Introduction
Nonarteritic neuropatia ottica ischemica anteriore (NAION) è una lesione ischemica focale della porzione anteriore del nervo ottico (ON) 1. NAION è la causa più comune di improvvisa fibre nervose perdita della vista ottico in soggetti di età superiore a 50 2. Il meccanismo è ritenuta essere una sindrome vano che provoca edema intraneurale, e provoca la compressione dei capillari forniscono gli assoni nel nervo ottico 3.
Dal momento che l'ON è in realtà un tratto del sistema nervoso centrale (CNS), la NAION roditore modello (rNAION) può essere utilizzato per studiare i meccanismi e le risposte di isolati colpi della sostanza bianca del sistema nervoso centrale. Il modello rNAION può quindi essere utile in sezionare molti problemi connessi con danni relativi corsa di materia bianca. Può essere usato per valutare diverse strategie neuroprotettive e agenti in bianco ictus materia.
Una delle caratteristiche più interessanti del modello è che èun indolore, procedura non invasiva. La potenza del laser può essere regolata per produrre vari gradi di danno ischemico. Un'altra caratteristica è che si basa su laser indotta radicali superossido danneggiare l'endotelio capillare, producendo una disfunzione capillare progressiva. È questa disfunzione e progressiva edema che si ritiene essere notevolmente simile al meccanismo che causa NAION. La ricerca ha dimostrato che non provoca la coagulazione capillare diretta, ma agisce attraverso almeno due meccanismi: superossido morte indotta e stripping di alcuni capillare cellule endoteliali 4, e NFkB (fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer di cellule B attivate ) associato regolazione infiammatorio in endotelio restante, con un aumento del trasporto di liquidi attraverso le membrane cellulari nell'interstizio 5. La chiusura dei capillari del nervo ottico e compressione causate da interstiziale risultato accumulo di liquido in ottica ischemia testa del nervo. Un quadro schematico è mostrato inFigura 2. Il modello rNAION può essere utilizzato in entrambe le specie di ratti e topi 6,7, e può essere variata nel livello della sua gravità, da una lesione lieve a una distruzione completa, ma indolore del nervo ottico e la retina, tale come occlusione dell'arteria centrale della retina (CRAO).
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Protocol
Questo protocollo è stato approvato dalla University of Maryland Istituzionale Cura animali e del Comitato di utilizzo (IACUC, Baltimore, MD, USA)
1. set-up sperimentale
- Fare una lente a contatto personalizzato progettato da un grado ottico chiaro circolare 7 mm di diametro plexiglass, di 3 mm di spessore. Tagliare le lenti circolari con un trapano a colonna. Utilizzare una punta da trapano standard per rendere la curva interna, e, infine, lucidare le curve esterne ed interne usando una lucidatrice di lenti a contatto di grana ultrafine (1000/3000).
- Preparare 2,5 mM Rosa Bengala (RB) in pH 7,4 tampone fosfato salino (PBS) in anticipo, filtro sterilizzare con un filtro a siringa da 0,45 micron e conservare 1 ml aliquote a -20 ° C in un contenitore a tenuta di luce fino a 6 mesi.
NOTA: L'uso di animali maschi outbred albini, come Sprague Dawley riduce al minimo lo sforzo differenze di risposta dipendono, consente una maggiore facilità di induzione e riduce la variabilità che può verificarsi con estro cycling femminile. - Impostare la frequenza raddoppiata Neodimio-ittrio granato di alluminio (Fd-YAG) laser medico oftalmico, che genera una luce laser 532 nm. Montare il laser su una lampada a fessura oftalmica Haag-Streit utilizzando un adattatore laser oftalmico standard. Questo dispositivo disponibile in commercio consente la visualizzazione simultanea di applicazione punto dell'occhio e laser dell'animale. Il laser medico ha anche un fascio di puntamento per una corretta messa a fuoco e centratura utilizzando lo stesso formato di punto come l'induzione laser. parametri di potenza laser sono i seguenti:
- Per ratto induzione rNAION: utilizzare 500 micron punto dimensioni / 50 mW di potenza del laser / 1.000 durata msec / 1.000 ms intervallo.
- Per il mouse induzione rNAION: cambiare la dimensione del punto a 300 micron per disco ottico più piccolo e lasciare gli altri parametri lo stesso come impostazione di ratto.
- Ordinariamente utilizzare un misuratore di potenza laser per assicurare la potenza del laser.
