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Biology

Adenofection: रिक्तीकरण बचाव प्रयोगों द्वारा सेलुलर Morphodynamics में आण्विक chaperones की भूमिका का अध्ययन के लिए एक विधि

Published: September 16, 2016 doi: 10.3791/54557
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2, 1,2, 1,2
1Département de biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Faculté de médecine, Centre de recherche sur le cancer de l'Université Laval, 2Oncology, Centre de recherche du CHU de Québec, Université Laval, 3Laboratoire d'études moléculaires des valvulopathies (LEMV), Groupe de recherche en valvulopathies (GRV), Quebec Heart and Lung Institute/Research Center, 4Department of Surgery, Université Laval

Abstract

ऐसे बँटवारा और सेल भेदभाव के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं सेल आकार में परिवर्तन है कि मोटे तौर पर सेल cytoskeletal संरचनाओं के उचित remodeling पर भरोसा द्वारा संचालित होते हैं। यह एक निश्चित समय और स्थान पर उच्च आदेश macromolecular संरचनाओं के विधानसभा disassembly, एक प्रक्रिया है कि विशेष रूप से प्रोटीन की overexpression की वजह से perturbations के प्रति संवेदनशील है शामिल है। तरीके कि प्रोटीन homeostasis को बनाए रखने और पास करने वाली सामान्य सेलुलर आकृति विज्ञान बनाए रख सकते हैं अत्यधिक सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत रेंज में ब्याज की एक प्रोटीन के कार्यात्मक योगदान निर्धारित करने के लिए वांछित हैं। क्षणिक कमी-बचाव शाही सेना के हस्तक्षेप पर आधारित प्रयोगों प्रोटीन कार्यों और संरचनात्मक आवश्यकताओं का विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली दृष्टिकोण हैं। हालांकि, इसकी शारीरिक स्तर से न्यूनतम विचलन के साथ लक्ष्य प्रोटीन के reintroduction एक असली चुनौती है। यहाँ हम एक विधि करार दिया adenofection कि आणविक chaperones की भूमिका का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था का वर्णन एकविभाजित कोशिकाओं के सामान्य संचालन में डी भागीदारों और actin remodeling के साथ संबंध। हेला कोशिकाओं siRNA duplexes 3'UTR क्षेत्र को लक्षित साथ BAG3 के समाप्त हो गया था। GFP टैग BAG3 प्रोटीन अभिकर्मक अभिकर्मकों के लिए मिलकर पुनः संयोजक एडिनोवायरस का उपयोग कोशिकाओं की> 75% में एक साथ पुनः शुरू किया गया। Adenofection, BAG3 के समाप्त हो हेला कोशिकाओं में पास शारीरिक स्तर पर BAG3-GFP प्रोटीन व्यक्त करने के लिए एक तनाव की प्रतिक्रिया के अभाव में सक्षम होना चाहिए। कोई प्रभाव नहीं अंतर्जात गर्मी झटका प्रोटीन chaperones, प्रोटीन homeostasis के मुख्य तनाव inducible नियामकों के स्तर पर मनाया गया। इसके अलावा, सेल पारगमन अभिकर्मक के समय में फ्लोरोसेंट मार्कर की अभिव्यक्ति ड्राइविंग baculoviruses जोड़कर, हम mitotic सेल गतिशीलता समय चूक सूक्ष्म द्वारा काटना सकता है कि सामान्य mitotic प्रगति की न्यूनतम गड़बड़ी के साथ विश्लेषण करती है। Adenofection मुश्किल से संक्रमित माउस कोशिकाओं को भी लागू है, और myoblast रचनाकार के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैmyotubes में erentiation। इस प्रकार adenofection संरचना समारोह संवेदनशील जैविक प्रक्रियाओं है कि उच्च आदेश cytoskeletal गतिशीलता पर भरोसा में शामिल प्रोटीन का विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक बहुमुखी तरीका प्रदान करता है।

Introduction

स्तनधारी कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के कार्यात्मक निष्क्रियता प्रोटीन कार्यों टुकड़े करना स्वर्ण मानक है। नवनियुक्त जीनोम संपादन के प्रौद्योगिकियों जैसे जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ के रूप में साइट विशेष न्युक्लिअसिज़ के उपयोग पर आधारित विकसित की है और नियमित रूप से क्लस्टर interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / CAS9 अब लक्षित जीन विलोपन और उत्परिवर्तन 1,2 के साथ सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं। ये उपन्यास दृष्टिकोण जिस तरह से हम प्रोटीन समारोह और मानव रोगों की आनुवंशिकी के बारे में हमारी समझ का अध्ययन कर रहे क्रांतिकारी बदलाव करना चाहिए। कुछ उदाहरणों में, हालांकि, लंबी अवधि या पूर्ण जीन पीटा वांछनीय नहीं है और माध्यमिक सेल मुआवजा तंत्र उत्तेजित हो सकता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल लाइनों की पीढ़ी भी सीमित जब सीमित प्रसार क्षमता है, या जब विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में म्यूटेशन का एक बड़ा सेट की स्क्रीनिंग की मांग की है साथ प्राथमिक सेल संस्कृतियों के साथ काम हो सकता है। यह अक्सर एक सेल ख की निर्भरता को निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैएक प्रोटीन की संरचनात्मक आवश्यकताओं पर iological प्रक्रिया। कि अंत करने के लिए, आरएनए हस्तक्षेप कि विभिन्न सेलुलर पृष्ठभूमि में क्षणिक कमी-बचाव प्रयोगों के लिए सक्षम बनाता द्वारा प्रतिवर्ती पछाड़ना अभी भी संरचना समारोह ब्याज 3 के एक प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए एक सरल और शक्तिशाली तरीका बनी हुई है। हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए एक बड़ी खामी कठिनाई कुशल मुंह बंद करने को प्राप्त करने और सेल की आबादी का बहुमत में ब्याज या निकट शारीरिक स्तर पर उसके संस्करण के प्रोटीन reintroduce करने के लिए है। इस व्यापक अध्ययन है कि कार्यात्मक सेल जनसंख्या आधारित assays में देखा उन लोगों, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर उदाहरण के लिए साथ एकल कक्षों (hypomorphic phenotype) के स्तर पर देखा प्रभाव सहसंबंधी करने का प्रयास सक्षम करने के लिए महत्वपूर्ण है।

क्लासिक अभिकर्मक तरीकों का उपयोग करना, एक मुश्किल से कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी में exogenous प्रोटीन के समरूप और कम अभिव्यक्ति प्राप्त कर सकते हैं। पुनः संयोजक वायरस के साथ कोशिकाओं के पारगमनadenoviruses की तरह अक्सर exogenous प्रोटीन की अधिक सामान्यीकृत अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है। फिर भी, एडीनोवायरस तेज कार रिसेप्टर, जो गैर मानव कोशिकाओं में अनुपस्थित या केवल दुर्बलता से कुछ मानव प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त की है द्वारा सीमित है। इसके अलावा, adenoviruses के सेलुलर प्रवेश मार्ग है कि विनियमित सेल आकार और आसंजन 4-6 संकेत को सक्रिय करता है। जाहिर है, यह वांछनीय है जब सेल morphodynamics की नियामक तंत्र के अध्ययन नहीं है। हम इस समस्या का सामना कर रहे हैं जब हम एक निगरानी जटिल, BAG3-HSPB8 के कार्यात्मक विश्लेषण चलाया, कोशिका विभाजन और actin गतिशीलता में। अग्रणी काम के तनाव के दौरान प्रोटीन 7.8 गुणवत्ता नियंत्रण और भोजी में इस निगरानी परिसर के लिए एक भूमिका का वर्णन किया था। इन अध्ययनों के सबसे बहरहाल, प्रोटीन overexpression पर भरोसा किया, यह सोचते हैं कि chaperones सामान्य रूप से तनाव के दौरान upregulated रहे हैं। यह खुला HSPB8 के साथ परिसर में चाहे BAG3 का सवाल छोड़ दिया है, वें व्यक्त कोशिकाओं को विभाजित के सामान्य संचालन के लिए योगदान कर सकते हैंकई कैंसर कोशिका प्रकार 9 ese chaperones। विशेष रूप से, निगरानी जटिल actin आधारित संरचनाओं कि mitotic प्रगति बहुत रुचि के नियंत्रण, HSPB chaperones और cytoskeletal गतिशीलता 10 के बीच उभरते कनेक्शन दिए गए के पुनर्गठन के लिए योगदान देता है। इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम कमी-बचाव प्रयोगों के लिए एक कारगर तरीका है कि mitotic प्रगति या सेलुलर आकृति विज्ञान के साथ हस्तक्षेप नहीं होता है, और जो प्रोटीन homeostasis को बनाए रखने सेल आकार में परिवर्तन के विनियमन macromolecular परिसर की गतिशीलता के माध्यमिक गड़बड़ी से बचने के लिए विकसित करने की मांग कर रहे थे । इस प्रकार आदर्श रूप में, ब्याज की जीन की कमी से जोड़-वापस एक साथ किया जाना चाहिए।

एक cationic बहुलक या लिपिड के साथ adenovirus के परिसरों का उपयोग इन विट्रो और इन विवो 11,12 में जीन स्थानांतरण बढ़ावा देने के लिए वर्णित किया गया है। उदाहरण के लिए, कैल्शियम फॉस्फेट (पूंजी) के साथ एक वेग फार्म करने के लिए प्रकट होता हैएडीनोवायरस कि बढ़ाने एक कार स्वतंत्र मार्ग 13 के माध्यम से वायरस बाध्यकारी प्रविष्टि। दरअसल, हमने पाया है कि cationic यौगिकों के साथ एडीनोवायरस आधारित सेल पारगमन और अभिकर्मक के संयोजन कमी-बचाव प्रयोगों की दक्षता में वृद्धि कर सकता है। यह बहुमत में पास अंतर्जात स्तरों पर exogenous प्रोटीन की अभिव्यक्ति को समायोजित करने के लिए हमें 20 गुना करने के लिए 3 से वायरस की मात्रा को कम करने की अनुमति दी है, क्रम में सेल लाइन और ब्याज की जीन, और एक व्यापक खिड़की से लाभ पर निर्भर करता है सेलुलर आकृति विज्ञान पर न्यूनतम प्रभाव के साथ ब्याज की एक सेल की आबादी का। ऐसी परिस्थितियों के अंतर्गत, हम भी अंतर्जात प्रोटीन अभिव्यक्ति (> 75%) की उच्च क्षमता पछाड़ना प्राप्त कर सकता है। हम इसके द्वारा कदम से कदम का वर्णन विधि और सबूत है कि प्रोटीन समस्थिति काफी के रूप में हीट शॉक प्रोटीन परिवार के तनाव प्रेरित chaperones की अपरिवर्तित स्तरों द्वारा मूल्यांकन परेशान नहीं है प्रदान करते हैं, शारीरिक आरओ के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए विधि उपयुक्त बनासमय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा आणविक chaperones की le। प्रोटोकॉल सेल तुल्यकालन प्रक्रियाओं के लिए और mitotic प्रगति के दौरान फ्लोरोसेंट मार्करों के निम्न स्तर, सामान्य actin आधारित और धुरी गतिशीलता के साथ कम से कम हस्तक्षेप के साथ सह-अभिव्यक्ति के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध baculoviruses का उपयोग करने के लिए उत्तरदायी है। हम आगे की विधि है, जो इन विट्रो में myotubes में myoblast भेदभाव पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव के साथ माउस C2C12 कोशिकाओं, "transduce के लिए कड़ी मेहनत" के लिए लागू है की बहुमुखी प्रतिभा दिखा।

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Protocol

1. मध्यम और समाधान की तैयारी (सभी बाँझ फ़िल्टर)

  1. C2C12 माउस मांसपेशियों की कोशिकाओं (भेदभाव के अध्ययन)
    1. C2C12 सेल संस्कृति के रखरखाव के लिए मध्यम विकास की 500 मिलीलीटर तैयार: DMEM उच्च ग्लूकोज 10% FBS और 2 मिमी एल Glutamine के साथ पूरक।
    2. C2C12 भेदभाव के लिए 100 मिलीलीटर भेदभाव माध्यम (डीएम) तैयार: DMEM उच्च ग्लूकोज 2% हार्स सीरम के साथ पूरक।
  2. हेला कोशिकाओं (mitotic कोशिकाओं में अध्ययन)
    1. तैयार 500 मिलीलीटर हेला आरएफपी H2B सेल संस्कृति के रखरखाव और प्रयोगों के लिए αMEM: 10% FBS और 2 मिमी एल glutamine (αMEM 10%) के साथ पूरक αMEM।
    2. हेला आरएफपी H2B सेल तुल्यकालन के लिए 500 मिलीलीटर αMEM-शून्य से (बिना deoxyribonucleosides / ribonucleosides) तैयार: αMEM-शून्य से 10% FBS और 2 मिमी एल glutamine (αMEM-शून्य से 10%) के साथ पूरक।
    3. हेला-आरएफपी H2B एल के लिए 20 मिलीलीटर αMEM फिनोल लाल के बिना तैयारIve सेल अधिग्रहण: αMEM फिनोल लाल के बिना 10% FBS और 2 मिमी एल glutamine के साथ पूरक।
    4. 100 मिमी thymidine तैयार: vortexing द्वारा 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर एच 2 ओ में 24.2 मिलीग्राम भंग। फ़िल्टर बाँझ और 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
  3. आम समाधान
    1. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 0.05% trypsin, 0.625 मिमी EDTA: तैयार 0.05% trypsin / EDTA। फ़िल्टर बाँझ और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots। एक बार thawed, 4 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य रखने के लिए।
    2. HBS2x तैयार: 280 मिमी NaCl, 50 मिमी HEPES, 1.5 मिमी ना 2 4 HPO। 10 एन NaOH के साथ पीएच बिल्कुल बीच 7.01-7.05 समायोजित करें। बाँझ फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।

2. fibronectin और हेला-आरएफपी H2B प्रकोष्ठों के चढ़ाना के साथ सेल संस्कृति प्लेटों की कोटिंग

नोट: प्रयोग करने से पहले, प्रत्येक आपरेटर को इष्टतम सेल चढ़ाना शर्तों कोशिकाओं का एक उचित घनत्व को प्राप्त करने के बाद बदलाव के ओसी सकता है की स्थापना करनी चाहिएप्रत्येक जोड़तोड़ और प्रत्येक के लिए अलग सेल लाइन के बीच मौजूदा।

  1. दिन के प्रयोग से पहले, सुनिश्चित करें कि वे चढ़ाना के दिन पर विकास का तेजी से चरण के भीतर कर रहे हैं बनाने के लिए हेला-आरएफपी H2B कोशिकाओं का विस्तार। 2 1/3 लगातार एक 80% मिला हुआ 1x10 सेमी की थाली से शुरू 10 सेमी प्लेटों में dilutions बनाओ।
    नोट: योजना प्रयोग के लिए प्लेटों की संख्या। हर हालत की गणना के रूप में डुप्लिकेट, अल्पकालिक रहते सेल इमेजिंग के लिए एक और एक प्रोटीन के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा पछाड़ना और exogenous प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए निकालता है। एक अतिरिक्त प्लेट योजना सेल नंबर वायरस पारगमन के लिए पूर्व निर्धारित करने के लिए।
  2. 10 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin साथ चढ़ाना सेल, कोट गिलास नीचे व्यंजन से पहले। 1 मिलीग्राम / एमएल fibronectin (बाँझ 1x पीबीएस में पतला) प्रति 35 मिमी पकवान के 100 कमजोर पड़ने अच्छी तरह से पूरी सतह को कवर किया और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 1 घंटे के लिए सेते हैं: एक 1 के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. ऊष्मायन के दौरान, पूर्व गर्म αMEM वाई पूरकवें 10% FBS (αMEM 10%) और 0.05% trypsin / EDTA 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. ऊष्मायन के 45 मिनट के बाद, सेल समाधान की तैयारी शुरू। बाँझ हुड में, एक 10 सेमी की थाली से मध्यम aspirate 1.5 मिलीलीटर 0.05% trypsin / EDTA के साथ दो बार धीरे से कुल्ला, और पिछले आकांक्षा पर trypsin / EDTA के 0.5 मिलीलीटर छोड़ दें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं, 5% सीओ 2। धीरे थाली और माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन दोहन करके, सत्यापित करें कि सभी कोशिकाओं को अलग कर दिया है। ΑMEM 10% और पिपेट धीरे कई बार की 10 मिलीलीटर की कोशिकाओं को अलग करने के लिए जोड़ें। एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग सेल निलंबन के एक 10 μl नमूना गणना।
  6. गिलास नीचे व्यंजन से महाप्राण fibronectin समाधान। फ़ाइब्रोनेक्टिन सेल चढ़ाना से पहले बाहर सुखाने के लिए अनुमति न दें।
  7. प्लेट 1.5x10 में 2 मिलीलीटर αMEM 10% 35 मिमी पकवान प्रति 5 कोशिकाओं और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं। खुर्दबीन के नीचे 30-45 मिनट के बाद सत्यापित करें कि कोशिकाओं को अच्छी तरह से SEPA हैंरेटेड बाद से वे प्रवृत्ति प्लेट के केंद्र में जमा करना है।
  8. यदि आवश्यक हो, प्लेटें धीरे कोशिकाओं को फिर से विभाजित करने के लिए क्रॉस-वार आंदोलन। प्लेट एक 35 मिमी प्लेट आदेश सेल नंबर वायरस पारगमन से पहले गिनती करने में स्थिति की संख्या के लिए अतिरिक्त।
  9. कम से कम 50% की एक सेल घनत्व हासिल करने के लिए अगले दिन तक कोशिकाओं को विकसित। एक सेल घनत्व वायरस पारगमन दक्षता का एक महत्वपूर्ण कमी की तुलना में कम 50% परिणाम, वृद्धि सेल प्रति प्रोटीन अभिव्यक्ति की विविधताओं, और सेल विषाक्तता वृद्धि हुई है।
    नोट: फ़ाइब्रोनेक्टिन के साथ कांच के बर्तन की कोटिंग सेल के विकास और आकृति विज्ञान में सुधार और बँटवारा के माध्यम से कोशिकाओं के समुचित प्रगति को बढ़ावा देता है। यह आम तौर पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जिलेटिन सस्ता है कि द्वारा बदला जा सकता है।

3. Adenovirus पारगमन और अंतर्जात प्रोटीन हेला-आरएफपी H2B कोशिकाओं में siRNA अभिकर्मक द्वारा पछाड़ना पूंजी Precipitates का प्रयोग

सावधानी! कामवायरस के साथ आईएनजी विशेष सावधानियों और सभी सामग्री है कि वायरस के संपर्क में किया गया है की एक उचित निपटान की आवश्यकता है।

सावधानी! हमारे हाथ में, पूंजी precipitates अक्सर जैविक पुटिका तस्करी (जैसे, भोजी) से जुड़े प्रक्रियाओं पर उदाहरण के लिए, और अधिक अवांछनीय प्रभाव है। तदनुसार यह एक cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करने के लिए (देखें नीचे) और विश्लेषण से पहले कम से कम 48 घंटा इंतजार करने के लिए सिफारिश की है।

नोट: एक असंबंधित जीन (यानी, lacZ) या कोई जीन ले जाने के लिए एक नियंत्रण adenovirus सभी Adenofections में एक न्यूनतम MOI (10-20 pfu / सेल) ब्याज की जीन ले जाने पुनः संयोजक एडिनोवायरस की न्यूनतम राशि का उपयोग कर तक पहुंचने के लिए प्रयोग किया जाता है।

नोट: यह प्रक्रिया एक बड़ी सेल की आबादी में सेल प्रति सामान्य अभिव्यक्ति मदद करने के लिए दिखाया गया है।

  1. सेल चढ़ाना के बाद एक दिन, अतिरिक्त चढ़ाया पकवान से कोशिकाओं की संख्या गिनती। मध्यम Aspirate और1 मिलीलीटर 0.05% trypsin / EDTA के साथ एक बार कुल्ला। 0.05% trypsin / EDTA के फिर से 1 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं जब तक सभी कोशिकाओं को अलग कर दिया है। कोशिकाओं को अलग अच्छी तरह से एक 1ml पिपेट का उपयोग और एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग कर मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं की संख्या गिनती।
  2. सेल प्रति ब्याज (POI) के प्रोटीन के 2 पट्टिका के गठन इकाइयों (pfu) और एक खाली वेक्टर के सेल प्रति 18 PFU के (MOI) संक्रमण की बहुलता पर कोशिकाओं transduce करने की जरूरत वायरस की मात्रा का निर्धारण करते हैं (जैसे, lacZ) सेल प्रति 20 PFU की कुल राशि के लिए। एक ही समय में transduce प्रत्येक baculovirus (actin और αTubulin, GFP और आरएफपी टैग क्रमशः) के 4 PFU। निम्नलिखित adenofection प्रोटोकॉल का उपयोग कोशिकाओं transduce। वायरस फुच्स एट अल में वर्णित के रूप में इस्तेमाल किया गया। 14
  3. हर हालत के लिए एक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब एक बाँझ हुड में तैयार है और गर्म αMEM-शून्य से 10% के 400 μl जोड़ें।
  4. बर्फ पर धीरे-धीरे वायरस के एक विभाज्य पिघलना और, यदि आवश्यक हो, पतला टीआदेश pipetting त्रुटियों को कम करने के लिए एक मात्रा से अधिक 1 μl pipet करने में वह वायरस शेयर।
  5. हालत प्रति गणना वायरस मात्रा प्रत्येक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक युक्त 400 μl αMEM-शून्य से 10% ट्यूब को जोड़ने और pipetting द्वारा धीरे मिश्रण। वायरस शेयर की जगह तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर वापस अपनी गतिविधि रखने के लिए।
  6. कोशिकाओं से मध्यम Aspirate और धीरे वायरस मिश्रण बूंद-वार पिपेट। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं और 1 घंटे के लिए बाँझ हुड के नीचे ध्यान से प्लेटों आंदोलन प्रत्येक 15 मिनट में अच्छी तरह से वायरस के साथ कोशिकाओं को कवर करने के लिए। माध्यम की एक छोटी राशि का उपयोग कोशिकाओं के साथ वायरस के संपर्क की सुविधा।
  7. ऊष्मायन के बाद, धीरे 1.6 मिलीलीटर αMEM-शून्य से 10% प्रत्येक थाली करने के लिए 2 मिलीलीटर की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए, पिपेट 2 मिमी thymidine जोड़कर सेल तुल्यकालन शुरू करने और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर एक और 2 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते ।
  8. इस बीच, siRNA अभिकर्मक मिश्रण तैयार followiएनजी पूंजी अभिकर्मक विधि (चित्रा 1 देखें)। यदि कोई siRNA आवश्यक है, एक खाली अभिकर्मक प्रदर्शन करने के लिए बाँझ पानी से siRNA की राशि की जगह।
  9. हर हालत के लिए 200 μl मिश्रण की गणना, डुप्लीकेट प्रति 400 μl में जिसके परिणामस्वरूप। निम्न उदाहरण 50 एनएम के अंतिम siRNA एकाग्रता के लिए दिया जाता है और ब्याज की प्रत्येक प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना है। एक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में, पिपेट 50 μl 1 एम 2 CaCl और 11 μl 20 माइक्रोन के 139 μl बाँझ एच 2 ओ में siRNA और vortexing द्वारा मिश्रण। एक त्वरित स्पिन के बाद, बूंद के लिहाज से 200 μl HBS2x (280 मिमी NaCl, 50 मिमी HEPES, 1.5 मिमी ना 2 HPO 4, पीएच 7.01-7.05) ध्यान से जोड़ें।
    नोट: छोटे बूंदों छोटे अवक्षेप, बेहतर अभिकर्मक दक्षता में जिसके परिणामस्वरूप कर रहे हैं। धीरे से एक 200 μl-पिपेट का उपयोग कर हवा इंजेक्शन से तीन बार मिला लें।
  10. आरटी पर 30 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं। बूंद के लिहाज से धीरे-धीरे जोड़ें अभिकर्मक मिश्रण के 200 μl प्रत्येक थाली करने के लिए औरआंदोलन पार के लिहाज से। 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में प्लेटें स्थानांतरण।
  11. अगले दिन, कोशिकाओं 2 मिलीलीटर गर्म HEPES (6.7 मिमी KCl, 150 मिमी NaCl, 10 मिमी HEPES, पीएच 7.3) के साथ दो बार कुल्ला और 2 मिलीलीटर αMEM-शून्य से 10% जोड़ें। एक समय में अधिक से अधिक चार सेल प्लेटों के साथ आगे बढ़ने के बाद से तापमान में बदलाव सेल चक्र की लंबाई को प्रभावित नहीं करते।
  12. 20-40x (हवा) के एक बढ़ाई एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे संक्रमण दक्षता कल्पना और प्रलेखन के लिए दोनों फ्लोरोसेंट और प्रसारण चैनलों में शर्त के अनुसार तीन प्रतिनिधि छवियों का अधिग्रहण। सात घंटे बाद, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में 2 मिमी thymidine जोड़ सकते हैं और एक और 16 घंटे के लिए सेते हैं।
  13. अगले दिन, siRNA अभिकर्मक और वायरस के संक्रमण के बाद 48 घंटा, 2 मिलीलीटर गर्म फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को दो बार कुल्ला और लाइव सेल इमेजिंग के लिए या फिनोल के साथ w / ओ फिनोल लाल में 2 मिलीलीटर αMEM 10% 7 घंटे के लिए रिलीज प्रोटीन निकासी के लिए लाल।
  14. प्रोटीन के अर्क की तैयारी और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए हर हालत 48 घंटा बाद अभिकर्मक के लिए हार्वेस्ट कोशिकाओं पछाड़ना की दक्षता और अंतर्जात प्रोटीन 15 की अभिव्यक्ति का निर्धारण।
    नोट: ब्याज की प्रोटीन के साथ ही लोडिंग नियंत्रण के रूप में सेवारत उचित एंटीबॉडी के खिलाफ एंटीबॉडी का प्रयोग करें। पछाड़ना की दक्षता, नियंत्रण सेल lysates के घटते मात्रा में लोड हो रहा है (नियंत्रण siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट) द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए एक अनुमापन वक्र प्रदान करने के लिए (यानी, 1, आधा, एक चौथाई, ⅛)।

4. Adenovirus पारगमन और अंतर्जात प्रोटीन एक cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग हेला कोशिकाओं में siRNA अभिकर्मक द्वारा पछाड़ना

नोट: यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि प्रयोगों है कि सेल तुल्यकालन शामिल नहीं है के लिए अनुकूलित किया गया था मौजूद है और / या जब siRNA अभिकर्मक पूंजी विधि द्वारा नहीं किया जा सकता है, उदाहरण के लिए कुछ सेल लिन में अवांछनीय विषाक्त प्रभाव से बचने के लिएतों। इस प्रोटोकॉल भी आदेश एक उपयुक्त सेल घनत्व पर काम करने में adenofection के बाद एक सेल replating कदम भी शामिल है। हम केवल cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक का परीक्षण किया है।

सावधानी! वायरस के साथ काम करना विशेष सावधानियों और सभी सामग्री है कि वायरस के संपर्क में किया गया है की एक उचित निपटान की आवश्यकता है।

  1. प्लेट में 2.5 मिलीलीटर αMEM 10% 35 मिमी पकवान प्रति 1.75 x 10 5 कोशिकाओं और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, 5% सीओ 2। प्लेट एक 35 मिमी प्लेट आदेश सेल नंबर वायरस पारगमन से पहले गिनती करने में स्थिति की संख्या के लिए अतिरिक्त।
  2. कम से कम 50% की एक सेल घनत्व हासिल करने के लिए अगले दिन तक कोशिकाओं को विकसित। वायरस पारगमन दक्षता का एक महत्वपूर्ण कमी में कम से कम 50% परिणाम के एक सेल घनत्व में वृद्धि हुई, सेल प्रति प्रोटीन अभिव्यक्ति की विविधताओं, और सेल विषाक्तता वृद्धि हुई है।
  3. सेल चढ़ाना के बाद एक दिन, अतिरिक्त चढ़ाया पकवान से कोशिकाओं की संख्या गिनती। महाप्राणमध्यम और 1 मिलीलीटर 0.05% trypsin / EDTA के साथ एक बार कुल्ला। 0.05% trypsin / EDTA के फिर से 1 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं जब तक सभी कोशिकाओं को अलग कर दिया है। अलग कक्षों में अच्छी तरह से एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग और एमएल प्रति कोशिकाओं की संख्या गिनती।
  4. वायरस की मात्रा सेल प्रति ब्याज (POI) के प्रोटीन की 20-40 पट्टिका के गठन इकाइयों (pfu) और एक खाली वेक्टर के सेल प्रति 0-20 PFU के (MOI) संक्रमण की बहुलता transduce करने की जरूरत निर्धारित बनाने के लिए (जैसे, lacZ) सेल प्रति 40 PFU की कुल राशि के लिए।
  5. हर हालत के लिए एक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब एक बाँझ हुड में तैयार है और गर्म αMEM 10% के 400 μl जोड़ें।
  6. बर्फ पर धीरे-धीरे वायरस के एक विभाज्य पिघलना और, यदि आवश्यक हो तो, आदेश pipetting त्रुटियों को कम करने के लिए एक मात्रा से अधिक 1 μl pipet करने के लिए वायरस शेयर पतला।
  7. शर्त के अनुसार गणना की मात्रा वायरस प्रत्येक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक युक्त 400 μl αMEM 10% ट्यूब को जोड़ने और pipetting द्वारा धीरे मिश्रण। प्लेस वेंई वायरस शेयर तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर वापस अपनी गतिविधि रखने के लिए।
  8. कोशिकाओं से मध्यम Aspirate और धीरे वायरस मिश्रण बूंद-वार पिपेट। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं और 1 घंटे के लिए बाँझ हुड के नीचे ध्यान से प्लेटों आंदोलन प्रत्येक 15 मिनट में अच्छी तरह से वायरस के कमजोर पड़ने के साथ कोशिकाओं को कवर करने के लिए। माध्यम की एक छोटी राशि का उपयोग कोशिकाओं के साथ वायरस के संपर्क की सुविधा।
  9. इस बीच, siRNA अभिकर्मक मिश्रण अभिकर्मक विधि निम्नलिखित तैयार करते हैं। यदि कोई siRNA आवश्यक है, एक खाली अभिकर्मक प्रदर्शन करने के लिए सीरम के बिना माध्यम के द्वारा siRNA की राशि की जगह।
    1. निम्न उदाहरण 50 एनएम के अंतिम siRNA एकाग्रता के लिए दिया जाता है और ब्याज की प्रत्येक प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना है। प्रत्येक adenofection के लिए, एक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब (जैसे, 6.25 μl 20 माइक्रोन siRNA + 144 μl सीरम बिना मध्यम) और एक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब containi सीरम के बिना 150 μl मध्यम में 416 एनएम siRNA युक्त तैयारएनजी 6.25 μl cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक + 144 सीरम बिना μl मध्यम।
    2. ऊपर pipetting द्वारा और एक 200 μl विंदुक के साथ कई बार नीचे प्रत्येक प्लास्टिक ट्यूब की सामग्री मिक्स। दोनों ट्यूब की सामग्री का मिश्रण है और ऊपर pipetting द्वारा और एक 200 μl विंदुक के साथ कई बार नीचे मिश्रण। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  10. वायरस के साथ ऊष्मायन के बाद, धीरे 2.2 मिलीलीटर की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक थाली करने के लिए 1.8 मिलीलीटर αMEM 10% पिपेट और तुरंत धीरे धीरे बूंद के लिहाज से प्रत्येक थाली करने के लिए siRNA अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें और आंदोलन पार के लिहाज से। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में प्लेटें स्थानांतरण।
  11. अगले दिन, फिर से प्लेट 37 डिग्री सेल्सियस से कम में 2.5 मिलीलीटर αMEM 10% चार नए 35 मिमी प्लेटों में प्रत्येक 35 मिमी थाली से कोशिकाओं को एक और सेते एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए, 5% सीओ 2।
  12. अगले दिन, siRNA अभिकर्मक और वायरस के संक्रमण, की तैयारी के लिए हर हालत के लिए एक थाली से फसल कोशिकाओं के बाद 48 घंटाप्रोटीन के अर्क और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण पछाड़ना की दक्षता और अंतर्जात प्रोटीन 15 की अभिव्यक्ति का निर्धारण।
    नोट: शेष प्लेटों के साथ, पसंद के प्रोटोकॉल का उपयोग, सेल निर्धारण के साथ आगे बढ़ने और ब्याज 14 के एंटीबॉडी के साथ immunofluorescence विश्लेषण के लिए नमूने के अधीन।

5. mitotic कोशिकाओं और डेटा विश्लेषण का लाइव सेल इमेजिंग

  1. एक औंधा एक humidified / 5% सीओ 2 / थर्मो-विनियमित कक्ष के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के साथ mitotic कोशिकाओं पर अल्पकालिक लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन करना।
    नोट: इस अध्ययन में, एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन (40X 0.75 एनए) का इस्तेमाल किया गया था, एक EMCCD के साथ सुसज्जित -50 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा आरोप युग्मित कैमरा।
  2. अधिग्रहण से पहले, सत्यापित करें कि चैम्बर 37 डिग्री सेल्सियस के उचित तापमान पर पहुँच गया है।
    नोट: इस सूक्ष्म प्रणाली के आधार पर कई घंटे लग सकते हैं।
  3. माइकर में संस्कृति बर्तन रखेंoscope चैम्बर अधिग्रहण से पहले 1 घंटा मध्यम का उचित संतुलन को सक्षम और तापमान परिवर्तन के कारण बहती फोकस से बचने के लिए। कोशिकाओं के mitotic स्थिति की निगरानी। इस बिंदु पर, कोशिकाओं के 10-15% बँटवारा (prophase-prometaphase) के प्रारंभिक चरणों में होना चाहिए।
  4. संतुलन समय के दौरान, पूर्व प्रयोगों में निर्धारित मापदंडों के अधिग्रहण की स्थापना की। आमतौर पर, 100% की एक लेजर तीव्रता और 121-130 के एक संवेदनशीलता के साथ 0.2-3 सेकंड के दोनों चैनलों (488 और 594) के लिए एक जोखिम समय हमारे हाथ में उपयुक्त मानकों हैं।
    नोट: पहला परीक्षण न्यूनतम लेजर तीव्रता और अधिग्रहण के समय / अंतराल है कि सेल नुकसान का कारण बनता है और mitotic प्रगति perturbs न्यूनतम photobleaching के साथ एक उचित समाधान में परिणाम निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए।
  5. कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण के अंतराल से अधिक के बिना विश्लेषण करने के लिए शर्त के अनुसार कई क्षेत्रों का चयन करें। एक कताई डिस्क confocal प्रणाली, एक ठेठ सेटअप में होगा का उपयोगचार अलग-अलग परिस्थितियों, प्लेट प्रति 7 क्षेत्रों और 2 रंग चैनल (488 और 594) एक 75 मिनट की अवधि में एक-1.5-2 मिनट के अंतराल के साथ clude।
  6. फोकस एक बार सभी क्षेत्रों में चुना गया है फिर से स्थापित किया है और जितनी जल्दी हो सके अधिग्रहण शुरू कोशिकाओं है कि mitotic प्रवेश पर कर रहे हैं, का चयन करें।
  7. कम से कम तीन बार के अंक के लिए प्रणाली की स्थिरता पर नजर रखने और यदि आवश्यक हो तो फोकस फिर से निर्धारित किया है।
  8. पहली लघु अवधि 75 मिनट का जीना सेल इमेजिंग के बाद, mitotic कोशिकाओं के नए क्षेत्रों की कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा रहा है की संख्या में वृद्धि करने के लिए फिल्मों की एक दूसरे सेट प्राप्त करने के लिए चुना जा सकता है।
  9. अच्छी तरह से परिभाषित मानदंड निर्धारित कोशिकाओं की mitotic phenotypes, जो फ्लोरोसेंट मार्करों पर निर्भर करेगा इस्तेमाल किया जा रहा विश्लेषण करने के लिए। बँटवारा में दोष लंबे समय तक शामिल हो सकते हैं बँटवारा में बिताए समय, गुणसूत्र misalignment, धुरी घोड़ा, और कोर्टेक्स 14 blebbing (anaphase जब तक परमाणु टूटने से)।

6. Differentiatin में LifeAct-TagGFP2 Adenovirus पारगमनजी C2C12 माउस myoblasts

नोट: adenofection प्रोटोकॉल भी मुश्किल से संक्रमित माउस C2C12 भेदभाव के दौर से गुजर myoblasts के लिए लागू है।

  1. प्लेट 2 एक्स 10 5 C2C12 प्लास्टिक पर या पसंद का एक सब्सट्रेट पर मध्यम विकास में 35 मिमी संस्कृति बर्तन में कोशिकाओं।
    नोट: सेल भेदभाव gelatine- या Matrigel लेपित व्यंजन पर सुधार हुआ है। एक अतिरिक्त प्लेट योजना सेल नंबर वायरस पारगमन के लिए पूर्व निर्धारित करने के लिए।
  2. अगले दिन, कोशिकाओं confluency का 80% तक पहुँच जाना चाहिए था। गर्म पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोने और भेदभाव मध्यम (डीएम) के 2 मिलीलीटर जोड़कर myoblast भेदभाव प्रेरित।
  3. अगले दिन, के रूप में दिन के 1 भेदभाव के (डी 1) लेबल, जीवित कोशिकाओं में actin cytoskeleton कल्पना करने के लिए एडीनोवायरस LifeAct-TagGFP2 साथ myocytes transduce। अतिरिक्त थाली से सेल संख्या की गणना 3.2 के तहत वर्णित है। गणना 5 pfu / LifeAct-TagGFP2 adenovirus के सेल और 45 pfu / सेल AdLacZ परीक्षा निम्नलिखितमिसाल तालिका 1 में वर्णित है। कुल वायरस मात्रा 50 pfu / सेल है। वायरस के रूप में वर्णित 14 का इस्तेमाल किया गया
  4. हर हालत के लिए एक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब एक बाँझ हुड में तैयार है और गर्म डीएम के 400 μl जोड़ें।
  5. बर्फ पर धीरे-धीरे वायरस के एक विभाज्य पिघलना और, यदि आवश्यक हो तो, आदेश pipetting त्रुटियों को कम करने के लिए एक मात्रा से अधिक 1 μl pipet करने के लिए वायरस शेयर पतला।
  6. प्रत्येक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक 400 μl डीएम युक्त ट्यूब हालत प्रति वायरस कणों की उचित मात्रा में जोड़ें और pipetting द्वारा धीरे मिश्रण। वायरस शेयर की जगह तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर वापस अपनी गतिविधि रखने के लिए।
  7. व्यंजन से मध्यम Aspirate और धीरे वायरस मिश्रण बूंद-वार पिपेट। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं और 1 घंटा की कुल अच्छी तरह से वायरस के साथ कोशिकाओं को कवर करने के लिए बाँझ हुड के नीचे ध्यान से प्लेटों आंदोलन प्रत्येक 15 मिनट।
  8. ऊष्मायन के बाद, धीरे प्रत्येक थाली पर 1.6 मिलीलीटर डीएम पिपेट और मैं जारी37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 2 घंटे के लिए ncubation, 5% सीओ 2।
  9. इस बीच, एक खाली अभिकर्मक मिश्रण पूंजी अभिकर्मक विधि निम्नलिखित तैयार करते हैं। हर हालत के लिए 200 μl मिश्रण की गणना। 400 μl मिश्रण की कुल मात्रा के लिए निम्न उदाहरण का प्रयोग करें।
    1. एक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में, पिपेट 50 μl 1 एम 2 CaCl 150 में μl बाँझ एच 2 ओ और vortexing द्वारा मिश्रण। एक त्वरित स्पिन के बाद, बूंद के लिहाज से 200 μl HBS2x (280 मिमी NaCl, 50 मिमी HEPES, 1.5 मिमी ना 2 HPO 4, पीएच 7.01-7.05) ध्यान से जोड़ें। धीरे से एक 200 μl पिपेट का उपयोग तीन बार हवा इंजेक्शन द्वारा मिश्रण।
  10. आरटी पर 30 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं। धीरे-धीरे जोड़ें ड्रॉप-वार अभिकर्मक मिश्रण के 200 μl प्रत्येक थाली करने के लिए और आंदोलन पार के लिहाज से। 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में प्लेटें स्थानांतरण।
  11. अगले दिन, कोशिकाओं 2 मिलीलीटर गर्म HEPES (6.7 मिमी KCl, 150 मिमी NaCl, 10 मिमी HEPES, पीएच 7.3) के साथ दो बार कुल्ला और 2 मिलीलीटर डीएम जोड़ें। infe कल्पना20-40X (हवा) के एक बढ़ाई एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे ction दक्षता और प्रलेखन के लिए दोनों फ्लोरोसेंट और प्रसारण चैनलों में शर्त के अनुसार तीन प्रतिनिधि छवियों का अधिग्रहण।
  12. वांछित प्रयोग सेटअप के आधार पर, कई दिनों के लिए myotubes में भेदभाव का पालन करें। प्रकोष्ठों तय किया जा सकता है और बाद में immunofluorescence विश्लेषण या लाइव सेल इमेजिंग अध्ययन के अधीन किया जा सकता है।

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Representative Results

BAG3-GFP प्लाज्मिड cationic लिपिड का उपयोग डीएनए के अभिकर्मक हेला कोशिकाओं में विषम अभिव्यक्ति के साथ जुड़े थे, कुछ असर बहुत उच्च BAG3 स्तर (2A चित्रा) प्रोटीन की मुश्किल से पहचाने जाने स्तर और दूसरों को दिखाने कोशिकाओं। इन कोशिकाओं में प्रोटीन समस्थिति के नुकसान perinuclear समुच्चय (चित्रा 2A, तीर) में BAG3-GFP के संचय के सबूत था। इसके विपरीत, ले जाने के BAG3-GFP adenoviruses के साथ सेल पारगमन अधिक समरूप कम अभिव्यक्ति और BAG3-GFP की सटीक स्थानीयकरण (चित्रा 2 बी, अकेले संक्रमण) का प्रदर्शन किया। उल्लेखनीय है, एडीनोवायरस पारगमन के दौरान cationic लिपिड के अलावा (यानी, adenovirus कणों की अभिकर्मक) काफी है, इसी तरह MOI में सेल प्रति BAG3-GFP अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है, जबकि यह कोशिकाओं (चित्रा 2 बी, Adenofection) के बहुमत में समरूप अभिव्यक्ति रखने की अनुमति दी।

precipitates या liposome आधारित यौगिकों हेला कोशिकाओं में पारगमन अभिकर्मक दक्षता बढ़ाने के लिए। चित्रा 3 जंगली प्रकार BAG3 के साथ एक ठेठ प्रयोग से पता चलता (डब्ल्यूटी) -GFP या एक BAG3 (आईपीवी) -GFP संस्करण असर म्यूटेशन में से एक के लिए बाध्य समाप्त इसकी निगरानी के भागीदारों HSPB8 (चित्रा 3 ए, 3 बी)। HSPB8 7 के स्थिरीकरण में BAG3 के लिए एक भूमिका के अनुरूप, BAG3 का मुंह बंद करने HSPB8, का स्तर जो BAG3 गुम्मट के reintroduction पर सामान्य स्तर पर बहाल किया गया था में एक ~ 50% कमी करने के लिए नेतृत्व किया, लेकिन उत्परिवर्ती के समान स्तर की अभिव्यक्ति से नहीं BAG3 (आईपीवी) -GFP की या अकेले GFP की। इन शर्तों के तहत, BAG3-GFP प्रोटीन उचित ~ भीतर कोशिकाओं के 75-90% स्थानीय थे perinuclear-centrosomal क्षेत्रों (चित्रा -3 सी, 3 डी) में समृद्ध किया जा रहा। इस suggदिलचस्पी है कि adenofection BAG3 की और कोशिकाओं में BAG3-HSPB8 परिसर की गतिशीलता संरक्षित।

HSPB8 और BAG3 विभिन्न proteotoxic जोर दिया है कि यह भी cytoskeletal proteostasis 10 उपद्रव से upregulated रहे हैं। इसलिए chaperones की overexpression संभावित macromolecular सेलुलर morphodynamics नियंत्रित संरचनाओं के विधानसभा disassembly को परेशान कर सकता है। आदेश गैर-जोर दिया की शर्तों के तहत BAG3-HSPB8 की भूमिका का आकलन करने के लिए, यह महत्वपूर्ण था कि सत्यापित करने के प्रोटीन समस्थिति न्यूनतम adenofection प्रक्रिया से परेशान था। कि अंत करने के लिए, गर्मी झटका प्रोटीन परिवार के संरक्षक के स्तरों में बदलाव की निगरानी प्रोटीन समस्थिति की स्थिति का एक अच्छा संकेत है। जैसा कि चित्र 4, पूंजी या द्वारा adenofection में दिखाया गया है liposome आधारित विधियों काफी अंतर्जात HSPB8 और BAG3, या प्रमुख HSP70 / HSPA1 निगरानी प्रणाली की है कि के स्तर में वृद्धि नहीं की थी। इसके विपरीत, ठेठगर्मी सदमे या MG132, एक एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला तरह proteotoxic उपचार, हेला कोशिकाओं में निगरानी-cochaperone प्रोटीन के स्तर में वृद्धि हुई है।

हम तो यह निर्धारित करने की मांग की है, तो actin और ट्यूबिलिन फ्लोरोसेंट जांच (BacMam आरएफपी actin और GFP-αtubulin) की अभिव्यक्ति ड्राइविंग baculoviruses के साथ संयुक्त adenofection प्रक्रिया mitotic सेल गतिशीलता पर नज़र रखने के लिए उपयुक्त था। के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है, एक नियंत्रण siRNA (siCTL) के साथ हेला कोशिकाओं के adenofection mitotic धुरा गतिशीलता (हरा) या औसत समय बँटवारा (चित्रा 5 ए, प्रतिनिधि confocal समय चूक दृश्यों) में खर्च को परेशान नहीं किया। इन असामान्य mitotic घटनाओं दिखा कोशिकाओं के अनुपात में mitotic दोष आम तौर पर कैंसर कोशिका लाइनों में मनाया (~ 30% -40%, चित्रा 5 ब) के स्तर के साथ लाइन में किया गया था। इसके विपरीत, कोशिकाओं अकेले BAG3-विशिष्ट siRNA साथ adenofected (siBAG3) छुट्टी में एक ~ 2 गुना वृद्धि का प्रदर्शनmitotic प्ररूपी दोष है, जो करने के लिए अकेले BAG3-GFP (डब्ल्यूटी) द्वारा नियंत्रण कक्षों में स्तर के पास बहाल कर दी गई है, लेकिन GFP द्वारा नहीं की एल। इस cytoskeletal गतिशीलता है कि में और बँटवारा से बाहर कोशिकाओं के समुचित प्रगति को विनियमित, के रूप में फुच्स एट अल 14 द्वारा दिखाए गए पर BAG3 और उसके संबंधित chaperones के प्रभाव के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए adenofection की उपयुक्तता मान्य।

Adenofection विधि की चंचलता को सत्यापित करने के लिए, हम तो माउस C2C12 myocytes के भेदभाव के दौरान एफ actin के दृश्य सक्षम करने के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित, एफ actin 16 लेबल करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एडीनोवायरस-LifeAct-GFP का उपयोग कर। C2C12 कोशिकाओं Adenofection से पहले एक दिन के लिए अंतर करने के लिए प्रेरित किया गया। पूंजी आधारित adenofection प्रोटोकॉल का प्रयोग, Adenovirus की LifeAct-GFP के उल्लेखनीय कम मात्रा में एक स्तर पर जांच है कि आसानी से विभिन्न का एक महत्वपूर्ण अनुपात में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा खोजा गया था व्यक्त करने के लिए पर्याप्त ntiating myocytes (~ 3-5 pfu / सेल, चित्रा 6)। इस माउस C2C12 कोशिकाओं transduce के लिए 17-19 (250-400 के MOI क्रम में) साहित्य में रिपोर्ट संक्रमण की अत्यधिक उच्च बहुलता को चिह्नित विपरीत में था। इसके अलावा, 7 दिनों के लिए भेदभाव प्रक्रिया की निगरानी के द्वारा, हम की स्थापना की है कि myotube गठन काफी प्रक्रिया से प्रभावित नहीं किया गया था। यह सुझाव दिया है कि myocyte संलयन, एक प्रक्रिया है कि पतले देखते actin गतिशीलता 20 पर निर्भर करता है, LifeAct-GFP के निम्न स्तर (चित्रा 6, दिन 6 और 7 दिन) की अभिव्यक्ति से परेशान नहीं कर रहा था। चूंकि फ्लोरोसेंट मार्कर अभी भी कई दिनों C2C12 कोशिकाओं के adenofection के बाद पता लगाया जा सकता है, हम मानते हैं कि इस विधि C2C12 myogenesis के विभिन्न चरणों में actin गतिशीलता पर chaperones के प्रभाव के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हो जाएगा।

तालिका एक

jove_content "fo: रख-together.within-पेज ="। 1 "> तालिका 1. एडीनोवायरस MOI की गणना दिखाया गया है कि कैसे एक निर्धारित संख्या के संक्रमण के लिए एडीनोवायरस पट्टिका के गठन इकाइयों की संख्या (pfu) आवश्यक गणना करने पर एक उदाहरण है अलग-अलग वायरस titers पर विचार कोशिकाओं की।

आकृति 1
चित्रा 1. एक ठेठ adenofection प्रोटोकॉल की योजना। एक ठेठ प्रयोग के बाद एक कदम प्रोटोकॉल पूंजी अवक्षेप का उपयोग कर (ग्रे में रेखांकित किया है) या एक cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक (पीले रंग में प्रकाश डाला), सेल चढ़ाना, के पारगमन सहित का उपयोग कर प्रोटोकॉल लिए दिखाए जाते हैं siRNA duplexes के adeno- और baculoviruses, अभिकर्मक, और एक डबल thymidine ब्लॉक के साथ सेल तुल्यकालन। दोनों प्रोटोकॉल के लिए घंटों में समय लाइनों आंकड़ा के सही पक्ष पर दिखाए जाते हैं।fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. BAG3-GFP Adenofection का उपयोग कर के समरूप और कुशल अभिव्यक्ति। (ए) हेला कोशिकाओं के प्रतिनिधि epifluorescence छवियों कि BAG3-GFP प्लास्मिड डीएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, perinuclear उच्च अभिव्यक्ति के स्तर पर प्रोटीन का समुच्चय (तीर द्वारा नामित) और सेल की आबादी के भीतर विषम अभिव्यक्ति दिखा। पश्चिमी blots के समग्र सेल की आबादी में अंतर्जात BAG3 स्तर तक BAG3-GFP रिश्तेदार उच्च अभिव्यक्ति दिखाने के लिए, यह दर्शाता है कि प्रोटीन काफी हद तक कुछ कोशिकाओं में overexpressed है। (बी) हेला कोशिकाओं के प्रतिनिधि epifluorescence छवियों है कि केवल transduced किया गया था या विज्ञापन-BAG3-GFP वायरस कणों की बढ़ती मात्रा का उपयोग कर adenofected। इमेजिससमान मापदंडों का उपयोग कर हासिल किया गया और समान पृष्ठभूमि घटाव और तीव्रता के लिए प्रोसेस किया गया; बार:। 50 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. BAG3 के कुशल पछाड़ना और निकट अंतर्जात स्तरों पर BAG3-GFP प्रोटीन के reintroduction। (एबी) हेला कोशिकाओं आरएफपी H2B (ए) या ​​पैतृक हेला कोशिकाओं (बी) को व्यक्त करने का संकेत दिया siRNAs और पुनः संयोजक एडिनोवायरस पूंजी का उपयोग कर के साथ adenofected थे विधि (ए) या ​​अभिकर्मक अभिकर्मक (बी) के रूप में liposome आधारित यौगिकों। प्रकोष्ठों डबल thymidine ब्लॉक विधि द्वारा सिंक्रनाइज़ कर रहे थे और कुल सेल के अर्क रिलीज के दूसरे चरण के दौरान तैयार किए गए थे। Weste आर.एन. blots BAG3 कमी का स्तर (BAG3 अंतर्जात), adenofected BAG3-GFP प्रोटीन का स्तर, और HSPB8 की अंतर्जात स्तर दिखाने; GAPDH स्तर: लोड हो रहा है नियंत्रण। कमी नियंत्रण के अर्क के घटते मात्रा में (नियंत्रण siRNA-siCtl और BAG3-GFP गुम्मट, यानी, आधा, ¼ साथ adenofected) लोड करके> 75% होने का अनुमान था। ध्यान दें कि व्यक्ति BAG3-GFP प्रोटीन जंगली प्रकार BAG3-GFP BAG3 की अंतर्जात स्तर के पास और कहा कि पेश किए गए, लेकिन नहीं BAG3 (आईपीवी) -GFP या GFP अकेले, BAG3 समाप्त कोशिकाओं में HSPB8 स्तरों बहाल। (सीडी) हेला कोशिकाओं है कि पूंजी या cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर संकेत पुनः संयोजक विज्ञापन BAG3-GFP के साथ adenofected किया गया था के प्रतिनिधि epifluorescence छवियों। बार्स: 20 माइक्रोन। (ए) और (सी) में दिखाया प्रतिनिधि परिणाम फुच्स एट अल।, PLoS जेनेट से संशोधित कर रहे हैं। 2015 जन 23; 11 (10): e1005582, डोई: 10.1371 / journal.pgen.1005582 14।Iles / ftp_upload / 54557 / 54557fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Adenofection हेला कोशिकाओं में एक तनाव प्रतिक्रिया प्रेरित नहीं करता नियंत्रण हेला कोशिकाओं से तैयार की कुल सेल के अर्क के पश्चिमी blots। (एनटी: गैर इलाज) या हेला कोशिकाओं अकेले नियंत्रण siRNA (siCtl, कोई एडीनोवायरस), के साथ ट्रांसफ़ेक्ट या siCtl साथ adenofected 44 में गर्मी झटका: और विज्ञापन-GFP या तो पूंजी या cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक, या ठेठ proteotoxic उपचार (एच एस के लिए प्रस्तुत हेला कोशिकाओं से उपयोग करते हुए 60 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटा वसूली के द्वारा पीछा के लिए डिग्री सेल्सियस; MG132: एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला, 16 घंटे के लिए 5 सुक्ष्ममापी), BAG3, HSPB8 की और अन्य तनाव inducible chaperones, अर्थात् HSP70 / HSPA / और HSP27 / HSPB1 के स्तर दिखा; GAPDH: नियंत्रण लोड हो रहा है। ध्यान दें कि जब सभी समर्थक का स्तरGAPDH छोड़कर teins proteotoxic तनाव उपचार पर बढ़ रहे थे, वे adenofection से अपरिवर्तित रहे। प्रोटीन के स्तर रूपों एचएस सेल के अर्क की मात्रा में है कि HSPs में ठेठ बढ़ जाती सहन बदलती लोड द्वारा मूल्यांकन किया गया। (एचएस: 1, आधा, एक चौथाई, ⅛, उदाहरण के लिए, HSP70 जवाब में अधिक से अधिक 8 गुना द्वारा प्रेरित किया गया था तनाव proteotoxic करने के लिए) कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रगति हेला का बँटवारा के माध्यम से कोशिकाओं को काफी Adenofection से परेशान नहीं है। (ए) हेला कोशिकाओं से प्रतिनिधि confocal समय चूक दृश्यों कि एक नियंत्रण siRNA (siCtl) के साथ adenofected गया था एक साथ BacMam- GFP-α ट्यूबिलिन और BacMam साथ -RFP actin और डिस्क confocal microsco कताई द्वारा imaged60 ~ 15 मिनट के अंतराल पर 90 मिनट के लिए PY। सफेद और पीले रंग के तारे धुरी डंडे कि अपेक्षाकृत स्थिर बने रहे की स्थिति को नामित। बार: 10 माइक्रोन। (बी) के साथ या संकेत दिया GFP प्रोटीन के बिना (: गुम्मट अकेले GFP या जंगली प्रकार BAG3 GFP) siCtl या BAG3-विशिष्ट siRNA, साथ adenofected कोशिकाओं की मात्रा। ग्राफ बँटवारा में धुरी कमाल के रूप में परिभाषित और रुक असामान्य बँटवारा +/- या गुणसूत्र misalignment के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत को इंगित करता है। दिखाया साधन +/- एसई कर रहे हैं। (बी) में दिखाया प्रतिनिधि परिणाम फुच्स एट अल।, PLoS जेनेट से ले जाया गया। 2015 जन 23; 11 (10): e1005582, डोई: 10.1371 / journal.pgen.1005582 14। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। कृपया यहां फिल्म पैनल (ए) के साथ जुड़े देखने के लिए क्लिक करें।


चित्रा 6 विज्ञापन LifeAct-GFP और myotube गठन के साथ C2C12 myocytes की Adenofection। कि अंतर करने के लिए प्रेरित किया गया था और प्रसंस्कृत adenofection 1 दिन बाद 5 pfu / LifeAct-GFP के सेल और 45 pfu / सेल का उपयोग के लिए C2C12 कोशिकाओं के प्रतिनिधि epifluorescence छवियों lacZ की। छवियाँ भेदभाव प्रक्रिया (2 दिन, दिन 6 और 7 दिन) के दौरान GFP मार्कर की अभिव्यक्ति दिखा। बार्स:। 20 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ, हम एक विधि को सक्षम करने कमी-बचाव प्रयोगों प्रदर्शन किया जा रहा है, जो सेल जैविक प्रक्रियाओं है कि विशेष रूप से stoichiometry और प्रोटीन परिसरों और macromolecular संरचनाओं की गतिशीलता को प्रभावित करने प्रोटीन की overexpression के प्रति संवेदनशील हैं के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए लागू है का वर्णन किया। Mitotic कोशिका विभाजन पतले देखते सेल morphodynamics कि एक सेल के समग्र संरचना में सबसे नाटकीय और शानदार बदलाव शामिल है का एक चरम उदाहरण है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध BacMam अभिकर्मकों के साथ संयुक्त सेल इमेजिंग के लिए actin और ट्यूबिलिन मार्कर की कम है, लेकिन पता लगाने योग्य मात्रा में लागू करने के लिए adenofection का उपयोग करना, उचित mitotic सेल remodeling के लिए निगरानी जटिल BAG3-HSPB8 के योगदान को स्पष्ट रूप से प्रदर्शन किया जा सकता है। फुच्स एट अल। द्वारा हाल के एक अध्ययन में, हम पता चला है BAG3 की कमी है कि कि एक अक्षमता से जुड़े हुए हैं धुरी उन्मुखीकरण में दोष एक कठोर mitotic actin कोर्टेक्स की स्थापना और actin अमीर इकट्ठा करने के लिए कारण बनता हैत्याग फाइबर 14। उचित धुरी गतिशीलता जंगली प्रकार BAG3 GFP, जो भी कमी BAG3 मुंह बंद करने पर HSPB8 स्तर में देखा सुधारा के reintroduction से बहाल किया जा सकता है। इसका मतलब है कि adenofection एक physiologically प्रासंगिक निगरानी जटिल है कि धुरी गतिशीलता के कार्यात्मक वसूली के साथ संबद्ध की वसूली में सक्षम बनाता है।

कमी-बचाव प्रयोगों के लिए adenofection का उपयोग यह लगभग असंभव एक के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए कर रही है, प्लास्मिड डीएनए अभिकर्मक या nucleofection पर एक फायदा है, जो कुछ प्रकार की कोशिकाओं (यानी, भोजी), 21 में एक तनाव की प्रतिक्रिया का एक शक्तिशाली प्रेरण में परिणाम कर सकते हैं प्रदान करता है यह देखते हुए निगरानी और इसकी शारीरिक भूमिका। दरअसल, हमारे हाथ में, BAG3 प्लास्मिड डीएनए के अभिकर्मक सेल प्रति उच्च अभिव्यक्ति, कुल गठन, और कई प्रकार की कोशिकाओं में सेल apoptosis / अस्तित्व पर प्रभाव (चित्रा 2) के साथ जुड़ा हुआ है। BAG3 पाड़ गतिविधि के साथ एक मॉड्यूलर cochaperone, जो मीटर हैप्र उसके साथी प्रोटीन 9 के आधार पर कई भूमिकाएं निभाते हैं। इसलिए, BAG3 की overexpression पर जटिल stoichiometry के perturbations अवांछनीय प्रमुख नकारात्मक प्रभाव है और विषाक्तता उत्पन्न हो सकता है। उच्च क्षमता पुनः संयोजक एडीनोवायरस दोनों को विभाजित और lentivirus आधारित वैक्टर करने के लिए गैर विभाजित संस्कृति में कोशिकाओं के रूप में यह मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत नहीं है इसके विपरीत, में बड़े जीन की क्षणिक और सुरक्षा के वितरण के लिए एक आदर्श वाहन है जो कुछ सुरक्षा के लिए चिंताओं अभी जारी है। कमी-बचाव प्रयोगों के लिए adenoviruses के इस्तेमाल के संभावित नुकसान यह है कि वे तैयारी है, जो समय लेने वाली हो सकती है बार-बार की आवश्यकता होती है। उन्होंने यह भी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पारगमन प्रभावकारिता के लिए संक्रामक कणों से सावधान अनुमापन पर भरोसा करते हैं।

नाम से जाना जाता BAG3 कार्यात्मक डोमेन के योगदान स्क्रीन करने के लिए adenofection उपयोग करना, हम पहला सबूत है, हमारे ज्ञान, सामान्य ऑपरेशन में प्राप्त एक HSPB8 निर्भर BAG3 समारोह के अस्तित्व के लिएकोशिकाओं है कि HSP70 / HSPA1 निगरानी प्रणाली के साथ अपनी बातचीत की आवश्यकता नहीं है विभाजित करने की। Adenofection के रूप में यहाँ प्रस्तुत आंकड़ों ने सुझाव दिया myotubes में myocyte भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान एफ actin ट्रैक करने के लिए लागू किया जाना चाहिए। इस प्रकार हमारे विधि सेल morphodynamics कि परियोजनाओं जहां ब्याज की एक जीन की संरचना समारोह विश्लेषण चलाया जा रहा है की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोगी होना चाहिए पर न्यूनतम प्रभाव के साथ siRNA आधारित कमी-बचाव प्रयोगों के लिए एक बहुमुखी और कुशल प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

आदेश वायरस कणों की न्यूनतम राशि के साथ कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक पारगमन को प्राप्त करने में cationic यौगिकों-लिपिड शोषण इस विधि के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि यह सेल प्रति exogenous प्रोटीन के स्तर को नियंत्रित करने के लिए एक बड़ा खिड़की प्रदान करता है, हमें विश्वास है कि यह आगे कहा कि सेल एडीनोवायरस बाध्यकारी-प्रवेश, जो एपी के प्रभाव को कम करना चाहिए परिणाम से संकेत पारगमन मार्ग पर संभावित दुष्प्रभावों को कम करने की अनुमति देता है किमॉर्फ़ोजेनेटिक रास्ते पर ब्याज की rotein।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विभिन्न अभिकर्मकों एडीनोवायरस पारगमन दक्षता बढ़ाने के लिए ऐसी कार रिसेप्टर बूस्टर के रूप में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इस तरह अभिकर्मकों महंगे हैं, तथापि, और वायरस के लिए एक तरीका है कि कार रिसेप्टर है, जो जैसा कि ऊपर कहा सेल आकार और आसंजन के साथ जुड़े रास्ते संकेतन को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है की आवश्यकता है में कोशिकाओं में बाध्यकारी प्रविष्टि को बढ़ावा देने की उम्मीद है। जबकि पूंजी एक कार स्वतंत्र मार्ग के माध्यम से एडीनोवायरस प्रविष्टि शक्ति प्रदान करने के लिए एक साधन के रूप में धनायनित लिपिड की तुलना में सस्ता है, यह भी कुछ सेल लाइनों के लिए अधिक विषैला होता है। हम सेल इस्तेमाल लाइन और ब्याज की जैविक readout के आधार पर बनाम cationic लिपिड अभिकर्मक पूंजी के बीच चुनाव उन्मुख करने के लिए, एक खाली adenofection की पूर्व परीक्षण सलाह देते हैं।

जीनोम संपादन के नए जैव प्रौद्योगिकी उपकरणों के साथ एक साथ, शाही सेना के हस्तक्षेप के आधार पर इस तरह के यहाँ वर्णित एक के रूप में पछाड़ना-बचाव दृष्टिकोण एक की गिरफ्तारी की पेशकश करते हैंकोशिकाओं है, जो अब बेहतर विशिष्ट अनुप्रयोगों 3 के आधार पर जांचकर्ताओं द्वारा चुना जा सकता है में जीन समारोह को उजागर करने के लिए शक्तिशाली उपकरणों में से आणविक रे। हम मानते हैं कि adenofection संरचना समारोह कई सेलुलर पृष्ठभूमि में ब्याज की एक प्रोटीन के योगदान के विश्लेषण के लिए hypomorphic knockdowns बनाने के लिए एक अपेक्षाकृत तेज और सरल प्रणाली प्रदान करता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 Mouse Myoblasts ATCC CRL-1772
Adenovirus custom design Welgen Custom design
Calcium Chloride Fisher Scientific C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose Thermo Fisher 11965-092
EDTA Sigma E5134
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher 12483-020
Fibronectin Sigma F1141
Glass bottom dishes, 35 mm MatTek Corperation P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada Klebig C et al. 2009
HEPES Fisher Scientific BP310-1
Horse Serum, New Zealand Thermo Fisher 16050-122
KCl Fisher Scientific BP366-500
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher 13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha Wisent 310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides Thermo Fisher 12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red Thermo Fisher 41061-029
Na2HPO4 Biobasic S0404
NaCl Fisher Scientific BP358-10
OptiMEM Thermo Fisher 11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 IBIDI 60121
siRNA duplexes Dharmacon Custom design
Thymidine Sigma T9250
Trypsine 2.5% Thermo Fisher 15090-046

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 115 Adenovirus सेल पारगमन आरएनए हस्तक्षेप सेल अभिकर्मक लाइव सेल इमेजिंग cytoskeletal गतिशीलता LifeAct GFP tubulin आरएफपी बँटवारा मांसपेशियों में सेल भेदभाव हेला कोशिकाओं कोशिकाओं C2C12
Adenofection: रिक्तीकरण बचाव प्रयोगों द्वारा सेलुलर Morphodynamics में आण्विक chaperones की भूमिका का अध्ययन के लिए एक विधि
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Fuchs, M., Boulanger, M. C.,… More

Fuchs, M., Boulanger, M. C., Lambert, H., Landry, J., Lavoie, J. N. Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments. J. Vis. Exp. (115), e54557, doi:10.3791/54557 (2016).

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