Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Использование нескольких фторированных желчных кислот и Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/54597
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 2,6
1Department of Surgery, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 3Department of Radiology, University of Maryland School of Medicine, 4Food and Drug Administration, 5Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland School of Pharmacy, 6VA Maryland Health Care System

Summary

Инструменты для диагностики желчных кислот мальабсорбции и измерить транспорта желчи кислоты в естественных условиях ограничены. Инновационный подход в живых животных описано , что использует комбинированный протон (1 H) плюс фтор (19 F) магнитно - резонансной томографии; эта новая методология имеет трансляционной потенциал для скрининга мальабсорбции желчных кислот в клинической практике.

Abstract

Наряду с их традиционной роли в качестве моющих средств, которые облегчают усвоение жиров, возникающих литература указывает на то, что желчные кислоты являются сильнодействующими сигнальные молекулы, которые влияют на несколько органов; они модулируют моторику кишечника и выработку гормонов, и изменяют тонус сосудов, метаболизм глюкозы, метаболизм липидов, а также использование энергии. Изменения в фекальных желчных кислот может привести к изменению кишечника микробиомом и способствуют толстой кишки патологии, включая cholerrheic диареи и рака толстой кишки. Основные регуляторы состава фекальной желчной кислоты являются тонкой кишки апикальной натрий-зависимого желчной кислоты Transporter (ASBT) и фактор роста фибробластов-19 (Fgf19). Снижение экспрессии и функции ASBT уменьшает кишечное желчной кислоты вверх берут. Кроме того, данные в пробирке предполагают , что некоторые FDA одобренные препараты ингибируют функцию ASBT. Дефектные релиз FGF19 увеличивает синтез в печени желчных кислот и их высвобождение в кишечнике до уровней, которые переполняют ASBT. Либо ASBT дисфункция или недостаток FGF19 увеличивает пECal желчных кислот и может вызвать хронический понос и способствуют неоплазии толстой кишки. К сожалению, инструменты для измерения желчи мальабсорбции кислоты и действия препаратов на транспорте желчных кислот в естественных условиях ограничены. Для того, чтобы понять сложные действия желчных кислот, методы, необходимые, которые позволяют одновременный мониторинг желчных кислот в кишечнике и метаболических тканях. Это привело нас к зачатию инновационный метод измерения транспорта желчи кислоты в живых животных , используя комбинацию протона (1 H) и фтора (19 F) магнитно - резонансной томографии (МРТ). Новые индикаторы для фтора (F 19) основе живого животного МРТ были созданы и испытаны, как в пробирке и в естественных условиях. Сильные стороны такого подхода включают в себя отсутствие воздействия ионизирующего излучения и трансляционной потенциал для клинических исследований и практики.

Introduction

Наряду с их классической роли в качестве моющих средств , которые облегчают усвоение жиров из кишечника, желчных кислот появились в качестве мощных сигнальных молекул , влияющих на несколько органов в дополнение к тем , которые связаны с их энтерогепатической циркуляции 1,2. Помимо контроля за их собственный метаболизм, желчные кислоты модулируют несколько аспектов желудочно - кишечного тракта физиологии (например, сократительной способности кишечника и инкретиновый производства гормонов, физиологии толстой кишки, и предрасположенность к раку) и иметь системные эффекты на сосудистый тонус, глюкозы и липидного обмена, а также использование энергии. В то время как некоторые из этих эффектов опосредуется в кишечнике, другие обусловлены постпрандиальной изменений в системном уровнях желчных кислот, как было отмечено у пациентов с ожирением или после желудочного шунтирования. Для выяснения сложных метаболические действия желчных кислот требуется новая технология, которая позволяет одновременный мониторинг уровней желчных кислот в различных анатомических отделениях, в желудочно-кишечном тракте и метаБолич тканей (печени, поджелудочной железы, скелетных мышцах и жировой ткани). Получение такой временной и пространственной информации требует инновационной технологии - в естественных условиях с использованием визуализации новых радиофармпрепаратов желчных кислот , как описано здесь , является такой новый подход.

состав кислоты Желчь и распределение в анатомических регулируются факторами, которые модулируют их синтез в печени и подвздошной поглощение, в том числе диеты, хирургии, применения антибиотиков и изменения кишечной флоры. Основным регулятором поглощения кишечной желчной кислоты для их энтерогепатической циркуляции 3 (рисунок 1) является подвздошной Апикальное натрий-зависимого желчной кислоты Transporter (ASBT; SLC10A2). Несмотря на то, пассивное поглощение происходит на всем протяжении кишечника, ASBT опосредует поглощение 95% кишечных желчных кислот, так что, как правило, не обеспечивается эффективно рассыпание желчных кислот в кале. ASBT-дефицитных (Slc10a2 - / -) мышей увеличили фекальных желчных кислот и уменьшенный желчи ACId бассейн 4.