2. Procedura sperimentale
- Accendere la potenza del lasere impostare il parametro del laser appropriata. Riscaldare il laser per almeno cinque minuti prima dell'uso.
- Pesare l'animale per determinare la dose appropriata per ketamina / xylazina e tintura RB. Anestetizzare l'animale mediante iniezione intraperitoneale di 1 ml / kg della miscela di 80 mg / ml di ketamina e 4 mg / ml xilazina.
- Lasciare l'animale in una gabbia riscaldata fino a completo anestetizzato. Verificare la presenza di alcuna risposta a stimoli avversi (coda o pizzicare la punta). Controllare animali per profondità dell'anestesia ogni 10 min.
- Dilata allievi dell'animale con 1% tropicamide e anestetizzare la superficie dell'occhio con 0,5% proparacaina. Se si utilizzano gli animali pigmentate, come Long Evans, a 2,5% gocce oculari neosynephrine aumenterà la dilatazione della pupilla.
- Usare le forbici per tagliare i baffi vicino al muso sul lato per essere indotti a evitare di bloccare la vista.
- Mettere una goccia di 1% di metilcellulosa o di altra goccia accoppiamento oftalmica all'interno della lente a contatto su misura, e quindi applicare l'obiettivo sulla tha gli occhi di ratto.
- Posto l'animale su una piattaforma regolato all'altezza della lampada a fessura. Impostare testa dell'animale con un angolo di 45 ° in modo che l'occhio è perpendicolare alla lampada a fessura e laser.
- Visualizza l'occhio attraverso la lampada a fessura oftalmica. Assicurarsi che il fascio di puntamento è la dimensione giusta, così come messo a fuoco e centrato direttamente sul nervo ottico visualizzato. Fotografare il fondo della retina con una fotocamera digitale con alta ASA (1.200 - 2.000) di velocità montato su uno dei pezzi occhio della lampada a fessura con un adattatore su misura.
NOTA: La capacità di vedere i vasi coroideali rivela la trasparenza della retina. Questo è un segnale importante per essere in grado di rilevare successivamente ischemia retinica, che possono confondere l'interpretazione se si verifica. rNAION è ottico ischemia del nervo, che si traduce in perdita isolato RGC, mentre i risultati ischemia retinica in danni alla retina che colpisce tutte le cellule degli strati retinici interni. - Facoltativamente, ulteriormente immagine retina enervo ottico utilizzando una spettrale dominio a coerenza ottica tomografo (SD-8 ottobre) per valutare l'occhio non-indotta. Scansione en face (Figura 3B) e 7 scansioni trasversali attraverso la retina (Figura 3C). L'SD-OCT di imaging utilizza la stessa lente a contatto utilizzato per l'induzione laser.
- Iniettare 1 ml / kg per via endovenosa attraverso RB vena della coda, e attendere 30 secondi, quindi attivare la potenza del laser. Questa temporizzazione consente RB di distribuire uniformemente nella circolazione. Usiamo un impulso laser di 50 mW a una sec / impulso. energie maggiori (≥ 60 MW) possono danneggiare la retina o causare ischemia vascolare retinica.
Attenzione: Assicurarsi che ognuno di noi ha un paio di occhiali filtranti sicurezza laser della lunghezza d'onda di blocco appropriata per evitare che la luce laser diffusa entra l'occhio del ricercatore.
NOTA: La somministrazione laser deve essere rapidamente dopo l'iniezione IV RB poiché il colorante viene eliminato rapidamente dalla circolazione. Più a lungo l'induzione laser, il più grave l'ottica ischemia del nervo. Generalmente, gli animali sono date 7 - 12 impulsi sec in rapida successione. Il contatto della luce laser con il colorante circola dà vasi nervo ottico bella bagliore dorato che può essere visto attraverso la lampada a fessura (Figura 4B). Questo dimostra il colorante è stato iniettato per via sistemica e distribuita nel flusso sanguigno. Se la luce è debole, o del tutto assenti (Figura 4A), il colorante non è stato iniettato per via endovenosa. In questo caso, non danno una seconda iniezione immediatamente, poiché l'animale dovrà recuperare per almeno due giorni prima reiniezione. - Subito dopo induzione, rimuovere le lenti a contatto. Coprire entrambi gli occhi con antibiotico oftalmico tripla (Neosporin / polimixina / bacitracina) pomata con desametasone, e mettere l'animale in un riscaldamento pad 37 ° C in una sola gabbia alloggiata sotto stretta osservazione fino al pieno recupero.
