Abstract
Antikroppar mot neuraminidas (NA), den näst mest förekommande ytprotein på influensavirus, bidrar mot skydd mot influensa. Traditionella metoder för att mäta NA inhibering (NI) antikroppstitrar är inte praktiska för rutinmässig serologi. Detta protokoll beskriver enzymbunden lektin assay (ELLA), ett praktiskt alternativ metod för att mäta NI titrar som utförs i 96-brunnars plattor belagda med ett stort glykoprotein substrat, fetuin. NA klyver terminal sialinsyror från fetuin, utsätta den näst sista socker, galaktos. Jordnötsagglutinin (PNA) är ett lektin med specificitet för galaktos och därför omfattningen av desialylering kan kvantifieras med användning av en PNA-pepparrotsperoxidaskonjugat, följt av tillsats av ett kromogent peroxidassubstrat. Den optiska densiteten som mäts är proportionell till NA-aktivitet. För att mäta NI antikroppstitrar är serieutspädningar av sera inkuberas vid 37 ° CO / N på fetuin-belagda plattor med ett fast belopp of NA. Det reciproka värdet av den högsta serumspädning som resulterar i ≥50% inhibering av NA-aktivitet betecknas som NI-antikroppstiter. Ella ger en praktisk format för rutin utvärdering av svaren mänskliga antikropps efter influensainfektion eller vaccination.
Introduction
Neuraminidas (NA) är ett glykoprotein uttryckt på ytan av influensavirioner. Dess enzymaktivitet är nödvändig för frisättningen av nybildade viruspartiklar från infekterade celler 1,2. Antikroppar som hämmar NA aktivitet minskar virustitrar och sjukdomssymptom i djurmodeller 3 och korrelerar med resistens mot sjukdomar hos människor 4. En ökning av NA-hämning (NI) titrar efter vaccination kan därför tjäna en indikator på vaccinets effektivitet, men många tidigare influensa immunogenicitetsstudier inte innehöll denna effekt eftersom de traditionella analysen för att mäta NI antikroppstitrar är opraktiskt för rutinmässig serologi.
Den traditionella metoden för att mäta NI titrar är baserad på kvantifiering av mängden av sialinsyra som klyvs från glykokonjugat av NA 1. Denna metod, som ofta kallas syran (TBA) -metoden thiobarbituric, använder farliga kemikalier för att omvandla sialic acid till en kromofor som kan kvantifieras genom spektrometri. Analysen är inte lämplig för att testa ett stort antal prover, eftersom individuella glas rör används, vilket gör analysen besvärligt. Miniatyrisering av analysen till en 96 brunnars plattor ger en mer praktiskt format 5 emellertid denna analys kräver fortfarande användningen av giftiga kemikalier och därför är inte idealisk.
En alternativ analys för att mäta NI antikroppstitrar utvecklades av Lambré et al. 6. Denna analys kvantifierar enzymaktivitet genom att mäta mängden av den näst sista socker av glykoproteiner, galaktos, som exponeras när sialinsyra släpps av NA. Eftersom jordnöt-agglutinin (PNA) binder specifikt till galaktos, kan en PNA-pepparrotsperoxidas (HRPO) -konjugat användas för att erhålla en kolorimetrisk avläsning. Den optiska densiteten som mäts är alltså proportionellt till NA-aktivitet i provet. NI titrar mäts genom att bestämma den högsta spädningenav serum som inhiberar åtminstone 50% av NA-aktivitet. Denna enzymkopplad lektin assay (ELLA) utförs i 96-brunnars plattor belagda med fetuin, ett starkt glykosylerat serumprotein, som substrat för NA.
En viktig faktor för analyser som mäter NI titer, är källan till NA. Detta beror på att serum från vaccinerade eller infekterade individer innehåller antikroppar mot hemagglutinin (HA) samt antikroppar mot NA. Antikroppar som binder till HA kan störa NA-aktivitet och därför, för att undvika icke-specifik inhibering av HA-specifika antikroppar, renade NA eller helvirus innehållande ett antigeniskt inkompatibla HA bör användas i analysen. Dessa virus kan alstras genom klassiska reassortment eller genom omvänd genetik; Målet är att rädda ett virus som innehåller HA av en subtyp som inte är relaterad till målet stammen, och NA av viruset som studeras. Analysen beskrivs i denna artikel använder influensa A-virus som genereras av reverse genetik att innehålla HA av subtyp H6 och riktade NA från influensa A-virus, subtyp H1N1 och H3N2 5.
Resultat som genereras av Ella och miniatyriserade TBA analyser visar dessa metoder är jämförbara med liknande subtyp specificitet och sensitivitet 7. ELLA inte kräver användning av farliga kemikalier och är därför den lämpligaste metoden för att mäta NI titer. Det är lätt att utföra, med bara några få steg (Figur 1): prover späds och överförs till en fetuin-belagda plattan till vilket virus (källan till NA) tillsätts. Plattan inkuberas O / N och tvättades före tillsats av PNA-HRPO. Efter en 2 timmars inkubering tvättas plattan och peroxidassubstrat tillsätts; färgreaktionen stoppas och slutligen den optiska densiteten mäts och det reciproka värdet av provspädning som resulterade i minst 50% inhibering av NA aktivitet rapporteras som den 50% slutpunkten titer. En intra-laboratoriestudie för att utvärdera reproducibility av Ella, visade att platta till platta variationen är minimal och operatör till operatör repeterbarhet resulterade i högst två-faldiga skillnader i titer 7. En efterföljande interlaboratoriestudie av ELLA variabilitet visade att analysen har god reproducerbarhet när de utförs i olika laboratorier och införandet av ett standard kan ytterligare minska variationen i resultat 8. Ella är lämplig för mätning av NI antikroppstitrar i paneler serum från prekliniska och kliniska influensavaccin studier 7 och kan även användas för att utvärdera antigena skillnader mellan kontoren av influensavirus 9.
Protocol
Alla levande reassortant virus med fågel komponenter måste hanteras med skyddsnivå 2 (BSL2) Förbättrad praxis i ett laboratorium som godkänts för användning av Förenta staternas Department of Agriculture (USDA) och den institutionella biosäkerhet kommittén.
1. Beredning av reagens och utgångsmaterial
Obs: Se materialtabellen för att erhålla källan till alla reagenser.
- Fetuin-belagda plattor
- Förbered beläggningsbuffert genom att blanda 10 ml 10x beläggningsbuffert med 90 ml avjoniserat H2O
- Bered en stamlösning av fetuin vid 25 mg / ml i 1x beläggningsbuffert och förvara i 500 mikroliter alikvoter vid -20 ° C.
- Bered en arbetslösning av fetuin (25 pg / ml) omedelbart före beläggningsplattor genom att späda stamlösningen 1000-faldigt i 1x beläggningsbuffert.
- Använd en flerkanalspipett att fördela 100 pl av arbetslösning av fetuin i all brunnar i en 96-brunnsplatta som har hög proteinbindande kapacitet.
- Täck varje platta med en plattförslutning sedan stapla plattorna i grupper om 10 och slå in dem i folie.
- Placera plattorna i kylskåp (2-8 ° C) under åtminstone 18 h före utförande av en analys.
Notera: Plattor kan beläggas i förväg och lagras tillsammans med beläggningslösningen vid 2-8 ° C i upp till 2 månader.
- Spädningsmedel
- För att framställa spädningsmedlet för att göra virus och provspädningar (2- (N morfolino) etansulfonsyra (MES), pH 6,5, 20 mM CaCl2, 1% bovint serumalbumin (BSA) och 0,5% Tween 20), blanda 94,2 ml 1X MES, pH 6,5 med 2 ml CaCl2 (10 mg / ml), 3,3 ml 30% BSA och 0,5 ml Tween 20.
- Att bereda spädningsmedel för PNA-HRPO (MES, pH 6,5 med 20 mM CaCl2 och 1% BSA), blanda 94,7 ml 1x MES, pH 6,5 med 2 ml CaCl2 (10 mg / ml), och 3,3 ml 30% BSA .
- Neuraminidas (NA)
Obs: H6Nx virus reassortants (dessa har HA av H6 subtyp och NA av intresse), alstras följande publicerade metoder 5,10. Begär flaskor med inaktiv reassortant virus från en medarbetare om de inte är tillgängliga internt. Vid användning av inaktiverat virus, bekräftar att preparatet är lämpligt för användning i ELLA genom demonstrationen att inaktiveringsprocessen inte har en betydande inverkan på NA-aktivitet.- Kultur ett lager av H6Nx virus i embryonerade hönsägg 11 och lagra 0,5 ml alikvoter av ren allantoisvätska vid -80 ° C.
- Använd en ny alikvot av virus för varje analys. Får ej frysas och tinas alikvoter.
- Serumprover och kontroller
- Värme inaktivera alla sera (proverna t.ex. före och efter vaccination sera, liksom kontroller, t.ex. prov med känd NI titer) i ett vattenbad vid 56 ° C under 45-60 min. Lagra sera vid -20 till -70 ° C före eller efter värmebehandlingen. Om samples ska testas upprepade gånger, göra flera portioner före frysning så att provet inte upprepat fryses och tinas.
- Använd Ella att mäta NI titrar av humana sera som är tillgängliga i rimlig mängd (> 5 ml) för att identifiera åtminstone en med låg titer och en annan med en hög titer. Lagra 100 | il alikvoter som ≤-20 ° C, så att samma prov kan användas som en kontroll i många analyser i syfte att spåra analysens prestanda.
- Jordnötsagglutinin (PNA) -Horseradish peroxidas (HRPO)
- Förbered PNA-HRPO utspädnings (MES, pH 6,5 med CaCl2 och 1% BSA).
- Förbered en PNA-HRPO stamlösning genom att lösa 1 mg PNA-HRPO i 1 ml spädningsvätska. Lagra 20-200 l alikvoter vid -20 ° C.
- Innan du använder en ny PNA-HRPO mycket, test 1: 500, 1: 750, 1: 1000 och 1: 2000 utspädningar av denna reagens för att identifiera det belopp som resulterar i maximal OD med den positiva kontrollen (virus endast) och en bakgrund ( inget virus) thatt är <10% av den positiva signalen.
- Gör fyrfaldiga virusspäd som beskrivs i avsnitt 2.1.
- Överför späd till en fetuin-belagd platta som beskrivs i avsnitt 2.2 och inkubera plattan vid 37 ° C.
- Tvätta plattan 16-18 h senare och tillsätt 1: 500, 1: 750, 1: 1000 och 1: 2000 spädningar av PNA-HRPO (100 | j, l / brunn) för att duplicera rader av plattan.
- Slutföra analysen som beskrivs i steg 2.3.4 till 2.3.9.
- Granska data för att välja den utspädning som resulterade i en maximal signal som är> 10 gånger bakgrunden.
- Omedelbart före användning, förbereda en optimal utspädning av PNA-HRPO identifierats i 1.5.3.
- Förbereda en stor volym av tvättbuffert (0,01 M fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), pH 7,4, 0,05% Tween 20 (PBS-T)). Förvara vid RT.
- Förbered peroxidassubstrat (o-fenylendiamin (OPD)): Obs: alternativa peroxidas substrat såsom 3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin (TMB), kan användas för
- Framställa fosfat-citratbuffert genom upplösning en kapsel i 100 ml dH 2 O på analysdagen.
- Lös en OPD tablett (10 mg) i 20 ml fosfat-citratbuffert omedelbart före användning.
- Förbered stopplösning (1 NH 2 SO 4): lägg 27,2 ml lager 98% H 2 SO 4-973 ml dH 2 O. Blanda och sedan lagra vid RT.
2. Fastställande av mängden NA att använda i ELLA
- Förbereda Virusspädningar i en platta med 96 brunnar
- Fördela 120 ul provspädningsmedel (avsnitt 1.2) i kolumner 1-11 av utspädningsplattan.
- Kolumn 1, lägga till ytterligare 96 pl provspädningsmedel.
- Tina och sedan virvel flaskan av virus innan du lägger 24 l till dubbla brunnar i kolumn 1. Detta ger en 1:10 spädning av virus.
- Gör serie 2-faldiga utspädningar av virus i prov spädningsmedel, genom att överföra120 pl från en brunn till nästa med hjälp av rena pipettspetsar för varje utspädning.
- Överföra Virusspädningar till en Fetuin-belagd platta
- Tvätta fetuin-belagda plattan 3 gånger med PBS-T (avsnitt 1.6) och sedan blot varje platta mot ett absorberande pappershandduk för att avlägsna eventuellt överskott av tvättbuffert.
- Tillsätt 50 pl provspädningsmedel (avsnitt 1.2.1) till varje brunn i kolumnerna 1-11 i fetuin-belagda plattan.
- Tillsätt 100 pl av provspädningsmedel till kolonn 12 (dessa brunnar är den negativa kontrollen).
- Överför 50 ul av utspätt virus från kolumnerna 1-11 i utspädningsplattan till motsvarande brunnar i fetuin-belagda plattan.
- Täck plattan med en plattförslutning och sedan placera den i en fuktad inkubator vid 37 ° C.
- Anteckna den tidpunkt då återstående stegen kommer att utföras (16-18 timmar senare).
- Slutföra NA Fastställande
- När inkubationen är fullständig (16-18 h), överför denplattan till bänken och ta bort plattan sealer.
- Tvätta plattan 6 gånger med PBS-T (avsnitt 1.7) och sedan vända och klapp på absorberande hushållspapper för att säkerställa all vätska har avlägsnats från brunnarna.
- Tillsätt 100 | il / brunn PNA-HRPO-lösning (vid utspädning bestämdes i 1.5.3) till alla brunnar och inkubera plattan under 2 h vid RT.
- Mindre än 15 minuter innan inkubationstiden är till slut, förbereda OPD lösning som beskrivs i avsnitt 1.7.
- Tvätta provplattorna 3 gånger för att avlägsna PNA-HRPO och torka innan du lägger 100 pl av OPD-substrat till varje brunn.
- Inkubera plattan under exakt 10 min vid RT.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 100 | il / brunn av 1 N svavelsyra.
- Använda en plattläsare för att mäta den optiska densiteten (OD) vid 490 nm för 0,1 sek.
- Spara och exportera alla datafiler.
- Välj Virus Späd som kommer att användas för serologi
- Rita en graf som plottar OD 490 nm (dvs linjära område av kurvan).
- Välj virusspädning som ger ungefär 90% av den maximala signalen och ligger inom det linjära området. Bekräfta att OD vid den valda utspädningen är åtminstone 10-faldigt högre än bakgrundssignalen. Använda den valda virusspädning för alla analyser som använder just denna virusstam.
Obs! Du kan mäta NA aktiviteten av viruset och använda ~ 15-20 ^ U NA aktivitet / ml i ELLA.
3. Enzymkopplad Lektin Assay
Obs: Figur 2 shows installationen av utspädnings och analysplattorna.
- Gör provspäd
- Placera värmeinaktive prover på is.
Obs: 8 sera kan spädas i varje platta. - För en uppsättning upp med utspädningar med början vid 1:10 över plattan, tillsätt 120 pl provspädningsmedel till alla brunnar i kolumnerna 3-11.
- Kolumn 2, tillsätt 216 pl provspädningsmedel och 24 pl av varje prov. Blanda provet i brunnen genom att pipettera upp och ner 3 gånger och sedan överföra 120 | il till nästa kolumn.
- Efter att ha ändrat pipettspetsar, blanda innehållet i brunnen genom att pipettera upp och ner och överför sedan 120 | il till nästa kolumn.
- Upprepa steg 3.1.4 tills provet har överförts till kolumn 11 och de återstående 120 ul kasseras.
- Placera värmeinaktive prover på is.
- Lägg Prover och virus till Fetuin belagda Plate
- Tina en flaska med virus, virvel och resuspendera viruset i utspädningsmedlet (avsnitt 1.2) vid utspädningen som valdes i steg 2.4,2. Förbereda minst 5 ml virus för varje analysplatta. Hålla den utspädda viruset på is tills de Plattorna tvättas och serumprover har lagts till plattan.
- Besluta om antalet fetuin belagda plattor som behövs för analysen (i allmänhet gäller fyra sera per platta). Tvätta fetuin-belagda plattan 3 gånger med PBS-T och sedan invertera varje platta och blot mot ett absorberande pappershandduk för att avlägsna överskott av tvättbuffert.
- Använd en flerkanalspipett att överföra 50 fil av varje serumkontroll eller provspäd från utspädningsplattan i duplikatbrunnar i kolumnerna 2-11.
- Tillsätt 50 pl av utspätt virus till alla brunnar med undantag för negativ kontroll (kolumn 12).
- Tillsätt 50 pl av provspädningsmedel till brunnar i kolumn 1 och tillsätt 100 pl provspädningsmedel till kolumn 12.
- Täck brunnarna med en plattförslutning och blanda sedan genom att försiktigt knacka på plattans sidor eller utsläppande på en plattskakanordning vid måttlig hastighet under 10 sek.
- Placera plattan i en humidified inkubator vid 37 ° C under 16-18 h.
- Lägg PNA-HRPO och slutföra analysen som beskrivs i avsnitt 2.3
4. Dataanalys
- Bestämma giltigheten av analysresultaten
- Kontrollera att bakgrundsvärdena (ingen virus) är mindre än 10% av den positiva kontrollen (virus och ingen serum).
- Kontrollera att titrar av kontrollsera springa i olika analyser med samma villkor inom två gånger av median titer.
- Bekräfta att OD mätningar av kontrollbrunnar överensstämmer (≤20% annorlunda) och att OD mätningar av dubbla provbrunnar överensstämmer (≤10% annorlunda).
- Bestämma orsaken till ogiltiga resultat och upprepa analysen om kriterierna i 4.1.1, 4.1.2 eller 4.1.3, inte är uppfyllda. Överväga de faktorer som presenteras i tabell 1 när man försöker att felsöka.
- Tilldela en 50% slutpunkten titer
- För varje analysplatta, subtract den genomsnittliga bakgrunden (ingen antigen sattes till brunnar) från alla avläsningar.
- Beräkna procent inhibering vid varje serumspädning med hjälp av formeln: 100 x (OD virus endast kontroll - OD testprov) / bara OD viruskontroll.
- Identifiera den högsta spädning som resulterade i minst 50% inhibering av den maximala signalen.
- Rapportera reciproka värdet av denna utspädning som 50% slutpunkten titer.
Obs: Om 50% inhibition inte uppnåddes vid någon utspädning, är titern mindre än den första utspädningen testas, t.ex., <10 när 01:10 är den första spädningen testades.
- Beräkna den 50% inhiberande koncentration (IC50)
- Använda fyra parameter logistiska regressioner för att bestämma IC 50 titer på följande sätt: subtrahera den genomsnittliga bakgrunden från alla avläsningar och sedan överföra resultatet till ett program som utför regressionsanalys.
- Använda icke-linjär regression, med den maximala uppsättningtill viruset endast styra och den minsta satt till noll, för att bestämma den utspädning som motsvarar exakt 50% inhibering.
- Rapportera reciproka värdet av denna utspädning som IC 50 titer.
Representative Results
Analysen som presenteras i detta manuskript visas schematiskt i figur 1, fig. 2 visar den 96 brunnars platta layout, och indikerar att seriespädningar av serumproverna framställes i en utspädningsplatta innan de överförs till fetuin-belagda plattan. En kritisk parameter för analysen är mängden neuraminidas som används i analysen; detta bestäms genom titrering av reassortant virus. Exempel på H6N1 och H6N2 virus titreringar är visade i fig 3. Vid 1:10, 1:20 och 1:40 spädningar av H6N1, den optiska densiteten var liknande, vilket indikerar att de villkor som var sådana att en maximal avläsning erhölls. Vid en 1:80 utspädning avläsningen var cirka 90% av den maximala och därför utspädning av virus användes i efterföljande analyser. Exempel på serum titreringar är visade i fig 4. Figuren visar ett humant serumprov som var tikoncentrerat mot H6N1 och H6N2 virus. Varje datapunkt visar den procentuella inhiberingen av NA-aktivitet som uppnåddes genom seriespädningar av serum; den första serumspädningen i H6N1-analysen var 1:80; den första spädningen av serum i H6N2 analysen var 5. Eftersom den högsta utspädningen som resulterar i ≥50% hämning är NI antikroppstiter, titern av serum visas i detta exempel är 640 mot NA på NC / 99 (N1) och 160 mot NA på WI / 05 (N2).
. Figur 1. En schematisk bild av Ella protokollet (A) Fastställande av utspädningen av antigen (virus) att använda i analysen (steg 2 i protokollet): Virus späd läggs till en fetuin belagd platta och NA aktiviteten mäts genom kvantifiera terminala galaktosrester genom bindning av PNA-HRPO som beskrivs i steg 2,3 i protokollet; (B g>) Fastställande av serum NI antikroppstitrar (steg 3 i protokollet). Prover späds ut och överförs sedan till en fetuin-belagd platta där virus tillsätts. Plattan inkuberas O / N innan du lägger PNA-HRPO och slutföra de åtgärder som krävs för att generera en färgreaktion. Slutligen är färgreaktionen stoppas och den optiska densiteten mäts. Den ömsesidiga av provspädning som resulterar i åtminstone 50% inhibering av NA-aktivitet anges som 50% slutpunkten titer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Diagram för att visa ELLA plattan inrättas. Serieutspädningar av serumprover görs i en utspädningsplatta och överfördes sedan till en fetuin-belagd platta. 3fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Exempel på H6N1 och H6N2 virus titreringar. Serieutspädningar av H6N1 BR / 07 (NA A / Brisbane / 59/2007 (H1N1) visas i blått symboler) och H6N2 UR / 07 (NA av A / Uruguay / 716 / 2007 (H3N2) som visas i röda symboler) inkuberades under 18 h i fetuin-belagda plattor och reaktiviteten med PNA-HRPO bestämdes såsom beskrivits. Genomsnitt OD 490 nm av 2 brunnar är avsatt mot det reciproka värdet av den virusutspädning. Utspädningen av H6N1 ut för användning i ELLA var 1:80 och spädningen av H6N2 valda var 01:40 eftersom dessa utspädningar resulterade i cirka 90% av den maximala optiska densiteten och var inom det linjära området.3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Titrering av serum mot NA N1 (röda symboler) och N2 (blå symboler) subtyper. NA hämnings titrar mättes mot reassortant virus H6N1 NC / 99 (innehåller NA A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) ) och H6N2 WI / 05 (innehåller NA A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). Procent enzymhämning för seriespädningar av serum visas med den streckade horisontella linjen indikerar 50% inhibering. NA hämnings titrar mot NAS i A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) och A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) var 2 9,3 (640) och 2 7,3 ( 160), respektive. klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Problem | Möjliga orsaker) | Lösning |
| Svag signal eller ingen platå nås på virustitrering | i) låg NA enzymaktivitet ii) -virus lager inte lagras under optimala förhållanden | i) att bekräfta att den spädningsmedlet har pH-värdet som är optimal för NA-aktivitet; om pH är optimal, förbereda ett nytt virus lager eller koncentrera virus ii) återföds och delprov lager; snap-frysa flaskor på torris före lagring vid -80 ° C |
| Svag eller ingen färg på positiva cellkontrollbrunnar | i) Virus utspädning felaktigt tilldelade ii) Vial till flaskan variation i frysta virus portioner iii) PNA- HRPO denatureras eller utspädd för mycket iv) OPD felaktigt beredd | jag); Upprepa virustitrering ii) Titrera flera flaskor från samma parti att säkerställa att det inte finns någon variation. Om väsentlig variabilitet förbereda färska alikvoter iii) Använd optimal virusutspädning att retitrate PNA- HRPO iv) Upprepa med färsk beredning av OPD |
| Svag eller ingen inhibition av positiv kontrollsera | i) För mycket virus som används i analysen ii) Serum försämrades | i) Upprepa virustitrering ii) Skaffa nya antisera Kontrollera lagringsförhållanden |
| Hämning av negativa kontrollsera | i) Otillräcklig värmebehandling av serum ii) För lite virus som används i analysen | i) Upprepa värmeinaktivering av serum ii) Upprepa virustitrering |
| hög bakgrund | i) Eventuell kontaminering av plattor ii) PNA- HRPO koncentration för hög / för låg | i) Upprepa med användning av nyligen belagda plattor ii) Titrera PNA-HRPO att identifiera rätt utspädning att använda |
| Virustitrering visar uppenbar hämning av NA-aktivitet vid låga späd | i) allantoisvätska kan innehålla substrat för NA | ii) Använd virus som har pellete genom en sackaroskudde |
Tabell 1. grundorsaksanalys av analyser som inte uppfyller prestandakriterier. Denna tabell ger möjliga orsaker och lösningar på problem som kan uppstå när du utför Ella.
Discussion
Enzyme-linked lektin-analysen är en praktisk metod för att mäta NI antikroppstitrarna i sera. Även ELLA beskrevs av Lambre et al., 1990, har sitt godkännande som standard serologisk analys varit senare, med många laboratorier som utför analysen för att mäta NI titrar av kliniska prover 12-16 antikroppar. Vissa modifieringar kan göras för att protokollsteg utan en stor inverkan på de NI titrar som mäts. Till exempel kan PBS användas som spädningsmedel, men det är mycket bra att jämföra virus titreringskurvor i den rekommenderade buffert (MES, pH 6,5) och PBS innan ett beslut fattas, eftersom vissa NA subtyper har minskat avsevärt enzymaktivitet vid pH> 7,0. När det optimala pH-värdet inte används, kan den maximala signalen av virus minskas, vilket resulterar i användningen av en överdriven mängd av antigen (dvs, virus) i analysen; under dessa förhållanden kan analysen ha reducerad känslighet.
några ingenn-specifik hämning observeras när obehandlat sera testas i ELLA. Detta avlägsnas genom värmebehandling (56 ° C under 45 min), vilket indikerar närvaron av termolabila p-hämmare. Andra icke-specifika inhibitorer (α och γ-klass) av influensa HA har beskrivits, särskilt i förhållande till H3N2-virus hemagglutination och smittsamhet. Faktum är att icke-specifik hämning också observerats i ELLA när H3N2 virus används som källa för NA; denna inhibering avlägsnas genom behandling av serumproverna med en liten mängd sialidas 9.
Liksom för andra serologiska tester bör negativa och positiva kontroller inkluderas i varje analys för att tillhandahålla ett medel för att utvärdera analysprestanda. När analysen inte har uppfyllt acceptanskriterier, ska orsaken identifieras. Tabell 1 innehåller en lista över potentiella steg i analysen som kan tas upp för att felsöka problem.
Den ELLA-protokollet provIDed i denna rapport använder reassortant virus som innehåller HA härrör från en fågelviruset, som källa till NA. Detta utgör en begränsning att utföra analysen, eftersom ett tillstånd som krävs för att arbeta med lågpatogena fågelvirus. H6Nx reassortant virus kan delas mellan laboratorier efter att de har inaktiverats. Därför analysen kan utföras genom samarbete när laboratorium genererar reassortant virus har visat att inaktiveringen är slutförd och förberedelser har behållit sin NA-aktivitet. Begränsningen att använda H6Nx reassortant virus kan övervinnas genom användning av icke-smittkällor NA. Till exempel har vissa laboratorier används renat rekombinant NA 17, medan andra har använt viruslika partiklar (VLP) 15. Varken rekombinant NA eller VLP är lätt tillgängliga och därför fortsätter vi att använda influensavirus med en antigen-inkompatibla avian HA.
den traditionellametod för att mäta NI antikroppstitrar är inte praktiskt av flera skäl; de flesta oro är de skadliga kemikalier som behövs för att producera en färgreaktion. Dessutom är stora volymer av prov som krävs och analysen är besvärlig att utföra. I motsats till detta är ELLA enkel att utföra och är i ett format som gör att titrering av ett rimligt antal prover. Data från studier som undersökt ELLA variation visar att analys ger reproducerbara resultat 7,8. Ella har därför gjort rutinmätning av titer möjliga NI antikropp, och det förväntas att det kommer att användas oftare av laboratorier som utför serologiska studier.
Det finns flera viktiga steg som måste beaktas när man utför Ella. För det första måste icke-specifika hämmare av NA-aktivitet tas bort. Dessa inhibitorer är i allmänhet termolabila och förstörs genom värmebehandling vid 56 ° C under 45 minuter. Värmebehandling är tillräcklig för att avlägsna icke-specific inhibitorer från prover när H6 reassortant virus används som källa för NA, men när H3N2-virus används i ELLA, serumfaktorer som binder till hemagglutinin interfererar också med ELLA och bör tas bort genom behandling med en liten mängd sialidas före värmebehandling 9. För det andra, en överdriven mängd av antigen, det vill säga, reassortant H6Nx virus, bör inte användas eftersom detta minskar analysens känslighet. Noggrann titrering av virus är därför ett viktigt steg; mängden antigen som används i varje analys måste ge en signal som är väl över bakgrunden, och måste vara inom det linjära området av titreringskurvan, dvs måste signalen (optisk densitet) vara proportionell mot virusutspädning.
Förutom den rutinmässiga serologi kan ELLA användas för att utvärdera antigena skillnader mellan NAS i säsongsinfluensavirus. Denna information kan vara till stor hjälp när man väljer virusstammar för inkludering ens vaccinkandidater och kommer att underlätta en större förståelse för immun tryck som resulterar i antigendrift av NA. Dessutom kan antigen analys NAS från svin eller aviära influensavirus ge viktig information för att avgöra pandemin potential av nya stammar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating buffer | KPL | 50-84-01 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| 5x MES, pH 6.5 | KD-Medical | PBS-0134 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| 30% BSA | Sigma | A8327 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Lectin PNA-HRPO | Sigma | L7759 | |
| PBS-T | Sigma | P3563-10PAK | |
| o-Phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| Phosphate-citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| Sulfuric acid | Sigma | 258105 | |
| 96-well Maxisorp plates | NUNC | 439454 | |
| 96-well round bottom well plates | NUNC | 267245 | |
| Plate sealers | Thermo Scientific | 14-245-192B | |
| Chicken eggs | Charles River Laboratories | 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs | |
| Multichannel pipette | Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf | 8 or 12 channel manual pipette 50-250 µl volume | |
| Pipette tips | Depends on pipettor brand | Depends on pipettor brand | |
| Plate reader, with 490 nm filter | Perkin Elmer | Victor V | |
| Water bath set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models | |
| Water bath set to 56 °C | Variety of suppliers | Variety of models | |
| Refrigerator set to 4 °C | Variety of suppliers | Variety of models | |
| Incubator set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
References
- Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase. J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).
- Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus. J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).
- Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice. J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).
- Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man. N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).
- Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens. Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).
- Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).
- Couzens, L., et al. An optimized enzyme-linked lectin assay to measure influenza A virus neuraminidase inhibition antibody titers in human sera. J Virol Methods. 210C, 7-14 (2014).
- Eichelberger, M. C., et al. Comparability of neuraminidase inhibition antibody titers measured by enzyme-linked lectin assay (ELLA) for the analysis of influenza vaccine immunogenicity. Vaccine. 34 (4), 458-465 (2016).
- Westgeest, K. B., et al. Optimization of an enzyme-linked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A(H3N2) viruses. J Virol Methods. 217, 55-63 (2015).
- Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6108-6113 (2000).
- WHO. Manual of Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. , (2002).
- Cate, T. R., et al. A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects. Vaccine. 28 (9), 2076-2079 (2010).
- Couch, R. B., et al. Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase. J Infect Dis. 207 (6), 974-981 (2013).
- Fritz, R., et al. Neuraminidase-Inhibiting Antibody Response to H5N1 Virus Vaccination in Chronically Ill and Immunocompromised Patients. Open Forum Infect Dis. 1 (2), (2014).
- Fries, L. F., Smith, G. E., Glenn, G. M. A recombinant viruslike particle influenza A (H7N9) vaccine. N Engl J Med. 369 (26), 2564-2566 (2013).
- Monto, A. S., et al. Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection. J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).
- Fritz, R., et al. A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies. J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).