Рисунок 1
Рисунок 1: энтерогепатической циркуляции желчных кислот.
Иллюстрация энтерогепатической циркуляции в результате чего желчные кислоты синтезируются в печени, экскретируется в желчные протоки, хранится в желчном пузыре, выбрасываемых в проксимальных отделах тонкой кишки с питанием, а также активно поглощают с помощью ASBT в дистальный подвздошной. В то время как небольшие количества желчных кислот всасываются пассивно во всем кишечнике, приблизительно 95% кишечных желчных кислот активно транспортируют ASBT, что приводит к минимальным (приблизительно 5%) потери в кале, которое компенсируется аналогичным количеством нового синтеза желчных кислот в печень, тем самым сохраняя стационарный бассейн желчных кислот. Стрелки на правом определить факторы, которые могут повлиять на родной и фтор-меченых желчи стабильность кислоты, в том числе кислоты желудочного сока, поджелудочной железы и слизистой оболочки кишечника ферментов, и, самое importantlу, гидролитические ферменты , выпущенные видов клостридий , которые колонизируют дистального тонкой кишки и толстой кишки. (Modified с разрешением 16) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

мальабсорбции Желчные кислоты могут быть разделены на три типа, каждый из которых увеличивает каловые дигидрокси желчных кислот, что вызывает прерывистый или хронический понос. Тип 1 Результаты от валового подвздошной патологии (например, резекция, болезнь Крона) 5. Тип 3 результаты холецистэктомии, ваготомии, целиакии, избыточного бактериального роста и недостаточности функции поджелудочной железы. В отличие от этого, лица с «первичной» (тип 2) мальабсорбции желчных кислот представляют собой огромную проблему в диагностике, потому что у них нет таких условий, предшествующие и не имеют доказательств патологии в подвздошной кишке. Следовательно, мальабсорбции первичной желчной кислоты обычно ошибочно диагностируется как диарея-рredominant синдром раздраженного кишечника (IBS-D), пожалуй, наиболее распространенной причиной для гастроэнтерологии связанных амбулаторных посещений. Было подсчитано, что одна треть пациентов с IBS-D имеют мальабсорбции первичный желчных кислот; в США, это может представлять несколько миллионов человек 5. Последние Insights показывают, что первичный БАМ происходит от нарушенной обратной связи ингибирование синтеза желчных кислот в печени кишечными фактора роста фибробластов-19 (FGF19), а не за счет уменьшения экспрессии или функции ASBT.

В мальабсорбции первичной желчной кислоты, низкие уровни плазмы FGF19 не отключить синтез желчных кислот в печени - результирующее увеличение кишечных желчных кислот насыщает желчных кислот, в том числе транспортеров ASBT и дополненная разлив желчных кислот в кале вызывает понос 6 (Рисунок 2). Мыши , дефицитные по FGF15 (мышиный FGF19) имеют расширенный пул желчных кислот и увеличение фекальных желчных кислот 7.


Рисунок 2: Механизмы кишечнику желчной кислоты мальабсорбции.
Как правило, как показано на панели А, приблизительно 95% кишечных желчных кислот всасываются активным транспортом в дистальной подвздошной кишки через ASBT. Когда выражение ASBT или активность снижается (панель В), нарушенная кишечника результаты поглощение желчных кислот в разливе желчных кислот в толстой кишке. При нарушении сигнализации Fgf19 (панель C), отсутствие обратной связи ингибирование печеночных желчных синтеза приводит кислоты в повышенной концентрации кишечных желчных кислот , которые переполняют транспортный потенциал ASBT с разливом желчных кислот в толстой кишке. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.

Долгосрочный, хронический возвышение в фекальной желчи ACIDS может способствовать неоплазии толстой кишки. Colon неоплазии возникает от прогрессирующей дисплазии слизистой оболочки, связанного с соматическими мутациями генов, но факторы окружающей среды, которые увеличивают фекальных желчных кислот может ускоряет и усиливает этот процесс. У грызунов, увеличение фекальных желчных кислот либо в результате экзогенного или недостаточности ASBT способствуют дисплазии толстой кишки и образование опухоли 8-10.

Следует отметить, что провокационные данные показывают , что обычно используемые препараты , одобренные Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) эффективно ингибируют транспорт желчных кислот путем ASBT в пробирке 11. Если эти препараты снижают способность тонкого кишечника транспорт желчных кислот в живом организме и повышают уровни фекальных желчных кислот, потенциальное воздействие на толстой кишки патологии будет в связи с этим. Даже небольшое увеличение толстой кишки патологии связано с использованием такого препарата может оказать серьезное воздействие на здоровье. Инструментарий , который может оценить правдоподобность их в пробирке выводов и эпидемического Obпобудит дения дополнительных исследований, в том числе исследований по безопасности постмаркетинговых.

Несмотря на необходимость, практические тесты с целью выявления людей с нарушением всасывания желчных кислот отсутствуют. Прямое измерение фекальных желчных кислот был отвергнут лет назад как громоздкий, непрактичный и ненадежный 5. Альтернативные подходы включают измерения удержания радиоактивного производного селенового-меченых холевой кислоты (75 SeHCAT) и плазменные уровни 7 & alpha ; -гидрокси-4-холестен-3-он (C4), или терапевтического испытания , вяжущих желчных кислот. 75 Тестирование SeHCAT имеет ограниченная доступность в Европе и не FDA утвержденных или доступны для использования в США Кроме того, даже скромное облучение (0,26 мЗв / 75 тест SeHCAT) диагностического тестирования вызывает беспокойство, и избыточного бактериального роста и запущенное заболевание печени может посрамить 75 результатов SeHCAT. Тестирование С4 является потенциально привлекательным, так как требуется только плазма, но она имеет низкий положительной прогностической Валуие и тестирование не получили широкого распространения. Измерение уровня в сыворотке крови FGF19 имеет те же ограничения. Часто врачи прибегают к терапевтическому испытании желчная кислота, но такой подход не может обеспечить окончательный диагноз желчных кислот мальабсорбции 5.

По этим причинам, роман МРТ подход был задуман для измерения транспорта желчи кислоты и распределение в естественных условиях с использованием инновационных мульти-фторированных желчных кислот (АБМФ-МРТ). АБМФ , содержащие три атома фтора (19 F), стабильный изотоп 100% природного содержания, транспортируют подобно нативных желчных кислот 12, и может быть использован для визуализации транспорта желчи кислоты с комбинацией протона (1 H) и фтора ( 19 F) МРТ, чувствительный, безопасный метод без воздействия ионизирующего излучения 13,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Следующий протокол придерживается руководящих принципов, утвержденных животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) в Университете штата Мэриленд школы медицины (IACUC Протокол № 0415011, утвержденной 18 июня 2015) по.

1. Gavaging Мыши с 19 F-меченых желчные кислоты

  1. С принудительным кормлением мышей с 150 мг / кг веса тела 19 F-меченых желчных кислот. Заполните 1 мл шприц до нужного объема с 19 F-меченых желчных кислот исходного раствора [желчный кислотно-трифтор-ацетил лизина (CA-лиз-TFA, в 1: 1 полиэтиленгликоль 400: фосфатом Дульбекко буферный солевой раствор) или cholylsarcosine- трифтор-N-метил-ацетамид (CA-сар-TFMA; в 60% полиэтиленгликоля 400 и 40% Дульбекко фосфатный солевой буфер] и присоедините 20 калибра 1,5-дюймовый изогнутый колба наконечником желудочный зонд иглы Убедитесь, что через зонд иглы. достаточно долго, чтобы достичь уровня xyphoid хряща мыши при вставке в пищеводе до ступицы иглы
  2. Твердо гподпиливать животному свободной кожи на задней части шеи между большим и указательным пальцами и использовать оставшиеся пальцы, чтобы захватить кожу на нижней части спины и хвоста.
  3. Держите мышь в вертикальном положении и пройти через зонд иглу вдоль стороны и крыша ротовой полости в пищевод и в желудок. Если сопротивление встречается в глотке, изменить положение иглы, пока животное 'проглатывает' это - не упираются сопротивления.
  4. Если анестезии требуется для затравки, поместите курсор в колоколе, содержащей 5 мл изофлуран и близко. Когда мышь падает на бок, подождать 7 секунд, удалите мышь и выполнить через желудочный зонд. Для защиты персонала от паров анестезирующих, используйте колпаком только в вытяжном шкафу.
  5. Заметим, животное оправиться от изофлуран через несколько минут.
    Примечание: Так как изофлуран метаболизируется печенью, фтор сигнал, исходящий от интактного лекарственного средства или его метаболитов из организма в желчной системы и желчного пузыря может посрамить FluoRine сигналы от 19 F-меченых желчных кислот 15. Альтернативой является использование кетамина плюс ксилазин (смотри раздел 3.1 для доз).

2. Сбор желчного пузыря, печени и крови для желчной кислоты Измерения с использованием жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии

  1. Для достижения максимального наполнения желчного пузыря, быстро мышей в течение по крайней мере 6 часов до сбора органов. Готовят кетамина и ксилазина в фосфатно-буферном солевом растворе (100 мкл кетамина, 62,5 мкл ксилазин, 840 мкл PBS).
  2. С помощью 1 мл стерильный шприц, впрыснуть мыши подкожно через 1 час до сбора клеток органов с 15 мкл / г массы тела раствора кетамина / ксилазина (150 мг кетамина и 18 мг ксилазина на кг массы тела).
  3. Один час после введения кетамина / ксилазина подтверждения адекватной анестезии с помощью пальца щепоткой и поместите наркозом лежа на спине мыши.
  4. Используйте 5 или 6 дюймов ножницы, чтобы сделать по средней линии живота разрез кожи от лобка к xyphoid и Ф.И.пе ножницы (4 дюйма), чтобы разрезать брюшную подкладку и подвергать органы брюшной полости - не проткнуть диафрагму.
  5. Возьмитесь за мечевидный отросток с 5-дюймовым зажать и поднимите обратно поперек груди, чтобы выставить верхнюю полость брюшной. Используйте пинцет и тупой инструмент рассекать и переместить печень в сторону, обнажая желчного пузыря.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не терзать печень или коснуться желчного пузыря, как первый будет вызывать сильное кровотечение, и последний может стимулировать сокращение желчного пузыря и опорожнение.
  6. Поместите 4-дюймовый зажим через общий желчный проток (рисунок 3, пунктирными стрелками). Обрежьте связки имеется верхнего полюса желчного пузыря до диафрагмы и осторожно переместить желчного пузыря в правую сторону живота.

Рисунок 3
Рисунок 3: Анатомические и Proton МРТ Просмотров мыши желчного пузыря.
Левая панель показывает обнаженную МОДе желчного пузыря слева от средней линии после лапаротомии. Зажим захватывает мечевидный отросток. Желчь заполненные натощак желчный пузырь обозначается большой стрелкой, а зажатого общего желчного протока пунктирными стрелками. [Врезка: иссекают неповрежденной желчного пузыря с общим желчным протоком зажат. Линейка отмечен в миллиметрах (мм).] Правая панель показывает с высокой разрешающей способностью протонной плотности взвешенной МРТ изображение поста мышиного желчного пузыря (стрелка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Перед вырезанием желчного пузыря выполняют пункции сердца, урожай кровь, и обескровить животное для проверки эвтаназию.
    Примечание: Сбор желчного пузыря может сначала разрывают печень, вызывая сердечно-сосудистые крах и неспособность получить достаточное количество образца крови (≥ 200 мкл).
  2. Expose нижнюю часть левой диафрагмы иопределить бьющееся поверхность сердца. В точке максимального сердечного пульсацией проколоть мембрану и сердце с 23-го калибра иглы, прикрепленной к 1-мл шприца.
    1. Медленно извлеките шприц, аспирируя. Когда кровь начинает заполнять шприц, прекратить снятие и поддержания всасывания собрать 0,2 - 0,6 мл крови. Осторожно вращая иглу или снятия его немного может восстановить поток, если оно прекращается.
    2. Перенести кровь в 1,5 мл гепаринизированной трубки и центрифуге при 2000 х г в течение 15 мин. Осаждать плазму с четырех частей ацетонитрила и центрифугируют при 12000 х г в течение 10 мин. Анализ надосадочной жидкости с помощью жидкостной хроматографии / масс - спектрометрии (ЖХ / МС / МС) 11-1312-1412-1412-1412-14. При необходимости хранить плазму при -80 о С перед анализом.
  3. Использование тупым, освободить желчный пузырь от печени. Трансекте общего желчного протока ниже зажима, снимите и взвесить желчного пузыря, и поместить его в 1,5 мл microcentrifuge трубки. Заготавливают печень.
  4. Перемешать примерно 100 мг печени и желчного пузыря все на льду в гомогенизаторе стекло ткани размер-21. Экстракт с 75% ацетонитрила и 25% воды (800 мкл для печени, 300 мкл на желчном пузыре) и центрифуге при 12000 х г в течение 10 мин. Развести экстракты по мере необходимости и количественного содержания желчных кислот с помощью LC / MS / MS 11-13.

3. живых животных Протон (1 Н) и фтором (19 F) , магнитно - резонансная томография

  1. Для достижения максимального наполнения желчного пузыря, быстро мышей в течение по крайней мере 6 часов до визуализации. Использование кетамина и ксилазина, обезболить мышей, чтобы предотвратить движение в МРТ сканера. Готовят раствор кетамин и ксилазином в фосфатном буферном солевом растворе (130 мкл кетамина, 42,5 мкл ксилазином 827 мкл PBS). Один час до того МРТ, используют 1 мл стерильный шприц, чтобы впрыснуть подкожно мыши с 5 мкл / г массы тела этого раствора (65 мг кетамина и 4,25 мг xylazине на кг массы тела). Для предотвращения сухости под наркозом применяют ветеринарную мазь для глаз животного.
  2. После индукции с кетамином / ксилазином , как описано выше, клип площадь 1,5 см 2 на левой нижней части мыши брюшной полости с помощью # 40 или более тонкие лезвия электрической клипер. После удаления меха, приготовительные области с 8 - 12% разбавленным раствором йода хирургической скраб и промыть 70% спиртом - повторите оба шага. Вставьте 24 калибра 0,75-дюймовой иглой / катетера подкожно и туннель в брюшную полость. Убедитесь, что катетер не в слепой кишке или другой брюшной орган, потянув назад на поршень - не должно быть никакой крови или фекалии в катетере.
  3. Удалите иглу и оставить внутрибрюшного катетер. Поместите курсор на контролируемой температурой тепловой панели в сканер животных камеры МРТ.
  4. Приготовьте 1 мл стерильный шприц, содержащий кетамина и ксилазина в фосфатно-солевом буфере (1000 мкл кетамина 300 мкл ксилазина, 6700 мкл PBS) и заполнить требуемую длину 72 дюймов стерильной трубкой. Подключите внутрибрюшного катетер к укажи стерильной трубки и продлить его подальше от сканера МРТ. Для поддержания анестезии вводят 50 мкл этого раствора каждые 20 мин, если жизненно важные признаки мышки стабильны.
    Примечание: Перед тем как изображения, убедитесь, что нет металлы не находятся вблизи МРТ сканера.
  5. Используйте 19 F / H 1 двойной настроенный МРТ катушки линейный объем для передачи и приема радиочастотных сигналов на 300.283 МГц для 1 H и 282.524 МГц для ядер 19 F.
    1. Выполните калибровку 11, 13 системы и локализовать животное с тремя срезе (осевой, средне-сагиттальной и корональной) скаутских изображений с использованием последовательности выстрел быстрый под малым углом (FLASH). Для того, чтобы начать эксперимент, нажмите на кнопку "светофора" в окне управления Scan на консоли программного обеспечения.
    2. Приобретать многосрезовых 1 H MR изображения с помощью быстрого приобретения с релаксацией повышенияния (редком) последовательность в поперечном образца или тела животного с течением времени повторения 2,200 мс, эхо времени 8,9 мс, Rare фактор 8, поле зрения 4 х 4 см 2, толщина среза 1,0 мм, размер матрицы 266 х 266, в плоскости разрешение 150 х 150 мкм 2, а количество средних 6. Для начала эксперимента, нажмите кнопку "светофора" в окне управления Scan на консоли программного обеспечения.
    3. Приобретать 19 F изображений с использованием последовательности FLASH в той же области 1 H ЯМР со временем повторения 220 мс, флип угол = 30 °, эхо время 3.078 мс, размер матрицы 32 х 32, в плоскости разрешение 1,25 х 1,25 мм 2, толщина среза 4,0 мм, а количество средних 768. Для того, чтобы начать эксперимент, нажмите (о- O n - P ipeline G) кнопку в окне спектрометр инструмент управления на консоли программного обеспечения "ГИ".
  6. После того, как МРТ, эвтаназии мышь с внутрибрюшинного injectiна 15 мкл / г массы тела кетамин / ксилазин раствор (150 мг кетамина / 18 мг ксилазина на кг массы тела) с последующим пункции сердца для обескровливания.
  7. Чтобы восстановить мышь от анестезии, удалите внутрибрюшного катетер, но не оставляйте животное без присмотра, пока он не приходит в сознание достаточного для поддержания грудины лежачее.
  8. Для измерения 19 F-меченных концентрации желчных кислот из 11-13 урожаем органов, поддержания анестезии кетамином плюс ксилазином , как описано выше.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Использование АБМФ для МРТ в естественных условиях , чтобы "видеть" желчной кислоты транспорта в режиме реального времени имеет большой потенциал как для исследований и клинического применения. Кроме того, методы, описанные здесь резекции желчного пузыря и биохимического анализа его содержимого с помощью жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии обеспечивают средство подтверждения результатов визуализации. Однако обоснованность этих методов требует точного дозирования, сроки анализов и локализации желчного пузыря для визуализации или хирургического удаления. Что касается последнего, то очень важно, чтобы органы брюшной полости мышки возмущаться как можно меньше; даже нежные манипуляции желчного пузыря может стимулировать сокращение и опорожнение. Следовательно, чтобы захватить все его содержимое, важно, чтобы поместить зажим через общий желчный проток как можно скорее.

Используя хирургический подход, предложенный здесь, желчного пузырядолжны быть легко идентифицированы за правой передней доли печени в правом верхнем квадранте живота (рисунок 3). Перемещение печени в сторону, не касаясь желчного пузыря подвергает общего желчного протока для зажима. После того, как этот зажим находится в месте, не должно быть никаких трудностей выполнением других шагов, описанных в Протоколе, чтобы удалить желчный пузырь нетронутыми.

Данные , приведенные в таблице 1 , показывают высокую селективную концентрацию АБМФ в желчном пузыре 13,14. Концентрации органов (печени и желчного пузыря) АБМФ рассчитывали в предположении , плотностью 1 г / мл 13,14. В течение 7 часов устного дозирования, средняя накопление АБМФ в желчном пузыре было на несколько порядков (1000 раз) выше , чем наблюдается либо в печени или крови 13,14; миллимолярном уровни наблюдались в желчном пузыре в сравнении с микромолях уровней в печени и крови (таблица 1 </ Сильный>). Средние концентрации АБМФ в диапазоне от 0,4 - 1,4 мкМ в крови, 14,5 - 78,8 мМ в печени, и 18,4 - 27,0 мм в желчном пузыре. Эти результаты согласуются с АБМФ обрабатывается так же, как физиологических желчных кислот; после перорального приема, АБМФ активно транспортируются ASBT в энтерогепатической циркуляции в результате чего они переносятся в печень для активного транспорта в гепатоциты от натрия / таурохолат совместно транспортирующего полипептид (НПБТ), и выводится из организма в желчные протоки для концентрации в желчном пузыре (Рисунок 1).

Рисунок 4 показывает , зависящее от времени накопление сигнала F 19 в желчном пузыре после затравки с АБМФ. Более детальное во времени процесса с использованием аналитических методов (ЖХ / МС / МС) показал , что пик концентрации желчный пузырь АБМФ наблюдались в диапазоне от 4 до 7 ч после перорального приема 12, что совместимо с физиологической кинетикеиз энтерогепатической циркуляции желчных кислот. На левой панели на рисунке 4, МРТ изображение , полученное два с половиной до четырех часов после перорального введения через зонд с АБМФ, показывает 19 F сигнал , исходящий из того, что , как представляется, общего желчного протока (пунктирная стрелка) и более мощный сигнал , исходящий от желчный пузырь (стрелка); не от 7 до 8,5 ч, общий желчный проток сигнал больше не обнаруживается , и F сигнал желчного пузыря 19 увеличилось до той же интенсивностью, что и исходящий из соседнего АБМФ фантома (рисунок 4, правая панель, стрелка).

Мы использовали мышей с дефицитом экспрессии ASBT, чтобы проверить способность АБМФ-МРТ для обнаружения пониженную кишечника поглощение желчных кислот. Как показано на рисунке 5А, приблизительно 22-кратное снижение концентрации АБМФ в желчном пузыре из ASBT-дефицитных мышей измеряли с помощью LC / MS 13,14; на основе этих результатов предполагалось йв АБМФ 19 F МРТ сигнала у этих животных будет ниже пределов обнаружения. В самом деле, как показано на фигуре 5В, в то время как надежный 19 F сигнал , исходящий из желчного пузыря был обнаружен в мыши дикого типа, не было соответствующего 19 F сигнала в ASBT-дефицитных мышей 13,14. Эти данные подтверждают, что АБМФ обрабатываются аналогично физиологическим желчных кислот и, что АБМФ-ЯМР может быть использован для обнаружения нарушенного кишечного поглощения желчных кислот.

Рисунок 4
Рисунок 4: Представитель АБМФ-МРТ изображений.
Результаты экспериментов на живых мышах показывают наложений по реконструкции 19 F и 1 H изображения , показывающие , что 19 F сигналы исходят из мышиного желчного пузыря (большие стрелки). Эталонные фантомы , содержащие известные концентрации 19 F-меченых желчных кислотпомещены в МРТ сканера наряду с мышью (левая стрелка). В левой панели, пунктирная стрелка указывает на 19 F-меченого сигнал желчных кислот , исходящую от общего желчного протока. Записанный над каждой панели время после затравки с 19 F-меченых желчных кислот , что МРТ была начата в то время , что получение изображений было завершено (1,5 ч). Как и ожидалось, желчного пузыря заполнения с 19 F-меченых желчных кислот увеличивается со временем. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Ослабленная АБМФ-МРТ сигнала от желчный пузырь из ASBT-дефицитных мышей.
(А) Гистограмма показывает , что концентрация АБМФ измеряется с помощью ЖХ / МС / МС составляет примерно 22 раз ниже , в ASBT-дефицитных мышей сравнитьd с контрольными мышами. (B) При отсутствии АБМФ-МРТ сигнала из желчного пузыря в качестве ASBT-дефицитных мышей. Наконечники указывают 19 фантомы F-меченых желчных кислот (слева панелей) и 19 F МРТ сигнал от фантомов (справа панели). Стрелка в верхней правой панели показывает 19 F-меченого сигнал желчных кислот , исходящую из желчного пузыря; там нет соответствующего 19 F-меченых сигнал желчных кислот в ASBT-дефицитных мышей (нижняя правая панель). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Желчный Вес (мг) АБМФ Концентрация
Желчный (мМ) Печень (мкМ) Плазма (мкМ)
CA-Lys-ТФУ 25,2 ± 3,2 27,0 ± 2,4 78,8 ± 35,1 0,4 ± 0,2
CA-сар-TFMA 29,2 ± 2,4 18,4 ± 1,6 14,5 ± 0,6 1,4 ± 0,1

Таблица 1: Типичные значения для желчного пузыря, печени и концентрацию в плазме крови 19 F-меченых желчных кислот.
Среднее значение ± стандартная ошибка (SE) значения приведены для веса желчного пузыря и концентрации указанного АБМФ в желчном пузыре, печени и плазме 12,13. Значения, приведенные были измерены 5 до 7 ч после gavaging мышей 150 мг / кг массы тела указанного АБМФ. Обратите внимание, миллимолярном концентрации АБМФ в желчном пузыре по сравнению с микромолях концентрацией в печени и плазме. N = 3 милив.п. одно значение для CA-лиз-ТФК и 5 мышей на значение для CA-Sar-TFMA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Синтез СА-лиз-ТФК и CA-Sar-TFMA и анализа в пробирке их переноса с использованием стабильно трансфецированных Мадин-Дарби клетки собачьих почек , выражающие ASBT и эмбриональные клетки почки человека экспрессию полипептида натрия / таурохолат совместно переносящий (НПБТ) подробно описаны в другом месте 13,14. Здесь акцент делается на пероральное введение АБМФ затравки для живых животных, с последующим урожаем желчного пузыря, печени и крови для анализа содержания АБМФ, и, в частности, с изображениями АБМФ в желчном пузыре с помощью живых животных МРТ. Основные этапы включают избегая на основе фтора анестетики , которые могут создавать конкурирующие 19 F сигналов, избегая манипуляции желчного пузыря Перед скреплением общего желчного протока , который может привести к желчного пузыря и опорожнения до того , как орган иссекают, и избегать размещения металлов вблизи сканера МРТ.

Как подробно описано здесь и в других местах 13,14, АБМФ-МРТ имеет большой потенциал тO успешно анализировать транспорта желчи кислоты в естественных условиях при нормальных и аномальных физиологических условиях. Основные преимущества АБМФ-МРТ является то, что она не влечет за собой ионизирующее излучение (ни АБМФ, меченного Встречающиеся в природе, нерадиоактивного фтором, ни МРТ испускать ионизирующее излучение) и АБМФ вводят перорально, не требуя венепункции (в отличие от мышей, у большинства людей не потребуется парентеральное введение анестетиков или успокоительных средств, чтобы предотвратить артефакт движения в МРТ сканера). Замещение гидролизуемого желчной кислоты с синтетическим желчной кислоты , устойчивые к гидролизу микрофлоры кишечника 13,14, может преодолевать проблемы в отношении стабильности в естественных условиях АБМФ в кишечнике. Первоначальный прототип для АБМФ включает добавление трех атомов фтора на молекулу холевой кислоты, в природе человеческой желчных кислот , которые подвергают гидролизу в кишечнике с помощью клостридий гидролаз 13,14. Роман три- фторированной желчных кислот, СА-Sar-TFMA, основанный на саркозиномпозвоночник , который устойчив к гидролизу бактериальным ферментам обходили это ограничение, расширяя период полураспада АБМФ 13,14.

Наконец, потенциально конкурирующие методологии, использование N-метил- [11 C] cholylsarcosine для ПЭТ / КТ, ограничена облучением от обоих меченого желчных кислот и КТ, а также необходимость подготовки, судов, а также хранить радиоактивные желчные кислоты 17.

Что касается изменений и устранения неполадок при использовании данной методики нового, можно считать , что неспособность обнаружить сигнал МРТ , исходящую из желчного пузыря может быть связано с проблемой с 19 F-меченого желчной кислоты или его биодоступности, сроки получения изображения, или недостаточного заполнения желчного пузыря. Как уже говорилось выше, мы проверить структурную целостность этих агентов по их способности транспортировать в пробирке клеточных линий , экспрессирующих соответствующие транспортеров желчных кислот. Мы позволяем по крайней мере, 1,5 чг для получения изображения, но в некоторых случаях этого срока может потребовать расширения. Мы находим, что пост мышей предварительно МРТ, чтобы обеспечить максимальное заполнение желчного пузыря имеет важное значение.

Пределы обнаружения для сигналов 19 F-MRI требуют обработки изображений животных в течение 90 - 120 мин для адекватного обнаружения сигнала; это, вероятно, слишком долго для практического клинического испытания - пациенты должны лежать неподвижно в МРТ сканера в течение этого времени. Кроме того , ток, клинические МРТ опирается прежде всего на протон (1 Н) формирования изображения; применение фтора (19 F) визуализация потребует инвестиций в оборудование (19 F катушки) и программное обеспечение, по меньшей мере , $ 250,000 инвестиций на МРТ сканера с. До тех пор пока другие приложения МРТ на базе флоринов не разработаны с использованием АБМФ-МРТ для оценки пациентов для мальабсорбции желчных кислот, вероятно, будет экономически эффективным не.

АБМФ-МРТ обеспечивает многообещающую альтернативу для измерения 75 удержания SeHCAT, плазменные 7α-гидрокси-4 -cholesten-3-он (С4), и плазма FGF19 или при выполнении терапевтического испытания, с использованием связующих веществ желчных кислот. В тестировании SeHCAT США, 75, который включает в себя воздействие радиации, не FDA утвержденных. C4 и FGF19 тестирование имеет низкую положительную предсказанием ценность и тестирование в настоящее время доступны только через специализированные лаборатории. Кроме того, как C4 и уровни Fgf19 отражают печеночный синтез желчных кислот. Следовательно, в отличие от АБМФ-МРТ, эти тесты не могут обнаружить измененную экспрессию или мутации подвздошной транспортеров желчных кислот или другие механизмы мальабсорбции желчных кислот, которые не зависят от увеличения синтеза желчных кислот. Терапевтические испытания вяжущих желчных кислот могут быть полезными , но имеют неопределенный прогностическую ценность и не может дать окончательный диагноз желчных кислот мальабсорбции 5. Наконец, хотя прямое измерение фекальных желчных кислот, казалось бы разумным это предложение было отклонено лет назад как слишком громоздки, непрактичны и ненадежны для рутинного клинического применения 5.

лор "> Дополнительные проблемы должны быть преодолены , так что этот инновационный подход может быть переведен на измерения в естественных условиях транспорта желчных кислот в клинике (например, для диагностики мальабсорбции желчных кислот в качестве причины хронической диареи). Одна из основных проблем состоит в максимизации интенсивность сигнала путем увеличения числа 19 атомов F на молекулу желчной кислоты , не нарушая способность АБМФ вести себя как природных желчных кислот, то есть молекулы , желчные кислоты , которая является слишком громоздким из - за добавленных 19 атомов F не будут транспортироваться либо ASBT или желчных кислот , транспортеров в печени. способность нового АБМФ быть перевезены в пробирке может быть протестирована в клеточных линиях , экспрессирующих ключевые транспортеров человеческого желчных кислот 13,14 и должен быть предсказанием транспорта в естественных условиях. при повышенной чувствительности, АБМФ-МРТ имеет потенциал для улучшения визуализации всего билиарного дерева (например, общего желчного протока и его ветвей), в связи с этим, способность то изображения общего желчного протока в некоторых мышах представляется перспективным (рис 4, левая панель).

Несмотря на то, нынешние пределы обнаружения желчных кислот путем АБМФ-МРТ позволяют их визуализацию только в желчном пузыре, предполагая , что чувствительность метода может быть улучшена , мы ожидаем , АБМФ-МРТ может быть использован для измерения транспорта желчных кислот и их распределение в естественных условиях , таким образом обеспечивая всесторонний пространственный информация анатомически в режиме реального времени; высокоэффективная технология, которая продвинет молекулярной визуализации. АБМФ-МРТ также предложить новую технологию для оценки влияния полиморфизма генов и лекарств, которые нарушают функцию желчных кислот транспортеров. АБМФ-МРТ имеет трансляционной потенциал , чтобы помочь врачам скрининга мальабсорбции желчных кислот и тем самым идентифицировать и управлять заболеваний в результате увеличения фекально желчных кислот (например, диарея, имитирующее синдром раздраженного кишечника). И, наконец, следует этот метод становится клинически доступен он имеет большой профессионалрежиссура для ускорения прогресса в точности медицины, предоставляя возможность идентифицировать измененную поглощение желчных кислот в кишечнике у людей с новообразованиях толстой кишки или других условий, которые могут быть затронуты изменениями в фекальных желчных кислот.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения, Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний (номера грантов R21 DK093406 и T32 DK067872 к JP.R.) и награду Заслуги В.А. (грант номер 1BX002129 к JP.R.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Duall size-21 all glass tissue grinder Kimble Chase Life Science, Vineland, NJ 885351-0022
Bruker BioSpec 70/30USR Avance III 7T horizontal bore MR Scanner Bruker Biospin MRI GmbH, Germany Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5)
Bruker 40 mm 19F/1H dual-tuned linerar volume coil Bruker Biospin MRI GmbH, Germany Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5)
Waters Acquity UPLC System with Quadrupole Detector Waters Corporation, Milford, MA
Waters Acquity UPLC ethylene bridged hybrid C8 1.7 μm 2.1 x 50 mm column Waters Corporation, Milford, MA
Gavage Needle Braintree Scientific, INC. N-010 20 G-1.5" curved 2.25 mm ball
2 Stainless Steel Hemostats  VWR 10755-018 4 and 5 inch, straight
Ketamine MWI Veterinary Supply 501090 Ketamin zetamine 100 mg/ml
Xylazine Akorn, Inc. 20 mg/ml
Intraperitoneal Catheter Abbott AbbocathTM-T.I.V. G720-A01 4535-42 24-G x 0.75"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomas, C., Pellicciari, R., Pruzanski, M., Auwerx, J., Schoonjans, K. Targeting bile-acid signalling for metabolic diseases. Nat Rev Drug Discov. 7, 678-693 (2008).
  2. Vallim, T. Q., Edwards, P. A. Bile acids have the gall to function as hormones. Cell Metab. 10, 162-164 (2009).
  3. Dawson, P. A., Karpen, S. J. Thematic Review Series: Intestinal Lipid Metabolism: New Developments and Current Insights Intestinal transport and metabolism of bile acids. Journal of Lipid Research. 56, 1085-1099 (2015).
  4. Dawson, P. A., et al. Targeted deletion of the ileal bile acid transporter eliminates enterohepatic cycling of bile acids in mice. J Biol Chem. 278, 33920-33927 (2003).
  5. Pattni, S., Walters, J. R. Recent advances in the understanding of bile acid malabsorption. Br Med Bull. 92, 79-93 (2009).
  6. Walters, J. R., et al. A new mechanism for bile acid diarrhea: defective feedback inhibition of bile acid biosynthesis. Clin Gastroenterol Hepatol. 7, 1189-1194 (2009).
  7. Hofmann, A. F., Mangelsdorf, D. J., Kliewer, S. A. Chronic diarrhea due to excessive bile acid synthesis and not defective ileal transport: a new syndrome of defective fibroblast growth factor 19 release. Clin Gastroenterol Hepatol. 7, 1151-1154 (2009).
  8. Flynn, C., et al. Deoxycholic acid promotes the growth of colonic aberrant crypt foci. Mol Carcinog. 46, 60-70 (2007).
  9. Glinghammar, B., Rafter, J. Carcinogenesis in the colon: interaction between luminal factors and genetic factors. Eur J Cancer Prev. 8, S87-S94 (1999).
  10. Bernstein, C., et al. Carcinogenicity of deoxycholate, a secondary bile acid. Arch Toxicol. 85, 863-871 (2011).
  11. Zheng, X., Ekins, S., Raufman, J. P., Polli, J. E. Computational models for drug inhibition of the human apical sodium-dependent bile acid transporter. Mol Pharm. 6, 1591-1603 (2009).
  12. Vivian, D., et al. Design and characterization of a novel fluorinated magnetic resonance imaging agent for functional analysis of bile Acid transporter activity. Pharm Res. 30, 1240-1251 (2013).
  13. Vivian, D., et al. Design and evaluation of a novel trifluorinated imaging agent for assessment of bile acid transport using fluorine magnetic resonance imaging. J Pharm Sci. 103, 3782-3792 (2014).
  14. Vivian, D., et al. In vivo performance of a novel fluorinated magnetic resonance imaging agent for functional analysis of bile acid transport. Mol Pharm. 11, 1575-1582 (2014).
  15. Raufman, J. P., et al. In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Detect Biliary Excretion of 19F-Labeled Drug in Mice. Drug Metab Dispos. 39, 736-739 (2011).
  16. Ridlon, J. M., Kang, D. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47, 241-259 (2006).
  17. Frisch, K., et al. N-methyl-11C]cholylsarcosine, a novel bile acid tracer for PET/CT of hepatic excretory function: radiosynthesis and proof-of-concept studies in pigs. J Nucl Med. 53, 772-778 (2012).

Tags

Медицина выпуск 117 желчные кислоты магнитно-резонансная томография фтором этикетирование желчный пузырь мыши транспорт
Использование нескольких фторированных желчных кислот и<em&gt; В Vivo</em&gt; Магнитно-резонансная томография для измерения желчной кислоты Транспорт
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Felton, J., Cheng, K., Said, A.,… More

Felton, J., Cheng, K., Said, A., Shang, A. C., Xu, S., Vivian, D., Metry, M., Polli, J. E., Raufman, J. P. Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport. J. Vis. Exp. (117), e54597, doi:10.3791/54597 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter