Introduction
Anterior no arterítica neuropatía óptica isquémica (NOINA) es una lesión isquémica focal de la porción anterior del nervio óptico (NO) 1. NOIA-NA es la causa más común de pérdida repentina de la visión relacionada nervio óptico en individuos de más de 50 años 2. El mecanismo se cree que es un síndrome compartimental que da lugar a un edema intraneural, y provoca la compresión de los capilares que irrigan los axones en el nervio óptico 3.
Dado que el EN es en realidad un tracto del sistema nervioso central (CNS), el NOINA roedor modelo (rNAION) se puede utilizar para estudiar los mecanismos y las respuestas a aislados del SNC trazos materia blanca. Por consiguiente, el modelo rNAION puede ser útil en la disección de muchos de los problemas asociados con el daño relacionado con accidente cerebrovascular a la sustancia blanca. Se puede usar para evaluar distintas estrategias y agentes neuroprotectores en el accidente cerebrovascular materia blanca.
Una de las características más atractivas del modelo es que esun procedimiento indoloro, no invasivo. La potencia del láser se puede ajustar para producir diversos grados de daño isquémico. Otra característica es que se basa en inducida por láser radicales superóxido dañar el endotelio capilar, produciendo una disfunción capilar progresiva. Es esta disfunción progresiva y edema que se cree que es muy similar al mecanismo que causa NOINA. La investigación ha demostrado que no causa la coagulación capilar directa, pero funciona a través de al menos dos mecanismos: la muerte inducida superóxido y de extracción de algunas de las células endoteliales capilares 4, y NFkB (factor nuclear de cadena kappa-light-potenciador de células B activadas ) asociado regulación inflamatoria en el endotelio restante, con el aumento de transporte de fluido a través de las membranas celulares en el intersticio 5. El cierre de los capilares del nervio óptico y de compresión causadas por resultado la acumulación de líquido intersticial en óptica isquemia cabeza del nervio. Una imagen esquemática se muestra en laLa Figura 2. El modelo rNAION se puede utilizar en ambas especies 6,7 rata y ratón, y se puede variar en el nivel de su gravedad, de una lesión leve a una destrucción completa, pero sin dolor del nervio óptico y la retina, tales como la oclusión de la arteria central de la retina (OACR).
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Protocol
Este protocolo fue aprobado por la Universidad de Maryland Institucional Cuidado de Animales y el Utilización (IACUC; Baltimore, MD, EE.UU.)
1. Estructura del ensayo
- Hacer una lente de contacto personalizado diseñado a partir de un claro grado óptico circulares 7 mm de diámetro, de plexiglás de 3 mm de espesor. Cortar las lentes circulares con un taladro de columna. Utilice una broca estándar para hacer la curva interna, y finalmente pulir las curvas exteriores e interiores utilizando un pulidor de lentes de contacto de grano ultrafino (1000/3000).
- Preparar 2,5 mM Rosa de Bengala (RB) de pH 7,4 buffer fosfato salino (PBS) con antelación, esterilizar por filtración con un filtro de jeringa de 0,45 micras y almacenar en alícuotas de 1 ml -20 ° C en un recipiente hermético a la luz durante un máximo de 6 meses.
NOTA: El uso de animales machos outbred albinos, tales como Sprague Dawley minimiza las diferencias de respuesta dependientes de la tensión, permite una mayor facilidad de inducción y reduce la variabilidad que puede ocurrir con cycli estrohembra ng. - Configurar la frecuencia del doble de neodimio-itrio-aluminio-granate (FD-YAG) médica oftalmológica, que genera una luz láser de 532 nm. Montar el láser en una lámpara de hendidura Haag-Streit oftálmica utilizando un adaptador de láser oftálmico estándar. Este dispositivo disponible comercialmente permite la visualización simultánea de la aplicación de puntos de ojo y el láser del animal. El láser médico también tiene un haz de encuadre de enfoque apropiado y centrado usando el mismo tamaño de punto como la inducción láser. los parámetros de potencia del láser son los siguientes:
- Para la inducción rNAION rata: utilizar 500 micras punto de tamaño / 50 mW de potencia de láser / 1.000 mseg de duración / 1.000 intervalo de milisegundos.
- Para la inducción rNAION ratón: cambiar el tamaño de punto de 300 micras de disco óptico más pequeño y dejar otros parámetros el mismo que el ajuste de la rata.
- utilizan habitualmente un medidor de potencia de láser para asegurar la potencia de salida del láser.
2. Procedimiento experimental
- Encienda la potencia del lásery establecer el parámetro de láser apropiado. Calentar el láser durante al menos cinco minutos antes de su uso.
- Pesar el animal para determinar la dosis apropiada para la ketamina / xilazina y colorante RB. Anestesiar al animal mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de 1 ml / kg de 80 mg / ml de ketamina y 4 mg / ml de xilazina.
- Dejar al animal en una jaula calienta hasta que esté completamente anestesiado. Compruebe si no hay respuesta a los estímulos aversivos (o cola de arrastre del dedo del pie). Compruebe animales para la profundidad de la anestesia cada 10 min.
- Dilatar los alumnos del animal con tropicamida al 1% y anestesiar la superficie del ojo con un 0,5% proparacaına. Si el uso de animales pigmentados, tales como Long Evans, un 2,5% gotas oculares neosinefrina aumentarán dilatación de la pupila.
- Use las tijeras para cortar los bigotes cerca de la boca del cañón en el lado para ser inducidas para evitar el bloqueo de la vista.
- Ponga una gota de metilcelulosa al 1% u otra gota oftálmica de acoplamiento en el interior de la lente de contacto a medida, y luego aplicar la lente en tque los ojos de rata.
- Colocar el animal sobre una plataforma ajustado a la altura de la lámpara de hendidura. Ajuste la cabeza del animal en un ángulo de 45 °, de modo que el ojo es perpendicular a la lámpara de hendidura y el rayo láser.
- Visualizar el ojo a través de la lámpara de hendidura oftálmica. Asegúrese de que la orientación de los faros es el tamaño adecuado, así como centrado y centrado directamente en el nervio óptico visualizado. Fotografiar el fondo de la retina utilizando una cámara digital con una alta ASA (1,200 - 2,000) Velocidad montado en una de las piezas de ojo de la lámpara de hendidura con un adaptador hecho a medida.
NOTA: La capacidad de ver los vasos coroideos revela la transparencia de la retina. Esta es una señal importante con el fin de ser capaz de detectar la isquemia de retina, que puede confundir la interpretación si se produce. rNAION es la isquemia del nervio óptico, lo que resulta en la pérdida de RGC aislado, mientras que los resultados de isquemia de la retina en daño en la retina que afecta a todas las células de las capas de la retina interna. - Opcionalmente, aún más la imagen de la retina ynervio óptico utilizando un dominio de coherencia óptica espectral tomógrafo (SD-OCT 8) para evaluar el ojo no-inducida. Escanear en face (Figura 3B), así como 7 exploraciones de sección transversal a través de la retina (Figura 3C). La OCT-SD de imagen utiliza la misma lente de contacto utilizado para la inducción láser.
- Se inyecta 1 ml / kg por vía intravenosa a través de RB vena de la cola, y esperar durante 30 segundos, a continuación, activar la potencia del láser. Este retardo de tiempo permite que el RB para distribuir uniformemente a través de la circulación. Utilizamos un pulso láser de 50 mW a uno seg / pulso. Energías mayores (≥ 60 mW) pueden dañar la retina o causar isquemia vascular de la retina.
Precaución: Asegúrese de que todo el mundo tiene un par de gafas de filtrado de seguridad del láser de la longitud de onda apropiada para evitar el bloqueo de la luz láser que entren por los ojos del investigador.
NOTA: La administración láser se debe dar rápidamente después de la inyección IV RB ya que el colorante se elimina rápidamente de la circulación. Cuanto más larga sea la inducción láser, el más grave es la isquemia del nervio óptico. En general, los animales se les da 7 - 12 pulsos por segundo en una sucesión rápida. El contacto de la luz láser con el colorante circula da los vasos del nervio óptico un hermoso brillo dorado que se puede ver a través de la lámpara de hendidura (Figura 4B). Esto demuestra que el colorante se inyectó por vía sistémica y se distribuye en la corriente sanguínea. Si la luz es débil, o ninguna en absoluto (Figura 4A), el colorante no se inyectó por vía intravenosa. En este caso, no se dé una segunda inyección inmediatamente, ya que el animal tendrá que recuperar durante al menos dos días antes de la reinyección. - Inmediatamente después de la inducción, retirar la lente de contacto. Cubra ambos ojos con antibiótico oftálmico triple (Neosporin / polimixina / bacitracina) ungüento con dexametasona, y colocar al animal en un cojín de calentamiento de 37 ° C en una sola jaula alojado en observación hasta la recuperación completa.
- Limpiar la lente de contacto con agua destilada water y secar con un paño de limpieza no abrasivo para su uso futuro.
- Dos días después de la inducción evaluar el edema del nervio óptico por tanto la fotografía del fondo de color y SD-OCT análisis 8.
NOTA: comparar el grado de edema del nervio óptico da una estimación de la gravedad de la isquemia del nervio óptico. A los dos días, el margen de disco del nervio óptico es borrosa, y las venas de la retina están ligeramente dilatado, en comparación con el ojo contralateral (no inducida). Realizar el electrorretinograma (ERG) y flash potenciales evocados visuales (VEP 11) a los dos y cuatro semanas después de la inducción para el análisis electrofisiológico.
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Representative Results
La visualización de lentes de contacto permitido central de la retina (Figura 1). El punto focal con láser ilumina el disco óptico en la parte posterior de la retina (Figura 2). La retina normal un-inducido se muestra fotografiada por lámpara de hendidura bio-microscopio (Figura 3A) y por SD-OCT (Figura 3B y 3C). Durante la inducción láser, cuando no hay colorante está presente en la circulación, la luz láser no da como resultado en el recipiente y la fluorescencia de disco (Figura 4A). RB intravenosa y la iluminación de luz láser sobre los resultados de discos ópticos en una fluorescencia de color dorado en el nervio óptico (Figura 4B). Dos días después de la inducción rNAION, el nervio óptico está hinchado (Figura 5). En la cara y transversal SD-OCT revelan disco hinchazón (Figura 5B) y la expansión del nervio óptico (Figura 5C).
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Figura 1. Esquema de la rata planocóncava lente de contacto. La lente de contacto por encargo está hecho de plexiglás 3 mm (diseño se muestra), con diámetro exterior de 7 mm, diámetro interior de 5 mm. Este objetivo está diseñado para encajar en la córnea del ojo de la rata, y permitir la visualización directa de la retina. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 2. Esquemática de rNAION Model. Sección transversal longitudinal a través de la parte posterior del ojo. El punto láser se centra en el disco óptico (flechas verdes). La célula verde y axón representa la neurona de células ganglionares de la retina. Inmediatamente después de admi RB intravenosaadmi-, la RB circula a través de la vasculatura en la parte posterior del ojo y el nervio óptico. El rayo láser se utiliza para iluminar el disco de 7-12 seg dependiendo de la gravedad isquémica deseado. El láser se activa el RB fotosensibilizante para generar radicales superóxido, lo que provoca el cierre capilar en la parte anterior en la cabeza (isquemia axonal; visto en el lado izquierdo del nervio como la pérdida de pequeñas líneas rojas) sin afectar los vasos intrarretinianos más grandes que salen de la cabeza EN en el ojo. La isquemia focal produce la disfunción axonal localizado (individual línea verde). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Línea de base normal de la retina (RET) y del Nervio Óptico (EN) Análisis usando fotografía en color y SD-OCT. A. Cuadro de una rata Sprague-Dawley fondo de la retina normal mediante lámpara de hendidura fotografía del fondo. Los vasos de la retina emergen del disco óptico para suministrar las capas interiores de la retina. El disco tiene una frontera clara y un color rojizo que rodea tonalidad (al ras de la coroides). Los vasos de la retina son finas y uniformemente distribuida. El margen de disco del nervio óptico es generalmente bien demarcada antes de la inducción rNAION. B. Imagen de un fondo de ojo normal en face-SD imágenes de OCT. imágenes individuales de la sección transversal de la retina se muestra en el panel C se generan desde el interior de la caja verde. Dirección de exploración se muestra con una flecha verde. Escaneo sección transversal SD-OCT C. individual de la retina normal y papila óptica que muestra las capas de la retina. La capa de fibras nerviosas de la retina (CFNR, pequeña flecha blanca) tiene un aspecto grisáceo, pero es más ligero que la capa subyacente exterior nuclear (ONL, pequeña flecha blanca). La CFN es plana contra el nervio óptico. La sombra del nervio óptico es estrecho (indicar d por dos flechas). ON: nervio óptico. CFNR: ganglionares de la retina capa de fibra de células / nervio. ONL: capa nuclear externa. Barra de escala:. 200 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Inducción rNAION Apariencia. A. 532 nm / 500 micras punto de iluminación láser del disco del nervio óptico y la retina sin inyección sistémica RB. El disco del nervio óptico y la retina son oscuras. B. 532 nm iluminación láser 30 segundos después de la inyección sistémica RB. El SOBRE muestra un brillo dorado dentro de los vasos que salen del disco en el lugar del punto láser, lo que indica RB sistémica en el torrente sanguíneo iluminada por la luz láser verde.g "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. retina y el nervio óptico Análisis 2 días después de la inducción rNAION. A. color de la imagen del fondo de ojo muestra EN hinchazón y la palidez del disco óptico, con la pérdida de la descarga coroidea circundante. Las venas se agrandan y generalmente curvada, a veces con venas en caja (flujo interrumpido). B. cara en SD-OCT imagen después de la inducción muestra edema de disco y la dilatación venosa. sección transversal individual se genera desde el interior de la caja verde. dirección de exploración se muestra con una flecha verde. Sección C. Cruz muestra sobre el edema de disco, como se evidencia por el aumento de espesor de la CFNR y reducción de la intensidad de color gris (más blanco, coherente con mayor contenido de agua). El diámetro de la EN intra-retinal (indicado entre el blflechas ACK) se incrementa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Mientras que hay un número de modelos de lesión del nervio óptico (óptica aplastamiento del nervio 12, óptica transección del nervio 13, y PION 14), el modelo rNAION es humano, adaptable a ratas y ratones. Se asemeja más a la condición clínica humana de NOINA. Esta condición incluye anterior progresiva edema del nervio óptico, un síndrome compartimental del nervio óptico anterior, isquemia focal axonal, aislado daño axonal de la retina de células ganglionares y la pérdida durante un transcurso de tiempo prolongado. El presente informe da los pasos apropiados para la inducción rNAION, discute los problemas potenciales durante la inducción, y analiza descrito la inducción temprana puesto que se puede utilizar para evaluar la calidad de la lesión inducida antes de la inclusión de datos. La ventaja del modelo rNAION es que con la práctica, se pueden alcanzar niveles relativamente consistentes de daños. Normalmente 10 - 11 seg resultados de exposición en un 40 - 65% de pérdida de RGC. La tasa de éxito puede variar de individuo a individuo, dependientes en la experiencia y habilidad, pero un investigador experimentado puede alcanzar casi una tasa de inducción 100%.
Además de su facilidad de inducción, el curso de gravedad y momento de la lesión se puede controlar fácilmente. Una primera parte importante del control de calidad en el modelo rNAION, que puede agregar al modelo ventajas, es el análisis después de la inducción temprana. Normalmente se evalúan los animales dos días después de la inducción, cuando el edema del nervio óptico es máxima. El rNAION se caracteriza por edema del nervio óptico que resuelve en un período de cinco días (aproximadamente 5 veces más rápido que el que se produce en los seres humanos), seguido de palidez del nervio óptico y aislado pérdida de células ganglionares de la retina. Se puede identificar la isquemia de la retina (a diferencia de la isquemia del nervio óptico) por la pérdida de transparencia de la retina y blanqueamiento de la retina. isquemia retiniana se confirma funcionalmente por la pérdida de la señal de la retina interna con el electrorretinograma (ERG). Si hay una pérdida generalizada de la transparencia de la retina y blancoNing de la retina, que sugiere isquemia retiniana difusa, que es coherente con oclusión de la vena central de la retina, y no rNAION solo. Si los resultados de inducción en la isquemia retinal severa en un número de animales (caracterizado por blanqueamiento sección o total de la retina), los parámetros de inducción se pueden reducir por uno o dos segundos el tiempo de exposición. De esta manera se puede optimizar tanto el grado de daño del nervio óptico, y obtener la consistencia de la inducción en animales. Los animales con pérdida significativa de la señal de ERG deben ser eliminados del estudio. Pérdida aislada de la función del nervio óptico se puede confirmar mediante la medición de flash de potencial evocado visual (VEP).
Hay una serie de variables que deben tenerse en cuenta cuando se utiliza el modelo de rNAION. Los animales individuales pueden diferir en la gravedad global de la lesión, de manera que varios animales necesitan ser usada en los ensayos neuroprotectores, y un análisis de potencia se debe realizar para determinar el número mínimo de animales que se necesitan para lograr una staresultados estadísticamente válidos, en particular cuando un efecto protector más modesto es visto o predicho. Se ha encontrado que 10 - se requieren 15 animales para determinar un efecto protector RGC 25% en ratas, y 15 - 20 animales cuando se utilizan ratones. Puesto que el tinte RB utilizada en la inducción se elimina rápidamente, una vez que se inyecta el animal, la variabilidad puede también ser dependiente de la velocidad del tiempo necesario para realizar la inducción. Las pequeñas diferencias en el enfoque en el disco óptico, las diferencias en el ángulo de iluminación láser, y una diferencia en la velocidad de la inducción también pueden afectar el resultado. Una persona especializada debe ser seleccionado para realizar la técnica en cada laboratorio, para reducir aún más la variabilidad. Aproximadamente el 10 - puede necesitar ser eliminado después de la evaluación temprana después de la inducción debido a la gravedad de la inducción (oclusión céntrica o rama venosa retiniana) 15% de los animales inducidos. Este informe no habla de otras variables intrínsecas innumerables que pueden influir en el resultado, por ejemplo de las diferencias de sexo,ritmo circadiano, y las diferencias de edad o deformación. Estas preguntas deben ser satisfechas por el investigador individual. Hay otros ajustes de los parámetros modificados recientemente reportados, tales como la potencia del láser de 80 mW 15. Estas modificaciones han usado diferentes de lentes de contacto o longitud de onda del láser, pero dio lugar a resultados similares.
Es importante darse cuenta de que a pesar de las similitudes de rNAION a muchos aspectos de la NOINA clínica, rNAION es un modelo, y ningún modelo es un duplicado perfecto de una enfermedad humana, ya que los factores causales reales en NOINA son desconocidos, y el vascular e inflamatoria control fisiológico de la retina y el nervio óptico roedores son diferentes en muchos aspectos de los primates humanos y no humanos. Hallazgos generados por el modelo deben ser interpretados a la luz de estas diferencias. Independientemente de esto, el modelo rNAION es un método valioso para diseccionar rápidamente muchos de los posibles mecanismos fisiopatológicos responsables de la pérdida visual y enfoquespara la neuroprotección en un sistema de mamífero vivo.
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Disclosures
Los autores tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los muchos estudiantes y compañeros que han trabajado en este modelo para mejorar su eficacia, y para comprender sus mecanismos. Un agradecimiento especial al Dr de. Mary Johnson (Universidad de Maryland-Baltimore), Nitza Goldenberg-Cohen (Hospital Schneiderman niños, Petah-Tikva, Israel), Charles Zhang (Einstein Medical College, Bronx, Nueva York), y Valerie Touitou (Hopital Salpetrie, París, Francia). Este estudio fue financiado en parte por SR1 EY015304 al SLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mW 532 nm laser | Iridex | Standard Ophthalmic Laser | |
| 0 - 100 mW 532 nm laser | Laserglow technologies | Substitute for iridex | |
| Laser slit lamp adapter | Iridex | SMA coupled adapter for laser output | |
| Coherent Fieldmate laser meter with thermopile sensor | Coherent | others also appropriate | |
| Ophthalmic Examing Slit lamp biomicroscope | Various | Haag-Streit is the best; cheaper versions available on ebay | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Photoinducing agent |
| Fundus Contact lens or glass cover slip | custom/Cantor and Nissel (UK) | Custom designed planoconvex plastic lens for eye exam and induction | |
| Tropicamide 1% | |||
| Tamiya polishing compound | Tamiya, INC | 87068 | polishing contact lens |
| 2.5% Hypromellose (Goniovisc)/1% Methycellulose | HUB Pharmaceuticals | contact lens coupling agent | |
| 2.5% Neosynephrine Ophthalmic drops | Alcon labs | pupil dilating agent | |
| Tropicamide 1% | Alcon labs | pupil dilating agent | |
| 0.5% Proparacaine | Alcon labs | topical Anesthetic | |
| 30 G fused needle insulin syringe | Various | Various | for intravenous injection of rose bengal |
| Ophthamic Antibiotic ointment with dexamethasone added (Triple antibiotic ointment) | Various | Various | Apply after induciton to minimize corneal scarring |
| Heidelberg Corporation Spectral domain-Optical Coherence Tomograph | Heidelberg Corporation | For Optical coherence measurements baseline and post-induction; not essential for induction |
References
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