Summary
En låg kostnad, är enkel att använda och kraftfullt system inrättas för att utvärdera potentiella behandlingar som kan lindra blod retinal barriärbrott inducerad av histamin. Blodkärlsläckage, Müller-cellsaktivering och kontinuiteten i neuronala processer används för att bedöma skadorna respons och dess återföring med ett potentiellt läkemedel, lipoxin A4.
Introduction
En växande mängd bevis stöder förekomsten av blod retinal barriären (BRB) 1-5 och dess likhet med blod-hjärnbarriären (BBB) 6,7. Kompromiss av BBB har tätt kopplade kausalt eller som en diagnostisk markör för kroniska neurodegenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom (AD) 8,9 och akuta tillstånd såsom delirium 10. Mekanistiska insikter i dessa sjukdomar och upptäckter för potentiella läkemedelsmål i allmänhet hindras av den begränsade tillgängligheten och nätverk intrikat av hjärnan. Alternativ som in vivo imaging 11, hjärna organotypic kultur 12, primära cellkulturer 13,14 samt co-odlingssystem 15 har genererats. Men de flesta av dessa modeller kräver speciella instrument, långa experimentella perioder eller flera markörer för att identifiera celler. Funktionella och strukturella likheter mellan BBB och BRB samt ett samband mellan dysfunctions av två ha kunnat hävda 16-19. Dessutom har lättare tillgång till väldefinierade celltyper och en skiktad struktur tillät väldefinierad näthinnan som ett fönster till hjärnan. De strukturella och funktionella identiteter BBB och BRB återstår att jämföras i detalj. Emellertid retinala patologier, särskilt BRB brott, har också tätt associerad med framskridandet av olika sjukdomar, inklusive diabetes 18-19 och AD 21,22. Således är det av intresse att upprätta ett BRB dysfunktion systemet inte bara för att beskriva mekanismen utan även för att screena potentiella läkemedel. I denna rapport, är ett protokoll som gör det möjligt BRB dysfunktion med hjälp av en enkel akut retinal kultur utvecklas och presenteras.
Ökad BBB permeabilitet och AD-liknande patologiska förändringar har fastställts i en hjärna organotypic kultur inkuberades med histamin, en pro-inflammatoriska medlare 12. Därför, i den presenterade systemet, histamin var applerat till ex vivo retinal kultur för att inducera BRB dysfunktion. Näthinnor från flera arter, såsom Mus musculus och Bos Taurus, har testats. På grund av deras kommersiella tillgänglighet och likhet med mänsklig vävnad, var färska svin ögonglober utnyttjas för att ge de uppgifter som rapporteras här. Efter inkubering med histamin och / eller andra läkemedel, var näthinnorna bearbetas för utvärdering genom immunfärgning för flera proteiner 12, såsom immunglobulin G (IgG), en av de viktigaste komponenterna i blodet; glia fibrillärt surt protein (GFAP), en välkänd markör för glial aktivering; och mikrotubuli-associerat protein 2 (MAP2), ett neuronspecifikt cytoskelettprotein viktigt för mikrotubuli montering. Dessutom tillåter den skiktade strukturen av näthinnan en detaljerad analys av de processer Müller celler och ganglieceller, såsom förändringar i bredd och kontinuitet. Således flera ytterligare parametrar finns tillgängliga för att bedöma konsekvenserna avBRB brott på ett tidigt stadium och att utvärdera återföring effekterna av potentiella behandlingar.
I detta protokoll, potentiella återföring effekterna av avskärmade läkemedel utvärderas ur tre perspektiv: läckage av blodkärl (BvS), aktivering av gliaceller och skade respons av neuronala celler. Flera kvantifieringsmetoder utnyttjas, till exempel, expressionsnivån visas genom intensiteten av immunfärgning, breddmätning av en process och kontinuitet i neuronala processer som visas av en förstärkningsfilter. För att bättre illustrera förfarandet och hjälpa till att tolka resultaten, lipoxin A4 (LXA4), en förening endogent syntetiserat som svar på inflammatoriska skador och dämpa endoteldysfunktion 23, har valts för demonstrationssyfte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll utfördes i enlighet med den politik som Institutional Animal Care och användning kommittén i förekommande fall.
1. Beredning
- Förbereda stabiliseringen media med 75% Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), 25% Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Blanda väl, delprov och förvara vid -20 ° C fram till användning.
- Förbered Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sterilisera i autoklav. Lagra lösningen vid rumstemperatur. Värma PBS till 37 ° C innan experimentet (5 ml per brunn).
- Förbered 10%, 20% och 30% sackaros i PBS. Filtrera alla lösningar individuellt över separata 0,22 um filter för sterilisering. Spara lösningarna vid 4 ° C.
- Bereda histaminförrådslösning i PBS till en koncentration av 90 mM. Sterilisera lösningen genom att filtrera över ett 0,22 ^ M filter. Alikvot och spara lösningen vid -80 ° C. Undvik flera frys och-upptiningscykler.
- Göra färsk 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS före experimentet. Placera den på is.
Varning: Håll PFA i ett dragskåp och bära lämplig skyddsutrustning. - Tina stabiliseringsmediet (20 ml per näthinnan). Lägg penicillin-streptomycin till en slutlig koncentration av 100 U / ml. Varma delen av mediet (15 ml per retina) till 37 ° C i inkubator före experimentet. Lämna resten av mediet på is.
- Placera HBSS (10 ml per näthinnan) på is.
2. Retinal Organotypic Kultur
- Överför proverna till en vävnadsodling huva. Öppna ögonmusslan genom att skära runt objektivet. Med hjälp av en pensel, försiktigt bort glaskroppen utan att dra på näthinnan. lossa försiktigt näthinnan från den skurna kanten med en borste för att exponera den optiska skivan. Svår synnerven med en rakkniv och släpp näthinnan.
- Överför näthinnan i en petriskål och försiktigt skölja näthinnan gång med kall HBSS. Placera provet i HBSS på ice. Dissekera så många näthinnor ut efter behov genom att upprepa steg 2,1 och det här steget.
- Skär näthinnan i hälften symmetriskt med ett rakblad. överföra försiktigt proverna till ett 6-brunnars platta med 3 ml stabiliseringsmedia per brunn. Tillåt ekvilibrering under 30 minuter vid 37 ° C i en inkubator med atmosfären innehållande 5% CO2.
- Förbereda följande reagenser under inkubation vid Steg 2.3: Späd histaminstamlösningen till den önskade koncentrationen (450 | iM) i varmt medium. Upplösa LXA4 (lagrat under argon) i mediet till en slutlig koncentration av 250 ng / ml.
OBS: När man mäter effekten av LXA4, är en halv från en enda näthinna används enbart för histamin, medan den andra hälften används för histamin med LXA4. - Aspirera stabiliseringsmediet noggrant och lägg den förberedda medium till varje brunn (3 ml per brunn). Inkubera proverna vid 37 ° C under 1 h i en inkubator med atmosfären innehållande 5% CO2.
- Sköljprov en gång i varmt, steril PBS.
3. Förbered Prover för immunfärgning
- Aspirera PBS från plattorna. Lägg 4% PFA (3 ml per brunn) och inkubera under 15 minuter vid rumstemperatur.
- Snabbt aspirera PFA. Skölj proverna en gång med användning av PBS. Överför proverna till 10% sackaros (5 ml per brunn) och inkubera i 2 till 4 h vid 4 ° C.
- Överför proverna till en 30% sackaros (5 ml per brunn) och inkubera över natten vid 4 ° C. Blanda en del av den kommersiella frysmedium med två delar om 20% sackaros för att göra arbetsfrysmedium. Lämna det vid 4 ° C över natten eller längre tills luftbubblorna försvinner.
- Överför proverna till arbetsfrysmedium och tillåta ekvilibrering under 5 min vid rumstemperatur. Trimma varje näthinnan i rektanglar (ca 3 mm med 5 mm).
- Försiktigt överföra proverna in i arbets frysning media som finns i en cylindrisk behållare (cirka 1 cm radie x 2 cm höjd) devtecknas av aluminiumfolie. Säkerställa att de retinala skivor är vertikala (inriktad på tillhandahållandet av ett tvärsnitt av näthinnan vid snittning) och frysa dem i flytande kväve. Spara blocken vid -80 ° C fram till användning.
- Avsnitt varje block på en kryostat i 14 um tjocka skivor och montera sektionerna på objektglas. Lagra objektglasen vid -80 ° C fram till användning.
4. Immunfärgning
- Tvätta sektioner med 5% sackaros fosfatbuffert (SPB, 5% sackaros i PBS, pH 7,4) en gång. Blockera icke-specifika bindningsställen genom att inkubera sektionerna i blockeringsbuffert (5% SPB med 10% normalt getserum och 0,5% Triton X-100) under 1 timme vid rumstemperatur.
- Inkubera sektioner (på objektglas) med den lämpliga primära antikroppen (GFAP eller MAP2, utspätt till 1: 500 i blockeringsbuffert) under 1 timme. Aspirera lösningen. Tvätta tre gånger i 5% SPB. För färgning av endogena IgG, hoppa över detta steg.
- Inkubera sektionerna med motsvarande seconvåghalsiga antikroppar (Cyanine3 / FITC-konjugerad åsne-anti-mus / anti-kanin-IgG, utspätt till 1: 800 i blockeringsbuffert) under 1 h.
- Tvätta delarna noggrant med 5% SPB tre gånger. Förbered prover för mikroskopering genom att montera dem i monteringsmedium innehållande DAPI och täcka med täck.
- Med hjälp av en laser konfokalmikroskop, ta bilder genom en 20X objektiv under identiska parametrar såsom laserintensitet, förstärkningsvärde, uppehållstid, etc. över grupper. Ställ in excitation / emissionsvåglängder för den blå kanalen (för att upptäcka DAPI) som 408/447 nm, för den röda kanalen (för att upptäcka Cyanine3) som 561/785 nm och för den gröna kanalen (för att upptäcka FITC) som 488/525 nm .
5. Bildanalys
- Kvantifiera procent av läckande blodkärl i enlighet med följande kriterier 12: Inkludera endast blodkärl med endotel cellkärnor inom sektionsplanet i räkningen; överväga ett blodkärl läckande om det visar agradient av immunfärgning som omger kärlet.
- För att bestämma expressionsnivån, välja regioner av intresse och mäta den genomsnittliga gråvärdet med användning av bildanalysmjukvara.
- För att mäta bredden av processen, välja ett område av sektionen där processerna är distinkta (den yttre kärnskiktet, ONL, till exempel). Välj sedan en optisk fält där sådana processer är synliga och kontinuerligt. Ställ in skal enligt den mikroskopiska inställningen, dra en linje över processen och utför mätningen.
- För att analysera kontinuiteten i processen väljer regioner av intresse, applicera filtret kallas variansen som förbättrar kanterna i bilden genom att ersätta varje pixel med dess grannskap varians, automatiskt justera kontrast och ljusstyrka, räkna linjer och normalisera räkningen av område.
- Beräkna statistiska betydelser med hjälp av en två-tailed Students t-test. *, P <0,05; **, P <0,01; *** P <0,001. Pmycket resultatet som medelvärde ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterar en låg kostnad, tidseffektiv och enkel att använda system för att utvärdera potentiella behandlingar som kan skydda mot BRB brott induceras av histamin. IgG begränsas inom kärlen i kontroll näthinnan (Figur 1A), men läcker ut i blodkärlen vid histamin exponering (Figur 1B), bekräftar att modellen framgångsrikt etablerat.
LXA4 valdes för att demonstrera screening för läkemedel mot BRB brott i den presenterade systemet. BRB dysfunktion dämpas vid behandling med LXA4 (figur 1D), som inte har någon signifikant effekt i sig själv (Figur 1C). Återföringen kvantifieras som en procentandel av de läckta blodkärl och resultatet är signifikant (figur 1E). Två andra retinala celltyper, Muller gliaceller (Figur 2) och ganglieceller (
Figur 1:. Blod retinal Barrier äventyras på histamin exponering och räddade av LXA4 behandling IgG immunfärgning (röd) presenteras från näthinnan som var obehandlade (A), skada inducerad med enbart histamin (B), behandlades med endast LXA4 (C ), eller utsätts för både histamine och LXA4 (D). I kontroll (A) och LXA4 behandlades (C) grupper är IgG begränsad i blodkärlen (BVS) medan histamin gruppen (B), är IgG detekteras av BvS där den bildar läckage moln indikeras med streckade cirklar. Ytterligare tillsats av LXA4 räddar kärlets dysfunktion (D). Skalstock, 20 | j, m. (E) Kvantitativ mätning av de läckande Bokvisningar över de testade grupperna. Statistisk signifikans bestäms med en två-tailed Students t-test. *, P <0,05; **, P <0,01; *** P <0,001. Medelvärde ± SEM (n = 18) plottas i grafen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:
Figur 3: kontinuitet gangliecell Processer påverkas inte av LXA4. (A) Immunfärgning mot MAP2 presenteras från näthinnan som var obehandlade (A), skada inducerad med histamin endast (B) behandlades med LXA4 endast (C) eller utsätts för både histamin och LXA4 (D). Positiv färgning erhålles i de processer och cellkroppar av ganglieceller. Ett prov bild av MAP2 färgning (E) tillsammans med sin motsvarande filter utökad bild (F) presenteras. De kontinuerliga processer anges med pilar. Skala bar, 20 pm. (G) Densiteten av de kontinuerliga, MAP2-positiva ganglion cellprocesser från alla grupper presenteras. Statistisk signifikans bestäms med en två-tailed Students t-test. *, P <0.05; **, P <0,01; *** P <0,001. Medelvärde ± SEM (n = 18) plottas i grafen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C.
- Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
- Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
- Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
- Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).
- Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
- Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
- Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
- Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10 (2015).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
- Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).
- Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188 (2014).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
- Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
- Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
- Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).
- Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
- Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055 (2010).
- Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
- Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
- Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).
