2), 194-204 (2013).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Chang, S. W., Lin, K. H., Tsai, R. K. Efficacy of Intravitreal Injections of Antivascular Endothelial Growth Factor Agents in a Rat Model of Anterior Ischemic Optic Neuropathy. IOVS. 56, 2290-2296 (2015).