- Pulire la lente a contatto con acqua distillata wAter e asciugare con un panno non abrasivo per un utilizzo futuro.
- Due giorni dopo l'induzione valutare l'edema nervo ottico sia da fotografia a colori del fondo oculare e SD OCT-analisi 8.
NOTA: Confrontando il grado di edema nervo ottico fornisce una stima della gravità della ischemia nervo ottico. In due giorni, il margine del disco nervo ottico è offuscata, e le vene della retina sono leggermente dilatati, rispetto con l'occhio (non-indotta) controlaterale. Eseguire elettroretinografia (ERG) e flash visivo potenziali evocati (VEP 11) a due e quattro settimane inviare ad induzione per l'analisi elettrofisiologia.
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Representative Results
La visualizzazione lente a contatto abilitato centrale retina (Figura 1). Il punto laser focale illumina il disco ottico sul retro della retina (Figura 2). Il normale retina non-indotta è mostrato ripreso dalla lampada a fessura bio-microscopio (figura 3A) e SD-OCT (Figura 3B e 3C). Durante l'induzione laser, quando nessun colorante è presente nella circolazione, luce laser non comporta recipiente e fluorescenza disco (Figura 4A). RB per via endovenosa e l'illuminazione luce laser sui risultati disco ottico in fluorescenza colore dorato sul nervo ottico (Figura 4B). Due giorni dopo l'induzione rNAION, il nervo ottico è gonfio (Figura 5A). En viso e trasversale SD-OCT rivelano disco gonfiore (Figura 5B) e l'espansione del nervo ottico (Figura 5C).
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Figura 1. Schema del Topo Planoconcave lenti a contatto. La lente a contatto su misura è realizzata in plexiglas 3 mm (disegno mostrato), con diametro esterno di 7 millimetri, diametro interno di 5 mm. Questo obiettivo è stato progettato per adattarsi sopra la cornea dell'occhio ratto, e consentire la visualizzazione diretta della retina. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Schema di rNAION Modello. Sezione longitudinale attraverso la parte posteriore dell'occhio. Il punto laser è centrata sul disco ottico (frecce verdi). La cella verde e assone rappresenta il neurone cellule gangliari della retina. Subito dopo endovenosa admi RBnistrazione, l'RB circola attraverso il sistema vascolare nella parte posteriore dell'occhio e del nervo ottico. Il raggio laser è utilizzato per illuminare il disco per il 7 - 12 sec a seconda della gravità ischemico desiderato. Il laser attiva il RB fotosensibilizzanti di generare radicali superossido, che provoca la chiusura capillare anteriore ON testa (ischemia assonale, visto dal lato sinistro del nervo come perdita di piccole linee rosse) risparmiando vasi intraretinica grandi emergenti dalla testa ON nell'occhio. L'ischemia focale produce disfunzione assonale localizzato (monofamiliare linea verde). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Baseline Normale Retina (RET) e del nervo ottico (ON) Analisi utilizzando la fotografia a colori e SD-ottobre A. Immagine di un normale Sprague-Dawley ratto fondo della retina con lampada a fessura fundus fotografia. I vasi retinici emergono dal disco ottico per alimentare gli strati interni della retina. Il disco ha un bordo chiaro e un rossastro circostante tonalità (a filo della coroide). I vasi retinici sono sottili e uniformemente distribuita. Il margine del disco nervo ottico è generalmente ben delimitata prima rNAION induzione. B. Immagine di un fundus normale en face SD-OCT imaging. Le singole immagini della sezione trasversale della retina come da tabella C sono generati dall'interno della scatola verde. Direzione di scansione è indicato con una freccia verde. Scan sezione C. singola SD-OCT croce della retina normale e disco ottico che mostra gli strati della retina. Lo strato delle fibre nervose retiniche (RNFL, piccola freccia bianca) ha un aspetto grigio, ma è più leggero strato sottostante esterno nucleari (ONL, piccola freccia bianca). Il RNFL è piatto contro il nervo ottico. L'ombra nervo ottico è stretta (indicare d da due frecce). ON: nervo ottico. RNFL: strato di fibra di cellule / nervose retiniche gangliari. ONL: strato nucleare esterno. Barra di scala:. 200 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. rNAION induzione Aspetto. A. 532 nm / 500 micron posto illuminazione laser del disco nervo ottico e della retina senza iniezione RB sistemica. Il disco nervo ottico e della retina sono scuri. B. 532 nm illuminazione laser 30 secondi dopo l'iniezione sistemica RB. La ON mostra un bagliore dorato all'interno dei vasi emergenti dal disco nel sito spot laser, indicando RB sistemico nel flusso sanguigno illuminata dalla luce laser verde.g "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. retina e del nervo ottico Analisi 2 giorni dopo rNAION induzione. A. colori dell'immagine del fondo oculare mostra ON gonfiore e pallore del disco ottico, con la perdita del filo che circonda coroide. Le vene sono di solito ingrandite e curvo, a volte con scatola vene (flusso interrotto). B. En face SD-OCT immagine post-induzione mostra edema del disco e la dilatazione venosa. sezione individuale viene generato all'interno della scatola verde. direzione di scansione è indicato con una freccia verde. Sezione C. trasversale mostra ON edema del disco, come evidenziato da un aumento dello spessore del RNFL e ridotta intensità grigio (più bianco, coerente con il contenuto di acqua superiore). Il diametro del intra-retinica ON (indicato tra i blfrecce ACK) è aumentata. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Mentre ci sono un certo numero di modelli di danno del nervo ottico (nervo ottico crush 12, ottico resezione del nervo 13, e PION 14), il modello rNAION è umano, adattabile a entrambi i ratti e topi. Assomiglia più da vicino le condizioni cliniche umana di NAION. Questa condizione include progressiva anteriore del nervo ottico edema, una sindrome ottico scompartimento del nervo anteriore, focale ischemia assonale, isolato retina cellule gangliari danno assonale e la perdita di più di un corso di tempo prolungato. La presente relazione fornisce i passi appropriati per rNAION induzione, discute i potenziali problemi durante l'induzione, e analizza descritto induzione precoce post che può essere utilizzato per valutare la qualità della lesione indotta prima dell'inserimento dei dati. Il vantaggio del modello rNAION è che con la pratica, livelli relativamente consistenti di danni possono essere raggiunti. Tipicamente 10 - 11 risultati di esposizione sec a 40 - perdita di RGC 65%. Il tasso di successo può variare da individuo a individuo, dein attesa sull'esperienza e abilità, ma un investigatore esperto può raggiungere quasi un tasso di induzione al 100%.
Oltre alla sua facilità di induzione, il corso gravità e tempo della lesione può essere facilmente controllata. Una parte importante iniziale del controllo di qualità nel modello rNAION, che può aggiungere modellare vantaggi, è l'analisi di induzione posta presto. Di solito valutiamo gli animali due giorni dopo l'induzione, quando l'edema nervo ottico è massima. Il rNAION è caratterizzata da edema nervo ottico che risolve un periodo di cinque al giorno (circa 5 volte superiore a quella che si verifica negli esseri umani), seguita da ottico pallore del nervo e perdita di cellule gangliari retiniche isolato. Si può identificare ischemia retinica (da non confondersi con ottica ischemia del nervo) dalla perdita di trasparenza e sbiancamento della retina retina. ischemia retinica è funzionalmente confermata da perdita di segnale della retina interna con elettroretinografia (ERG). Se c'è una diffusa perdita di trasparenza della retina e neroning della retina, suggerisce diffusa ischemia retinica, che è coerente con il centro di occlusione venosa retinica, e non rNAION solo. Se i risultati di induzione in grave ischemia retinica in un numero di animali (caratterizzata da sbiancamento della retina sezione o totale), i parametri di induzione possono essere ridotti con uno o due secondi il tempo di esposizione. In questo modo si può ottimizzare sia il grado di danno del nervo ottico, e ottenere la consistenza dell'induzione negli animali. Gli animali con significativa perdita di segnale ERG dovrebbero essere eliminati dallo studio. Isolata perdita di funzione del nervo ottico può essere confermata da Flash misura del potenziale evocato visivo (VEP).
Ci sono una serie di variabili da tenere a mente quando si utilizza il modello di rNAION. I singoli animali possono differire nella gravità complessiva della lesione, in modo che più animali devono essere utilizzati in saggi neuroprotettivi e un'analisi di potenza devono essere eseguite per determinare il numero minimo di animali necessari per ottenere un stastatisticamente risultati validi, in particolare quando un effetto protettivo più modesto è visto o previsto. Abbiamo trovato che 10 - 15 animali sono necessari per determinare un effetto protettivo 25% RGC nei ratti e 15 - 20 animali quando si utilizzano topi. Poiché il colorante RB utilizzato nell'induzione viene rapidamente eliminato, una volta che l'animale viene iniettato, variabilità può anche dipendere dalla velocità del tempo necessario per eseguire l'induzione. Lievi differenze sulla messa a fuoco sul disco ottico, differenze di angolo di illuminazione del laser, e la differenza nella velocità di induzione può anche influire sul risultato. Un individuo dedicato deve essere selezionata per eseguire la tecnica in ogni laboratorio, per ridurre ulteriormente la variabilità. Circa il 10 - 15% degli animali indotti può avere bisogno di essere eliminati dopo la valutazione precoce post-induzione a causa della gravità di induzione (occlusione venosa centrale o filiale della retina). Questa relazione non tratta una miriade di altre variabili intrinseche che possono influenzare il risultato, ad esempio da differenze di sesso,ritmo circadiano, e le differenze di età o di deformazione. Queste domande devono essere soddisfatti dal singolo ricercatore. Ci sono altre impostazioni dei parametri modificati recentemente riportato, come ad esempio 80 mW potenza del laser 15. Queste modifiche utilizzate diverse lenti a contatto o lunghezza d'onda del laser, ma portato a risultati simili.
E 'importante rendersi conto che, nonostante le somiglianze di rNAION a molti aspetti della NAION clinica, rNAION è un modello, e nessun modello è un duplicato perfetto di una malattia umana, dal momento che i fattori causali reali in NAION sono sconosciuti, e il vascolare e infiammatorio controllo fisiologico della retina e del nervo ottico roditore sono diversi per molti aspetti dalla primati umani e non umani. I risultati generati dal modello devono essere interpretate alla luce di queste differenze. Indipendentemente da ciò, il modello rNAION è un metodo prezioso rapidamente sezionare molti dei potenziali meccanismi fisiopatologici responsabili perdita visiva e approccialla neuroprotezione in un sistema di mammifero vivente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i molti studenti e borsisti che hanno lavorato su questo modello per migliorarne l'efficacia, e per capire i suoi meccanismi. Un ringraziamento particolare va al dott del. Mary Johnson (University of Maryland-Baltimore), Nitza Goldenberg-Cohen (Schneiderman Childrens Hospital, Petah-Tikva, Israel), Charles Zhang (Einstein Medical College, Bronx, NY), e Valerie Touitou (Hopital Salpetrie, Parigi, Francia). Questo studio è stato finanziato in parte da RO1 EY015304 per SLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mW 532 nm laser | Iridex | Standard Ophthalmic Laser | |
| 0 - 100 mW 532 nm laser | Laserglow technologies | Substitute for iridex | |
| Laser slit lamp adapter | Iridex | SMA coupled adapter for laser output | |
| Coherent Fieldmate laser meter with thermopile sensor | Coherent | others also appropriate | |
| Ophthalmic Examing Slit lamp biomicroscope | Various | Haag-Streit is the best; cheaper versions available on ebay | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Photoinducing agent |
| Fundus Contact lens or glass cover slip | custom/Cantor and Nissel (UK) | Custom designed planoconvex plastic lens for eye exam and induction | |
| Tropicamide 1% | |||
| Tamiya polishing compound | Tamiya, INC | 87068 | polishing contact lens |
| 2.5% Hypromellose (Goniovisc)/1% Methycellulose | HUB Pharmaceuticals | contact lens coupling agent | |
| 2.5% Neosynephrine Ophthalmic drops | Alcon labs | pupil dilating agent | |
| Tropicamide 1% | Alcon labs | pupil dilating agent | |
| 0.5% Proparacaine | Alcon labs | topical Anesthetic | |
| 30 G fused needle insulin syringe | Various | Various | for intravenous injection of rose bengal |
| Ophthamic Antibiotic ointment with dexamethasone added (Triple antibiotic ointment) | Various | Various | Apply after induciton to minimize corneal scarring |
| Heidelberg Corporation Spectral domain-Optical Coherence Tomograph | Heidelberg Corporation | For Optical coherence measurements baseline and post-induction; not essential for induction |
References
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