Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente

Margit Fuchs; Marie-Chloé Boulanger; Herman Lambert; Jacques Landry; Josée N. Lavoie

doi:10.3791/54557

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Methodenartikel

Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente

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DOI:

10.3791/54557

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16. September 2016

Margit Fuchs¹^,² , Marie-Chloé Boulanger³^,⁴ , Herman Lambert¹^,² , Jacques Landry¹^,² , Josée N. Lavoie¹^,²

¹Département de biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Faculté de médecine, Centre de recherche sur le cancer de l'Université Laval, ²Oncology, Centre de recherche du CHU de Québec, Université Laval, ³Laboratoire d'études moléculaires des valvulopathies (LEMV), Groupe de recherche en valvulopathies (GRV), Quebec Heart and Lung Institute/Research Center, ⁴Department of Surgery, Université Laval

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode für Depletion-Rescue-Experimente, die die zelluläre Integrität und Proteinhomöostase bewahrt. Die Adenofektion ermöglicht funktionelle Analysen von Proteinen innerhalb biologischer Prozesse, die auf fein abgestimmter Aktin-basierter Dynamik beruhen, wie z. B. mitotische Zellteilung und Myogenese, auf Einzelzellebene.

Zusammenfassung

Zelluläre Prozesse, wie beispielsweise die Mitose und Zelldifferenzierung werden durch Änderungen in der Zellform bestimmt, die auf die richtige Remodellierung der Zell Zytoskelettstrukturen weitgehend verlassen. Dabei wird die Montage-Demontage von höherer Ordnung makromolekulare Strukturen zu einem bestimmten Zeitpunkt und Ort, ein Vorgang, der besonders empfindlich gegenüber Störungen durch die Überexpression von Proteinen verursacht wird. Methoden, die Protein-Homöostase und aufrechtzuerhalten in der Nähe zu normalen Zellmorphologie sind höchst wünschenswert, um zu bestimmen die funktionelle Beitrag eines Proteins von Interesse in einer Vielzahl von zellulären Prozessen erhalten kann. Transient Verarmungsrettungsversuche auf Basis von RNA-Interferenz sind leistungsfähige Ansätze Proteinfunktionen und strukturellen Anforderungen zu analysieren. Allerdings Wiedereinführung des Zielproteins mit minimalen Abweichung von seiner physiologischen Ebene ist eine echte Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Methode genannt adenofection das entwickelt wurde, um die Rolle von molekularen Chaperonen zu studieren eind Partner in dem normalen Betrieb von sich teilenden Zellen und die Beziehung mit Aktin-Umbildung. HeLa-Zellen wurden von BAG3 verarmt mit siRNA-Duplexe die 3'UTR Region abzielt. unter Verwendung von rekombinanten Adenoviren gekoppelt Transfektionsreagenzien GFP-markierten BAG3 Proteine wurden gleichzeitig in> 75% der Zellen wieder eingeführt. Adenofection aktiviert BAG3-GFP-Proteine bei nahezu physiologischen Konzentrationen in HeLa-Zellen verarmt BAG3, in Abwesenheit eines Stressreaktion auszudrücken. Es wurde keine Wirkung auf den Ebenen der endogenen Heat Shock Protein Chaperone beobachtet, den Stress-induzierbaren Regulatoren der Protein-Homöostase. Weiterhin kann durch Baculoviren Antreiben der Expression von fluoreszierenden Markern zum Zeitpunkt der Zell Transduktion-Transfektion Zugabe konnten wir mitotischen Zelldynamik durch Zeitraffer mikroskopische Analysen sezieren mit minimaler Störung der normalen mitotischen Progression. Adenofection ist auch auf schwer zu Infect Mauszellen, und geeignet für die funktionelle Analyse von Myoblasten differenzierung in Myotuben. So bietet adenofection eine vielseitige Methode Struktur-Funktion in sensiblen biologischen Prozessen beteiligten Proteine Analysen durchzuführen, die auf höherer Ordnung Dynamik des Zytoskeletts verlassen.

Einleitung

Funktionelle Inaktivierung der Genexpression in Säugerzellen ist der Goldstandard Proteinfunktionen zu sezieren. Neu entwickelte Technologien der Genom Bearbeitung ^1,2 kurz über die Verwendung von ortsspezifischen Nukleasen wie Zink-Finger - Nukleasen und gruppierten regelmäßig voneinander beabstandete Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CAS9 erlauben nun die Generierung von Zelllinien mit gezielten Gen - Deletion und Mutation basiert. Diese neuen Ansätze sollten revolutionieren die Art, wie wir die Proteinfunktion und unser Verständnis der Genetik von Krankheiten beim Menschen studieren. In einigen Fällen ist nicht wünschenswert, langfristige oder vollstä....