Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח Published: September 30, 2016 doi: 10.3791/54522
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 3, 1,2, 1,2,4
1Institute for Microbiology, Heinrich-Heine University Düsseldorf, 2Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Department of Genetics, Institute of Applied Biosciences, Karlsruhe Institute of Technology, 4Cluster of Excellence in Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine University Düsseldorf
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים אסטרטגית החלפת גנים חזקה כדי גנטי לתפעל פטריית תועבת Ustilago maydis. פרוטוקול זה מסביר כיצד ליצור מוטציות מחיקות לחקור פנוטיפים זיהום. זה יכול להתארך עד לשנות את הגנים בכל דרך רצויה, למשל, על ידי הוספת רצף קידוד תג חלבון פלואורסצנטי.

Abstract

מחיקת ג'ין ממלאת תפקיד חשוב בניתוח של תפקוד גן. אחת השיטות היעילות ביותר לשבש גנים באופן ממוקד הוא החלפת הגן כולו עם סמן לבחירה באמצעות רקומבינציה הומולוגי. במהלך הומולוגי, חילופי DNA מתרחשים בין רצפים עם דמיון גבוה. לכן, רצפי הגנום ליניארי איגוף גן מטרה ניתן להשתמש כדי לכוון סמן לבחירה במיוחד לאתר אינטגרציה הרצוי. קצוות בלאנט של לבנות את המחיקה להפעיל את מערכות תיקון דנ"א של התא ובכך לקדם אינטגרציה של המבנה או דרך רקומבינציה הומולוגי או שאינו הומולוגיים סוף-שהצטרף. באורגניזמים עם הומולוגיים יעילים, שיעור מחיקת גן מוצלח יכול להגיע ליותר מ -50% ביצוע אסטרטגיה זו מערכת שיבוש הגנטי יקרה. פטריית התועבה Ustilago maydis היא מיקרואורגניזם מודל אוקריוטים מראה recombinat הומולוגי יעיל כזהיוֹן. מתוך שלה על 6,900 גנים, רבים מתאפיינים תפקודי בעזרת מוטציות מחיקות, וחזר על כישלון נקודות ניסיונות החלפת גן על תפקוד חיוני של הגן. האפיון הבא של תפקוד הגן על ידי תיוג עם סמני ניאון או מוטציות של תחומים ניבאו גם מסתמך על חילופי דנ"א באמצעות רקומבינציה הומולוגי. כאן, אנו מציגים את U. דור אסטרטגית זן maydis בפירוט באמצעות הדוגמא הפשוטה ביותר, את מחיקת הגן.

Introduction

Ustilago maydis היא פטרייה מודל phytopathogenic כי נחקרה בהרחבה במשך עשרות שנים 1,2. היא קיימת בשני מורפולוגיות, שלב שמרים דמוי, שאינם פתוגניים וטופס filamentous, זיהומיות 3. תגליות פריצת דרך יוניברסל כגון מנגנוני רקומבינציה ותיקון DNA הומולוגיים נעשו בשלב הגדילה דמוי השמרים של פטריית 4 זו. יתר על כן, בורר מורפולוגיים לגורמי הנימה ארסי זיהומיות החשובים לזיהום הם היטב מאופיינים 5,6. הידע המולקולרי הגדיל אודות ביולוגיה ארסית של פטריית התועבה הזה מסתמך על אסטרטגיית התחדשות גן פשוט 7-9 הנתמך על ידי ביאור הגנום מעולה 10 ואת הקלות של גנטיקה הפוכה באמצעות, למשל, באוסף פלסמיד המאורגן היטב במכון שלנו (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). סטנדרטיים, מבחני זיהום מהירים של תירסeedlings לאפשר מחקרים מפורטים של פתוגניות גורמי 11.

הגנום של U. maydis מכיל כ 6,900 גנים 10. כדי ללמוד את תפקידם, הם יכולים להימחק בנפרד או בשילוב בשל מערכת הומולוגית יעילה. אזורי איגוף של כ 1 kb המכילים קצוות הומולוגיים מושלם הם אידיאליים עבור שיעורים הומולוגיים יותר מ -50%, אבל כבר 250 נ"ב עם קצוות שאינם הומולוגיים לאפשר מידה מסוימת של אינטגרציה הנכונה של המבנה 9. נכון לעכשיו, חמש קלטות התנגדות שונות, hygR, cbxR, natR, G418R, ו phleoR בתיווך התנגדות נגד hygromycin, carboxin, nourseothricin, G418 ו- phleomycin, מועסק כדי לבחור עבור transformants 7,9. בנוסף, התנגדות hygromycin כבר התפתחה קלטת למחזור (FRT-hygR) כי ניתן להסיר על ידי הביטוי החולף של recombinase FLP Heterologous 12. זה מאפשר סר של הקלטת התנגדות ובכך ב שינויים גנטיים בלתי מוגבלים תאוריה. Phleomycin הוא מוטגנים 13, כך שעם הקלטות החדשות, בפרט את קלטת hygR למחזור, שימוש phleoR הולך ופוחת. מוטציות Quadruple ולכן יכולות להיוצר באמצעות הקלטות הארבעה אחרים, אבל עבור מוטציות מחומשות, מערכת FRT-hygR מומלצת 14.

אסטרטגיה מחיקת גן כללית זו הועברה בהצלחת פטריות תועבה אחרות כגון Sporisorium reilianum 15, ע ' 16 hordei, או U. אסכאלאנטה 17 ולכן מציע את הפוטנציאל עבור יישומים נוספים באורגניזמים עדיין גנטי סוררים עם מערכת הומולוגית יעילה. יתר על כן, אורגניזמים חסרי הומולוגיים יכול להיות שונה כדי לשפר את ההנדסה הגנטית כפי שהודגם על ידי מחיקה של גנים המעורבים שאינם הומולוגיים-אןד-מצטרף Neurospora crassa 18,19.

כאן אנו מתארים את האסטרטגיה המחיקה גן שפורסם U. maydis 7,9 בפירוט הניסיון עם דגש על האימות המהירה ומדויקת של המועמדים. כדוגמא, אנו משתמשים chitinases פטרייתי מתארים את הדור של מוטציות יחידות, כמו גם מחיקת מספר זני 20,21. Chitinases הם דוגמאות מעניינות, כי הם פועלים על כיטין בקיר התא הנוקשה. שיפוץ דופן התא נדרש עבור שינויים מורפולוגיים במהלך חלוקת התא, לעבור לצמיחה פילמנטיות, ולאחר יצירת הנבגים. לפיכך, מוטנטים מחיקה פנוטיפים לאורך כל מחזור החיים ניתן לצפות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דור 1. בין שני מושגים מחיקים

  1. צור פלסמיד המכיל את המבנה המחיק (איור 1) המהווים אגף זרם בהתאמת 1 kb (UF) לבין אגף במורד זרם (DF) כל ואת קלטת ההתנגדות המתאימה מוקפת אתרי הגבלת חיתוך בוטים.
    הערה: כל אסטרטגיה שיבוט יכול לשמש (שיבוט ראה התייחסות 22) אנו ממליצים שיבוט שער הזהב עבור כאלה 9 פלסמידים.
  2. והבלו המחיק לבנות מן הפלסמיד בעזרת סכין קהה להשיג DNA 1 מיקרוגרם של המחיקה לבנות 9. לטהר את המבנה המחיק לחסל אנזים חיץ 22 למשל באמצעות ריאגנטים מסחריים ופעל לפי הוראות היצרן.
    הערה: עמוד השדרה וקטור יכול להישאר תערובת טרנספורמציה.

2. הכנת פרוטופלאסט

הערה: שמור בתנאים סטריליים במהלך כל הזמנים של הדוארxperiment. דופן התא היא מחסום הגנה חזק שמגביל גישה של מולקולות קרום הפלזמה. כדי לאפשר ספיגת של DNA המכיל את מבנה המחיקה, דופן התא צריך להיות מוסר על ידי דופן התא משפיל אנזימים בריאקציה protoplasting. צעדים קריטיים הכין פרוטופלאסט הם 1) ייצוב האוסמוטי של המדיום ו -2) הימנעות לחץ מכאני על פרוטופלאסט.

  1. מארק 2 צינורות מ"ל עם תחתית עגולה להקפיא את פרוטופלאסט להתקרר אותם ב -20 ° C. התחל-תרבות טרום ב 3 מיליליטר YEPS-אור מצלחת טריה של המתח עם הרקע הגנטי הרצוי. לדגור על גלגל מסתובב במשך 24 שעות ב 28 מעלות צלזיוס.
    הערה: הזן יכול להיות SG200 זן solopathogenic 10, זני wildtype, זנים בוחנים כגון AB33 23, או כל רקע מוטציה עבור דור של מוטציות כפולות. ודא המתח הוא ללא ההתנגדות הרצויה.
  2. לדלל את התרבות ב 50 מיליליטר YEPS-אור בתוך flas מבולבלk דגירה על שייקר מסלולית ב 28 ° C עם 200 סל"ד.
    הערה: זמן ההכפלה הוא כ 2 שעות עבור זני wildtype. אפשר מינימום שלוש כפילויות.
  3. לגדול עד שלב מעריכים. ודא כי הצפיפות האופטית, נמדדה באורך גל של 600 ננומטר (OD 600), הוא בסביבות 0.8 (0.6 כדי 1.0 הוא מקובל). OD של 600 1.0 מתאים על 1 עד 2 x 10 7 U. maydis תאים לכל מיליליטר.
  4. בדוק את התאים עבור זיהום תחת מיקרוסקופ. השתמש בהגדלה 40X. גלולה התאים של תרבות 50 מ"ל המלא ל 5 דקות, 1,500 XG וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 25 מ"ל נתרן ציטרט, פתרון סורביטול (SCS), דקות צנטריפוגות 5, 1500 XG, וזורקים supernatant.
    הערה: זיהומים חיידקיים יכולים להיות מזוהים כתאים קטנים ולעיתים קרובות נע. ניתן לזהות המבוססת זיהומים פטרייתיים על צורה או גודל תא שונה לעומת התאים בצורת הסיגר של U. maydis.
  5. במהלך CENtrifugation להכין פתרון protoplasting (12.5 מ"ג / מ"ל Trichoderma lysing אנזימים, ב SCS; להכין 3 מ"ל לכל תא גלולה; מסנן לעקר דרך פילטר 22 מיקרומטר; פתרון צריך להיות טרי לפעילות האנזימטית אופטימלי). SCS הוא מייצב האוסמוטי למנוע קרע של פרוטופלאסט עם הסרת דופן התא.
  6. Resuspend גלולה ב 2 מ"ל protoplasting פתרון. דגירה במשך 5 עד 20 דקות ב RT ולבדוק מתחת למיקרוסקופ עד 30 עד 40% של התאים הם עגולים או כמו ראשי סיכה (איור 2).
    הערה: בצע את כל השלבים על הקרח מעכשיו ולטפל פרוטופלאסט בזהירות!
  7. 3x לשטוף 10 מ"ל קר (4 ° C) SCS, צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות.
  8. Resuspend גלולה ב 10 מ"ל סורביטול קר, TrisHCl, פתרון 2 CaCl (STC), ספין XG ב 1000 למשך 5 דקות, להשליך supernatant. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל קר STC, לעשות 100 aliquots μl של צינורות מקורר. להקפיא את aliquots ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.

טרנספורמציה 3. U. maydis

הערה: השינוי של U. פרוטופלאסט maydis מסתמך על פוליאתילן גליקול (PEG) שיטה טרנספורמציה בתיווך, שהיא פשוטה מבחינה טכנית בניגוד electroporation או טרנספורמציה biolistic אינה דורשת ציוד מיוחד.

  1. הכן את הצלחות דו-שכבתי בחירה (2 צלחות לכל תגובת טרנספורמציה). השכבה התחתונה מכילה אנטיביוטיקה בריכוז הוכפל. Pipet 12 מ"ל של RegLight המכיל 400 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin (או 300 מיקרוגרם / מ"ל ​​nourseothricin או 4 מיקרוגרם / מ"ל ​​carboxin או 1 מ"ג / מ"ל ​​G418) לתוך צלחת פטרי. הימנע בועות.
    הערה: צלחות השכבה התחתונה ניתן לאחסן כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס, אבל להכין את השכבה העליונה טרי במהלך השינוי (ראו להלן).
  2. פרוטופלאסט להפשיר על הקרח (1 שפופרת / טרנספורמציה). הוסף 1 הפרין μl (15 מ"ג / מ"ל). הוסף 1 מיקרוגרם DNA (מבנה לינארית) או 10 μl H 2
  3. במהלך תקופה זו, על השכבה העליונה להתפשט 12 מ"ל מעובה RegLight (לרתיחה ומצננים עד 60 ° C) לצלחת התחתונה RegLight.
    הערה: שכבה זו אינה מכילה אנטיביוטיקה.
  4. הוסף 500 μl STC / PEG (פוליאתילן גליקול) אל הצינור השינוי (3. 2) ומערבבים בזהירות על ידי צינור היפוך. דגירה 15 דקות על הקרח.
  5. פזר כל תגובה טרנספורמציה על שתיים מן הצלחות RegLight דו-שכבתית. מורחים בזהירות ובאיטיות עם pipet זכוכית. דגירה צלחות זקוף על 28 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 7 ימים עד transformants לגדול כקולוניות. השג על 100-200 מושבות בכל צלחת.
    הערה: מספרים נמוכים יותר עלולים להיגרם על ידי "רעה" פרוטופלאסט שכוללת יותר מדי קיר תא ולכן לא יכול לקחת עד DNA או לא יכול להתחדש. לשעבר יכול להיבדק על ידי טרנספורמציה עם פלסמיד המשכפלת את עצמה, זה האחרון על ידי בדיקת התחדשות על צלחות ללא אנטיביוטיקה.
    6. <li> כן YEPS-אור צלחות המכילות האנטיביוטיקה המתאימה ב 200 מיקרוגרם / מיליליטר hygromycin (או 150 מיקרוגרם / מיליליטר nourseothricin או 2 מיקרוגרם / מיליליטר carboxin או 500 מיקרוגרם / מיליליטר G418; ריכוזים אלה חצי שווים של אחד המשמש צלחות תחתונות). Re-לטהר 24 מושבות transformant משוערות לפחות על צלחות אלה. יש לקבל מושבות בודדות. באותו פס פסק זמן הזן המקורי על תקשורת הלא סלקטיבי.
    הערה: ניתן לאחסן צלחות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות.

4. אימות של אירועים מחיקים נכון

הערה: המוטציות אומת בהליך בן שלושה שלבים (איור 1). ראשית, מועמדים המכילים את עותק wildtype של גן מודרים על ידי PCR. שנית, השילוב של הקלטת ההתנגדות לתוך המוקד מאומת על ידי PCR. שלישית, האינטגרציה של הקלטת ההתנגדות רק אל המוקד הרצוי מאומתת על ידי ניתוח כתם דרום. אימות זן זהירות היא essential, כך פנוטיפים מוטנטים לתאם באמת בתהליך המחיקה.

  1. האבחון הראשון PCR 20
    1. זיווג פריימרים עיצוב בגן למחיקה כי תוצאת תוצר של 250-600 נקודות בסיס (איור 1). מוצרים קטנים כאלה קלים להגביר במושבה PCR, וארוך מספיק לגילוי ב ג'ל אלקטרופורזה סטנדרטית.
    2. עבור כל מועמד ואת המתח המקורי כביקורת חיובית, resuspend קצת (סכום של ראש סיכה) של חומר התא של מושבה אחת עם קיסם 20 μl 0.02 M NaOH. לדגור על RT במשך 30 דקות.
      הערה: השתמש מושבות טריות. אם הצלחות הן מבוגרת 1 שבוע מחדש פס להשיג מושבה טריה.
    3. השתמש 1 μl של ההשעיה תא עבור PCR מיד. הפעל תגובת PCR תקן ולנתח שברים וכתוצאה מכך.
      הערה: דגימות אלה לא ניתן לאחסן.
      הערה: בדיקות PCR זה עבור נוכחות של גן wildtype ובכך מאפשרת זיהוי מהיר של CAND השליליתidates שבו הגן של עניין לא הוחלף. משובטים מניבים להקות תגובת PCR זה ייפסל. צריך כגון שיבוט שלילי אחת בכל מקרה להתבצע לאורך כפקד שלילי נוסף. מועמדים ללא מוצר PCR צריכים להיות מנותחים נוסף. עבור גנים ללא השפעות מזיקות כמחצית המועמדים תכיל את גן wildtype, ואילו החצי השני לא אמור לגרום להקה. זה יתאים לשיעור הומולוגי של 50%.
  2. PCR לאבחון שנית
    1. הכנה של הדנ"א הגנומי.
      הערה: הדנ"א הגנומי (gDNA) ניתן להכין באמצעות שני פרוטוקולים שונים. הראשונה כוללת ריאגנטים רעילים כמו פנול כלורופורם ומכאן, צריכים להיות מטופלים רק על ידי חוקרים מנוסים (המתואר 4.2.1.1 כדי 4.2.1.5) ואילו השני יכול גם להיות מטופלים על ידי תלמידים מנוסים פחות (המתואר 4.2.1.6 ל -4.2. 1.11). שני הפרוטוקולים פועלים באופן מהימן. שלב 4.2.1.1 זהה עבור שניהם protocOLS.
      1. לחסן 5 מ"ל YEPS-אור עם כל מועמד לדגור על גלגל מסתובב במשך 24 שעות ב 28 מעלות צלזיוס. ירידה של 2 μl של התרבות על צלחת CM. שמרו על תרבות סטרילי.
        הערה: להלן פרוטוקול סטנדרטי (זהירות: צעדים רעילים).
      2. שים 1 סקופ (~ 200 μl) של חרוזי זכוכית HCl שטוף 2 מ"ל צינורות. הוסף 2 מ"ל של U. תרבות maydis. ספין XG 12,000 במשך 5 דקות. בטל supernatant (גלולה אפשר להקפיא בשלב זה). הוסף 500 μl פנול / כלורופורם / Isoamylalcohol (25: 24: 1) על הגלולה. זְהִירוּת! פנול רעיל!
      3. הוסף 500 μl אוסטי-תמס-חיץ 1. Shake עבור 6 עד 10 דקות על vibrax ב 1000 סל"ד. ודא כי גלולת התא resuspended לחלוטין, אך להימנע מורחב רועדים למנוע מריחה של gDNA. ספין ב XG 12,000 במשך 15 דקות. העבר 400 μl של השלב המימי לתוך צינור התגובה החדש (לא לגעת ביניים).
      4. הוסף 1 מ"ל 100% (V / V) אתנול. הפוך את 3x צינור לערבב, להתבונן גרם של DNA כי זמן קצר מופיע. ספין ב XG 12,000 במשך 5 דקות. הסר supernatant ולשטוף עם 200 μl 70% EtOH. אל resuspend גלולה ב בשלב זה.
      5. הסר supernatant לחלוטין (לא נותנים גלולה להתייבש לחלוטין). הוסף 50 μl TE / RNase. ממיסים gDNA ידי רועד ב 400 סל"ד ב 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לנתח 2 μl של gDNA על ג'ל 0.8% agarose 20.
        הערה: השלבים הבאים מהווים פרוטוקול חלופי רעיל.
    2. הכנה חלופית של הדנ"א הגנומי
      1. שים 1 סקופ (~ 200 μl) של HCl שטף חרוזי זכוכית 2 צינורות מ"ל. הוסף 2 מ"ל של U. תרבות הספין maydis XG ב 12,000 במשך 5 דקות. בטל supernatant (כדורים אפשר להקפיא בשלב זה).
      2. הוסף 500 μl אוסטי תמוגה חיץ 2 על הגלולה. לנער במשך 5 עד 15 דקות על vibrax ב 1000 סל"ד. ודא כי גלולת התא resuspended לחלוטין.
      3. דגירת הצינורות ב C 65 מעלות במשך 15 עד 20 דקות. שימוש approחממות priate שנועדו לארח 2 צינורות מיליליטר היא קריטיות. לאחר מכן, למקם אותו על קרח למשך 5 דקות.
      4. הוספת 100 μl 8 M אשלגן אצטט, מערבולת או להפוך 8 עד 10 פעמים. ספין XG 12,000 במשך 15 דקות ב RT.
      5. העברת 500 μl של supernatant לצינור 1.5 מ"ל טריים ולהוסיף 400 isopropanol μl. וורטקס או הפוך 8 עד 10 פעמים. ספין XG 12,000 במשך 15 דקות. הסר supernatant ולשטוף עם 500 μl 70% EtOH. ספין XG 12,000 במשך 5 דקות.
      6. משרים את supernatant לחלוטין! בסופו של דבר, להוסיף סיבוב קצר (10 שניות) כדי להסיר את הנוזל שיורית. תן יבש גלולת DNA במשך 3 עד 5 דקות. הוסף 50 μl TE / RNAase לדגור על 50 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות ב 400 סל"ד.
    3. PCR
      1. עיצוב שני זוגות פריימר עם אחד מהם מחייב מחוץ חביות ואת המקביל אחד מחייב בתוך קלטת התנגדות (UF-f, RC-r; RC-F, DF-r, איור 1) 9.
      2. השתמש 1 μl של דילול 1:10 של gDNA של כל גandidate כתבנית ב 2 תגובות PCR אימות ההכנסה הנכונה במעלה או במורד 9.
      3. השתמש PCR תגובות סטנדרטיות לכל מועמד ולנתח וכתוצאה שברת 22.
        הערה: אלה PCRs לבדוק את ההחדרה של קלטת התנגדות מוקד גנומית הנכון. אם מוצרים מתקבלים לשני הצדדים, המועמד הוא הכנסה נכונה סביר. עם זאת, גם מועמדים שבו רק צד אחד (במעלה או במורד הזרם) ניתן היה לאשר צריך להתבצע לאורך לניתוח נוסף במקרה זה תגובות PCR נכשל פשוט לאגפו אחד.
  3. אימות של הכנסת הגנום נכון על ידי דרום כתם ניתוח 22
    1. תקציר 15 μl של gDNA (4.2.1) של המועמדים מוטציה ואת המתח wildtype / ובתאים להתכתב עם אנזים מתאים שחותך מחוץ לוקוס / לבנות ובנוסף, חותך או בגן או קלטת התנגדות המוביל בבירור distדפוסי inguishable (איור 1) 8.
      הערה: אף אחד הלהקות הצפויות צריכה להיות גדול יותר מ -10 קילו, כך שהם להבחין באופן ברור בין ה- DNA המעוכל.
    2. השתמש במעלה או במורד הזרם בכנף כמו בדיקות. לתייג אותם למשל להשתמש ערכת תיוג DIG PCR או כל שיטה תקן דומה. מערבב את הבדיקות שכותרתו יחס של 1: 1 מולקולרי ולבצע את כתם הדרום. שמור לפחות שני transformants הנכון עצמאי.
      הערה: תבנית wildtype ניתן תהיה לקלוט בבירור את המתח המקורי ואת השיבוטים הנכונים צריכים להכיל רק הלהקות הצפויות. להקות נוספות רק נוכח המועמדים מצביעות הוספות אחרות של לבנות בתוך מוקד טועה. אמור להיות מושלך שיבוטים כזה. המועמד השלילי שזוהה PCR האבחון הראשון צריך לכלול את להקות wildtype ואת הלהקות (צפויות בגודל) של המבנה המחיק משולב בצדק.
  4. מניות גליצרול
    הערה: מניות גליצרול לשמש כדי לשמור על השיבוטים במשך שנים באוספי זן. לפחות שני transformants העצמאי צריך להישמר לכל מוטציה. זה מאפשר פנוטיפים השוואה שאמורה להיות זהה.
    1. לגדול 5 מ"ל תרבויות של זנים מוטנטים אישר YEPS-אור על גלגל מסתובב במשך 24 שעות ב 28 מעלות צלזיוס מערבבים 500 μl של כל תרבות עם 500 μl NSY-גליצרול-בינוני. היפוך צינור עד ההתרבות ובינונית הן גם מעורבות. גליצרול במדיום מונע היווצרות של גבישי קרח.
    2. להקפיא ב -80 ° C. Re-פס חלק מהתרבות קפואה לבדוק אם המנייה היא פונקציונלית.

5. פנוטיפים מיקרוסקופים

  1. לגדול 5 מ"ל תרבויות של wildtype זנים מוטנטים YEPS-אור על גלגל מסתובב במשך 12 שעות ב 28 מעלות צלזיוס.
  2. למחרת, לדלל את התרבות כדי OD 600 של כ 0.1 לגדל אותו עד OD 600 בין 0.5 ו -0.7. OD של 600 1.0 corresponds לכ 1 עד 2 x 10 7 U. maydis תאים לכל מיליליטר.
  3. בדוק את מורפולוגיה התא מיקרוסקופי.
    הערה: בריאה תאים להופיע בצורת סיגר (איור 4, WT). vacuoles מבוטא או היווצרות נימה עולה כי התאים הם הדגישו.
    הערה: בהתאם פנוטיפ מוטנטי הצפוי, הניתוח יכול להיות מותאם, למשל, אם זני כתב משמשים את assay המתאים יכול להתבצע בשלב זה. אם מורפולוגיה לתא יתחלף ניתוח סטטיסטי צריך להתנהל, למשל, כדי לקבוע את אורך התא הממוצע.

Assay זיהום 6.

הערה: assay שתיל הזיהום כבר דמיין בעבר ביומן הזה 11. זה יכול גם להתבצע באמצעות רקע מתח הפלואידים, solopathogenic כגון SG200 10 או על ידי ערבוב שותפי הזדווגות תואמים אשר שניהם נושאים את המוטציה.

  1. לגדול לפחות 40 שתילי תירס לכלזן עבור 7 ימים בכל מחזור אור של 16 שעות, 200 μE, 28 ° C / 22 ° C (יום / לילה). הם צריכים להיות בשלב 3-עלה 10-15 ס"מ על יום של זיהום.
  2. יומיים לפני ההדבקה, להתחיל תרבות מראש של זנים ב 5 מ"ל YEPS-אור על גלגל מסתובב במשך 24 שעות ב 28 מעלות צלזיוס. לגדול תרבות עיקרית 50 מיליליטר YEPS-אור עד OD 600 = 1.0 (שיעור חלוקת תא = 2 hr, לאפשר 3 חטיבות מינימום, אפשר לעשות O / N).
  3. ספין למטה התאים של תרבות 50 מ"ל ב 1500 XG במשך 5 דקות וזורקים supernatant. לשטוף 3x עם H 2 O. סטרילי Resuspend התאים סטרילי H 2 O ל OD 600 של 3.0. במידת הצורך, לערבב השותפים ההזדווגות.
  4. להזריק 250 - 500 μl של מתלי התא לתוך הגזע של שתילי תירס בן 7 יום באמצעות מזרק קטן. השתמש סטרילי H 2 O כביקורת. שמור שתילים נגועים עבור 7-14 ימים נוספים בתנאי אור וטמפרטורה אותו. ציון פנוטיפ של כל מפעלccording כדי בריא, ירקון, היווצרות אנתוציאנין, גידולים קטנים, גידולים גדולים, צמחים מתים 10.
    הערה: הניקוד יכול להיעשות מוקדם ככל 7 ימים וחזר ב 14 ימים כדי לעקוב אחרי זיהום לאורך זמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הקונסטרוקציות המחיקות של כל ארבעת הגנים chitinolytic רשומים U. הגנום maydis נוצרו על ידי שיבוט גולדן גייט באמצעות קלטת hygR למחיקה של cts1, את natR למחיקה של cts2, הקלטת G418R למחיקה של cts3 ואת cbxR למחיקה של cts4 20. סקירה כללית של אסטרטגיית התחדשות הגן מודגמת על ידי מחיקת cts3 (איור 1). מוטציות יחידות וכפולות של cts1 עם גן chitinolytic שני נוצרו ברצף עם אותו הבונה בשני רקע גנטי שונה לניתוח של התפקיד chitinases ב ארסיות. שני רקעים שונים זן הועסקו: AB33 מאפשר אינדוקציה של צמיחה פילמנטיות, הצעד הראשון לקראת פתוגניות 23, SG200 הוא זן סולו פתוגניים המאפשר מהירה של המחלה הבקיע 10 cts3 -deletion לבנות לתוך ברקע זן המתאים, מושבות אחת של הצלחת הבחירה השנייה נבדקו למחיקה נכונה ידי PCRs אבחון (טבלה 1) ו כתם הדרום (איור 3). מעניין לציין, כי עבור cts3 השיעור ההומולוגי היה גבוהה הרבה יותר SG200 מאשר AB33, אבל ההבדל הזה לא נצפה באופן עקבי מחיקות של chitinases האחר.

אימות הזן המחמירה מבטיחה הכנסת יחיד של המחיקה לבנות במיקום הרצוי. עם זאת, שינוי נוסף כגון מוטציות נקודתיות יכול להישאר מבלי שיבחין בו, עלול להטעות את הפרשנות של פנוטיפים. לכן, לפחות שני transformants העצמאי phenotyped.

איור 1
תאנה יור 1. סקירה כללית של האסטרטגיה המחיקה שהודגם cts3. סקירה סכמטית זו כוללת את המחיקה לבנות עם האגף במעלה הזרם (UF), האגף במורד הזרם (DF), ואת קלטת התנגדות geneticin (G418R), מוקד הגנומי של wildtype (WT מוטציה) ומחיקה cts3 וכל פריימרים כמו גם אתרי הגבלה בשימוש אימות זן. תוצאות PCR האבחון הראשונות מוצר רק אם עותק גן wildtype קיים, שני PCRs האבחון השני לגרום מוצרים אם קלטת ההתנגדות שולבה כראוי. עבור כתם דרום הדנ"א הגנומי מתעכל עם PstI, חלליות היקף UF ו DF (ברים אדומים) מובילים לגילוי של להקת 6.7 kb ב wildtype ושתי להקות של 5.6 קילו ו 2.0 קילו של המוטציה. בנוסף, חללית DF בחולשה מזהה מוצר 2.6 kb. אנאלחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. אימות מיקרוסקופיות של protoplasting תגובה. (א) תאי wildtype מטופל (FB2) מופיעים בצורת סיגר. (ב) לאחר הטיפול עם דופן תא משפילה אנזימים (כאן למשך 30 דקות), את המראה של תחומים עגולים בקצה אחד (ים) ו בר-פעמון כמו מבנים (ב) עולה כי שפלת דופן התא החלה. לבסוף פרוטופלאסט הם לגמרי עגול (r), אשר בשל העדר דופן התא. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור יור 3. כתם דרום למחיקת cts3. הדנ"א הגנומי היה מתעכל עם PstI. חביות שני תויגו, מעורב ביחסים equimolar ושימש בדיקה אחת. בשנות ה SG200 wildtype ומחיקות של chitinases cts1 ו cts2, להקה אחת של 6.7 kb מזוהה. בשנת מחיקות cts3 (g ו- k), שתי להקות של 5.6 קילו ו 2.0 kb גלויים מעיד על המחיקה הנכונה של cts3. להקה נוספת של 2.6 kb ניתן דמיינה ידי חשיפה מסיבית. זו תואמת שבר כי הוא מוכר על ידי חפיפה של רק 100 נ"ב של חללית אגף במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

חלק מהמוטציות להוביל פגמי צמיחה ברורים כי ניתן לאתר מיקרוסקופי. בשנת מחיקות chitinase, רווק מוטציות לא להציגכל פגם ברור, בעוד cts1 / 2 מוטציות כפולות הראו הפרדת תא בולטת פגם 20. הכתמה של septa הראה כי cytokinesis הושלמה אבל התאים שנשארו קשורים סביר באמצעות כיטין שיורית (איור 4 מ Langner et al. 2015). פנוטיפ צמיחה מיקרוסקופי דומה ידוע את המחיקה של khd4 24, גן מקודד חלבון RNA מחייב מתווך מחזור RNA שלאחר תעתיק של גני המעורבים מורפולוגיה פתוגניות 25.

איור 4
איור 4. ניתוח מיקרוסקופי של מוטציות מחיקות. מורפולוגיה מחצו תא היווצרות של הזנים המחיקים chitinase. Cts1 / 2 Δ זנים להפגין פגם הפרדת תא ליצור אגרגטים גדולים, אשר אינו נובע חוסר היווצרות מחץ. יסודי ותיכוןsepta (ראה גדלת 5x ב ריבועים) הוכתם Calcofluor לבן (CW) לפני במיקרוסקופ. ברי סולם = 10 מיקרומטר. נתון זה נדפס באישור Langner et al. תא איקריוטיים 2015 20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כדי לבחון את התרומה של chitinases כדי ארסיות, מבחני זיהום שתיל בוצעו באמצעות מוטציות ברקע זן SG200. בעוד מוטציות ב khd4 הופחתו ארסיות, מחיקה של chitinases לא השפיעה זיהום של שתילי תירס (איור 5) 20,25.

איור 5
Assay זיהום איור 5. של מוטציות מחיקות. דירוג מחלות שלשתילי תירס 9 ימים לאחר ההדבקה עם U. בהתאמה maydis זנים. (א) סימפטומים מאקרוסקופיים המשמשים ניקוד מחלה. (ב) שני transformants העצמאי נבדק עבור כל זן (N> 100). כל מוטציות chitinase מחסר (1/2 / 3Δ: endochitinases מוטציה משולשת, 4Δ: יחיד מוטציה N-acetylglucosaminidase, 1/2/3 / 4Δ: מוטציה מרובעת) נגוע הצמח הפונדקאי המוביל להיווצרות הגידול כבד כפי שנצפה זיהומים wildtype עם SG200 זן solopathogenic. בניגוד לכך, זן נושאת מחיקה של גן מקודד החלבון קושר RNA Khd4 הופחת ב ארסי כפי שדווח בעבר 24. ברי שגיאה מצביעים סטיית התקן של שלושה ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שונה באישור Langner et al. תא איקריוטיים 2015 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גדולגרסת r של נתון זה.

רקע גנטי 1 st diagn. PCR
(לא כולל / נבדק) 		2 nd diagn. PCR
(אשר / נבדק) 		דְרוֹמִי
(אשר / נבדק) 		Recomb%.
AB33 7/22 - 7/15 32
AB33 cts1 Δ 19/24 - 5/5 21
SG200 0/10 8/10 7/8 70
SG200 cts1 Δ 0/20 19/20 14/19 70

טבלה 1:. אימות הזנים למחיקות cts3 cts3 הגן chitinase נמחק בארבעה רקע גנטי שונה כדי לאפשר מחקרים של צמיחה פילמנטיות (AB33) וזיהום (SG200) ב מחיקות יחיד מרובים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מוטציות מחיקות למחקרים גנטיים הפוכים ב U. maydis. נקודת המוצא היא קונסטרוקציה המחיקה המכיל רצפים איגוף של הגן של ריבית המכיל רצפים של כ 1 קילו במעלה הזרם של ההתחלה במורד הזרם של תחנת-קודון וכן קלטת התנגדות מתאימה כפי שהוא היה מותאם בעבר 7,9 . הבונה יש שתופק בנפרד עבור כל גן ומאומת בקפידה עבור שגיאות רצף לפני מחיקת הגן. מוטציות פוינט החביות יכולות לגרום לשינויים לא רצויים ברצף הגנומי, בפרט כשמדובר החביות להגיע אל גן השכן או המוטציה משנה גורמים רגולטוריים. זה ישפיע על כל transformants ויכול לגרום פנוטיפים ו תופעות לוואי שאינם קשורים מחיקת הגן הרצויה.

כאשר מתכננים את האסטרטגיה המחיקה, את הפנוטיפ הצפוי מתפלג להיחשב לבחור הרקע הגנטי. במקרה הנוכחי, AB33 23 ו SG200 10 נבחרו על מנת לאפשר בדיקות פנוטיפים זיהום המתג וצומח מורפולוגיים. בדומה לכך, רבים-outs לקרוא אחרים עשויים להיות בעלי עניין, בשילובים למשל עם cts1 מועסקים בנתוני היצוא של חלבונים Heterologous 14,26, ו רקע המתח עם fluorescently מתויג rrm4 מאפשר ניתוח של תחבורה RNA על endosomes 27,28.

במהלך אימות המתח, PCRs אבחון תפוקה גבוהה לאפשר הפחתה מהירה של מספר מועמדים להיבדק בבית כתם הדרום למדי מייגע. בפרט, PCR האבחון הראשון מאפשר הדרת המועמדים עדיין המכיל את העותק wildtype של גן מסוים, ובכך מונע את השימוש המסיבי של פנול רעיל בהכנות gDNA. במקרה רגיל עם גנים שאינם חיוניים, כמחצית המושבות עשויה להכיל גן wildtype. יכול להיות שלפני ההקרנה זה עניין רב עבור גנים עם פנוטיפים צמיחה מזיק פוטנציאלי. מאה מועמדים יכולים להיות מוקרנים במהירות.

אם כל המועמדים להכיל את עותק wildtype, את מחיקת הגן היא קטלנית ככל הנראה. זה יכול להיות מאושר על ידי מחיקת עותק אחד רקע זן דיפלואידי (d132 למשל) וניתוח של הפרדה לאחר teliospore נביטת 29. לחלופין, אסטרטגית מחיקה מותנית בשימוש אמרגן מושרה ניתן לבחור לבצע את פנוטיפ מוטנטי. עם זאת, גם זיהום נובע מאופן NaOH המבוסס הגולמי להכנת gDNA יכול להפריע PCR ולהוביל-שלילי שווא כלומר מועמדים לא מראים להקה ולכן נשמרים למרות שהם מכילים את הגן. זה יכול להיות שלילי על ידי בדיקת גן מלא עם מוצר היקף דומה לתגובת PCR עצמאית או על ידי רב מפלסים-PCR עם שני פריימרים ספציפי גנים פריימרים עבור גן בקרה לגרום שבר גדול.

תוכן "> אם מוטציה היא כבר זמין, למשל, cts1 Δ 30 או rrm4 Δ, זן דור הגירסות מתויגות יכול להיות מואץ על ידי החלפת קלטת התנגדות מחיקת הגן (למשל hygR) בגנום עם מבנה רומן המכיל, למשל, fluorescently שכותרתו rrm4 ועם סמן התנגדות שונה (למשל natR). במקרה זה, יכולים להיות מוקרן transformants ידי אובדן של סמן ההתנגדות הראשוני 9. מועמדים נכונים עמידים רק נגד האנטיביוטיקה (nourseothricin) החדש אבדו ההתנגדות הראשונית שלהם (hygromycin .) בנוסף, שלמה של פנוטיפ מוטנטי טרנס יכול להתבצע כדי לוודא הפונקציונליות של בונה מתויגת 30,31.

הגן המתואר כאן האסטרטגיה המחיקה ושינוי מציעה כלי אמין ומדויק באנליזה גנטית של U. maydis. לקבלת מחיקות מרובות עם זאת, זן generation יכול לקבל זמן רב, מאז השינויים צריכים להתבצע ברצף. לכן, ככלי משלים, בשנה שעברה מערכת CRISPR-קאש הוקמה עבור U. maydis 32. היא מציעה את האפשרות לשבש כמה גנים בו זמנית היא תוספת מצוינת בארגז הכלים הגנטיים של U. maydis.

לסיכום, פרוטוקול עבור מניפולציה גנטית U. דור זן maydis המתואר כאן הוא שיטה חזקה כי כבר בשימוש נרחב הקהילה במשך שנים. יחד עם אוסף מקיף של מודולים קלטת התנגדות בהתאמה היא מאפשרת לכל מיני הנדסה גנטית פטרייה זו, בשאלות מגוונות החל מבסיסי המחקר היישומי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

תודה מיוחדת לד"ר בנדיקט Steuten לקריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה המקורית על chitinases בוצע על ידי ד"ר תורסטן Langner. המעבדה של VG נתמך לפי האשכול של מצוינות למדעי הצמח (CEPLAS, DFG EXC 1028) ו BioSC, המעבדה של KS הוא נתמך על ידי BioSC. KB נתמך על ידי BioSC. הפעילות המדעית של מרכז המדע Bioeconomy (BioSC) נתמכו כלכלית על ידי משרד חדשנות, מדע ומחקר במסגרת של NRW Strategieprojekt BioSC (מס '313 / 323-400-00213). LF נתמך על ידי דוקטורט של 1525 iGRADplant קבוצת הדרכת המחקר הבינלאומי DFG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminobenzoeic acid (Free Acid) Sigma Aldrich A-9878
Bacto agar  BD 214010 alternatively use local supplier
Bacto peptone BD 211677 alternatively use local supplier
Bacto yeast extract  BD 212750 alternatively use local supplier
CaCl2*2H2O Grüssing GmbH 10234 alternatively use local supplier
Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) Sigma Aldrich P-2250
Carboxin  Sigma Aldrich 45371
Casamino acids  BD 223050
Cholinchlorid Sigma Aldrich C-1879
Citric acid ChemSolute 24,321,000 alternatively use local supplier
CuSO4*5H2O Fluka 61240 alternatively use local supplier
D(+)Sucrose  Roth 4621.1 alternatively use local supplier
DNA degr. free acid  Sigma-Aldrich D-3159
EDTA Sigma Aldrich E4378
FeCl3*6H2O Grüssing GmbH 10288 alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate salt Sigma Aldrich A1720
Trichoderma lysing enzymes Sigma Aldrich L1412
D(+) Glucose Caelo 2580 alternatively use local supplier
Glycerin  Fisher Chemical G065015 alternatively use local supplier
H3BO3 AppliChem A2940 Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium salt Sigma Aldrich H3393-50KU
Hygromycin B-solution Roth 1287.2 Dangerous substance. 
KCl VWR 26764298 alternatively use local supplier
KH2PO4 AppliChem A3620 alternatively use local supplier
MgSO4 waterfree Merck 7487-88-9 Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2O AppliChem A2087 alternatively use local supplier
myo-Inositol Sigma Aldrich I-5125
Na2-EDTA*2H2O AppliChem A2937 alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2O Roth 0274.2 alternatively use local supplier
Na2SO4 Grüssing GmbH 12174 alternatively use local supplier
NaCl Fisher Chemical S316060 alternatively use local supplier
NaOH ChemSolute 13,751,000 alternatively use local supplier
NH4NO3 Roth K299.1 alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free acid) Sigma Aldrich N-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate   Werner BioAgents 5,001,000
Nutrient broth  Difco local suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 Sigma Aldrich P3803 Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG) Sigma Aldrich P-3640
Potassium acetate AppliChem 121479 alternatively use local supplier
Pyridoxin (monohydrochlorid) Sigma Aldrich P-9755
Riboflavin  Sigma Aldrich R4500
RNaseA Sigma Aldrich R5503
SDS Roth Cn30.3 alternatively use local supplier
small syringe BD 300300 alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µm VWR 28145-477 alternatively use local supplier
Sorbitol Roth 6213.1 alternatively use local supplier
Thiamin-hydrochloride Serva 36020.02 alternatively use local supplier
tri-Na-Citrate Fisher Chemical S332060 alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane VWR 103156X alternatively use local supplier
Tris hydrochloride Roth 9090.4 alternatively use local supplier
Triton X-100  Serva  37240 alternatively use local supplier
ZnCl2 Fluka 96470 alternatively use local supplier
Composition of solutions/preparation of material Composition of solutions
Carboxin Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose 
Geneticin (G418) Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. 
Heparin Stock: 15 mg/ml
Holliday salt solution 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution  0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
Hygromycin Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
Nourseothricin Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) 
RegLight 1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8 Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 8 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG 40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE buffer, pH 8 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase 10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 8 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. 
Usti-lysis buffer 2 mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloining: a laboratry manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

Tags

גנטיקה גיליון 115, הנדסה גנטית מוטציה מחיקה הפוכה גנטיקה פנוטיפ מוטנטי הומולוגי פטריות תועבת מודל הפתוגן צמח אימות זן
מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bösch, K., Frantzeskakis, L.,… More

Bösch, K., Frantzeskakis, L., Vraneš, M., Kämper, J., Schipper, K., Göhre, V. Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions. J. Vis. Exp. (115), e54522, doi:10.3791/54522 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter