Summary
Un bajo costo, se establece un sistema fácil de usar y potente para evaluar posibles tratamientos que podrían aminorar incumplimiento barrera sangre retiniana inducida por la histamina. fuga de los vasos sanguíneos, la activación de células Müller y la continuidad de los procesos neuronales se utilizan para evaluar la respuesta al daño y su inversión con un fármaco potencial, la lipoxina A4.
Introduction
Un creciente cuerpo de evidencia apoya la existencia de la barrera sangre de la retina (BRB) 1-5 y su similitud con la barrera hematoencefálica (BBB) 6,7. Compromiso de la BBB ha sido estrechamente vinculada causalmente o como un marcador de diagnóstico para enfermedades neurodegenerativas crónicas tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) 8,9 y agudas condiciones tales como delirio 10. conocimientos mecánicos en estas patologías y descubrimientos de los posibles objetivos farmacológicos generalmente se ven obstaculizados por la accesibilidad y la red limitada complejidad del cerebro. Se han generado alternativas tales como imágenes in vivo 11, la cultura organotípicos cerebral 12, cultivos celulares primarios 13,14 y sistemas de co-cultivo 15. Sin embargo, la mayoría de estos modelos requieren instrumentos especiales, los períodos experimentales largos o múltiples marcadores para identificar las células. similitudes funcionales y estructurales entre BBB y BRB, así como una correlación entre la dysfunctions de los dos se han argumentado 16-19. Además, el acceso más fácil, tipos de células bien definidas y una estructura en capas han permitido a la retina bien caracterizado como una ventana al cerebro. Las identidades estructurales y funcionales de la BBB y BRB aún no se han comparado en detalle. Sin embargo, las patologías de la retina, especialmente la violación BRB, también han sido estrechamente asociado con la progresión de diversas enfermedades, incluyendo la diabetes 18-19 y 21,22 AD. Por lo tanto, es de interés para establecer un sistema de disfunción BRB no sólo para delinear el mecanismo, pero también para cribar fármacos potenciales. En este informe, un protocolo que permite la disfunción BRB mediante un sencillo cultura retiniana aguda es desarrollado y presentado.
Aumento de la permeabilidad de la BHE y cambios patológicos AD-como se han establecido en una cultura organotípicos cerebro se incubaron con histamina, un mediador proinflamatorio 12. Por lo tanto, en el sistema presentado, la histamina era applIED hasta el cultivo ex vivo para inducir la disfunción retiniana BRB. Las retinas de varias especies, tales como Mus musculus y Bos Taurus, han sido probados. Debido a su disponibilidad comercial y semejanza con el tejido humano, se utilizaron ojos porcinos frescos para proporcionar los datos aquí presentados. Después de incubar con la histamina y / o otras drogas, las retinas se procesaron para su evaluación por la inmunotinción para varias proteínas de 12, tales como la inmunoglobulina G (IgG), uno de los principales componentes de la sangre; proteína ácida glial fibrilar (GFAP), un marcador conocido para la activación glial; y la proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2), una proteína del citoesqueleto neuronal específica esencial para el ensamblaje de los microtúbulos. Además, la estructura en capas de la retina permite un análisis detallado de los procesos de las células de Müller y células ganglionares, tales como cambios en su anchura y continuidad. Por lo tanto varios parámetros adicionales están disponibles para evaluar las consecuencias de laBRB incumplimiento en una etapa temprana y para evaluar los efectos de reversión de tratamientos potenciales.
En este protocolo, los posibles efectos de reversión de los fármacos seleccionados se evalúan desde tres perspectivas: la fuga de los vasos sanguíneos (BVS), la activación de células gliales y el daño de respuesta de las células neuronales. Se utilizan varios métodos de cuantificación, por ejemplo, el nivel de expresión se muestra por la intensidad de la inmunotinción, la medición de la anchura de un proceso y la continuidad de los procesos neuronales se muestra por un filtro de mejora. Para ilustrar mejor el método y para ayudar a interpretar los resultados, la lipoxina A4 (LXA4), un compuesto sintetizado de forma endógena en respuesta a una lesión inflamatoria y atenuar la disfunción endotelial 23, ha sido elegido con fines de demostración.
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Protocol
Todos los protocolos se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en su caso.
1. Preparación
- Preparar los medios de estabilización con 75% de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 25% solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Mezclar bien, alícuota y se almacena a -20 ° C hasta su uso.
- Preparar el tampón fosfato salino (PBS) y esterilizar en autoclave. Almacenar la solución a temperatura ambiente. Calentar la PBS a 37 ° C antes del experimento (5 ml por pocillo).
- Preparar 10%, 20% y 30% de sacarosa en PBS. Filtrar todas las soluciones individualmente más de 0,22 micras separadas filtros para la esterilización. Guardar las soluciones a 4 ° C.
- Preparar la solución de histamina de valores en PBS a una concentración de 90 mM. Esterilizar la solución por filtración a través de un filtro de 0,22 mM. Alícuota y se puede guardar la solución a -80 ° C. Evitar ciclos de congelación-descongelación y-.
- Hacer fresco 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS antes del experimento. Colocarlo sobre hielo.
Precaución: Mantenga PFA en una campana de humos y llevar equipo de protección apropiado. - Descongelar el medio de estabilización (20 ml por la retina). Añadir penicilina-estreptomicina a una concentración final de 100 U / ml. parte caliente del medio (15 ml por retina) a 37 ° C en incubadora antes del experimento. Deje el resto del medio en el hielo.
- Coloque el HBSS (10 ml por la retina) en hielo.
2. Retina Organotípicos Cultura
- Transferir las muestras a una campana de cultivo de tejido. Abra la tapa del ocular al cortar alrededor de la lente. El uso de un cepillo, retire con cuidado el humor vítreo sin tirar de la retina. desprender suavemente la retina desde el borde de corte con un cepillo para exponer el disco óptico. Severa del nervio óptico con una navaja y suelte la retina.
- La transferencia de la retina en una placa de Petri y enjuagar cuidadosamente la retina una vez usando HBSS frío. Colocar la muestra en HBSS en ice. Diseccionar tantos retinas a cabo según sea necesario repitiendo el paso 2.1 y este paso.
- Cortar la retina en medio simétricamente con una navaja de afeitar. transferir suavemente las muestras a una placa de 6 pocillos con 3 ml de medio de estabilización por pocillo. Permitir el equilibrio durante 30 min a 37 ° C en una incubadora con la atmósfera que contiene 5% de CO 2.
- Preparar los siguientes reactivos durante la incubación a Paso 2.3: Diluir la solución de histamina de valores para la concentración deseada (450 mM) en un medio caliente. Disolver LXA4 (almacenado en atmósfera de argón) en el medio a una concentración final de 250 ng / ml.
NOTA: Cuando se mide el efecto de LXA4, una media de un solo retina se usa para la histamina sola, mientras que el otro medio se utiliza para la histamina con LXA4. - Aspirar el medio de estabilización con cuidado y añadir el medio preparado a cada pocillo (3 ml por pocillo). Se incuban las muestras a 37 ° C durante 1 hora en una incubadora con la atmósfera que contiene 5% de CO 2.
- enjuague elmuestras una vez en caliente, PBS estéril.
3. Preparar las muestras para inmunotinción
- Aspirar PBS de las placas. Añadir 4% PFA (3 ml por pocillo) y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
- aspirar rápidamente la PFA. Enjuague las muestras una vez utilizando PBS. Transferir las muestras a 10% de sacarosa (5 ml por pocillo) y se incuba durante 2 a 4 horas a 4 ° C.
- Transferir las muestras a un 30% de sacarosa (5 ml por pocillo) y se incuba durante la noche a 4 ° C. Mezclar una parte del medio de congelación comercial con dos partes de 20% de sacarosa para hacer que el medio de congelación de trabajo. Dejarlo a 4 ° C durante la noche o más tiempo hasta que el aire burbujas desaparecen.
- Transferir las muestras al medio de congelación de trabajo y permitir el equilibrio durante 5 min a temperatura ambiente. Recorte cada retina en rectángulos (aproximadamente 3 mm por 5 mm).
- Transferir cuidadosamente las muestras en el medio de congelación de trabajo contenido en un recipiente cilíndrico (aproximadamente 1 cm de altura x 2 cm de radio) devzada de papel de aluminio. Asegúrese de que las rebanadas de retina son verticales (orientado para proporcionar una sección transversal de la retina al corte) y congelarlos en nitrógeno líquido. Guarde los bloques a -80 ° C hasta su uso.
- Sección cada bloque en un criostato a 14 micras rodajas gruesas y montar las secciones sobre portaobjetos de vidrio. Almacenar las diapositivas a -80 ° C hasta su uso.
4. La inmunotinción
- Se lavan las secciones con tampón de 5% de fosfato de sacarosa (SPB, 5% de sacarosa en PBS, pH 7,4) una vez. Bloquear los sitios de unión no específica mediante la incubación de las secciones en tampón de bloqueo (5% SPB con 10% de suero normal de cabra y 0.5% de Triton X-100) durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Incubar las secciones (en las diapositivas) con el anticuerpo primario apropiado (GFAP o MAP2, diluido a 1: 500 en tampón de bloqueo) durante 1 hr. Aspirar la solución. Lavar tres veces en 5% SPB. Para la tinción de la IgG endógena, omita este paso.
- Se incuban las secciones con la segunda correspondeanticuerpos dary (Cyanine3 / FITC burro conjugado IgG anti-ratón / anti-conejo, diluido a 1: 800 en el tampón de bloqueo) durante 1 hr.
- Lavar las secciones a fondo con 5% SPB tres veces. Preparar las muestras para microscopía montándolos en el montaje de un medio que contenía DAPI y cubrir con cubreobjetos.
- El uso de un microscopio confocal, capturar imágenes láser a través de una lente de 20X bajo parámetros idénticos, tales como la intensidad del láser, valor de ganancia, tiempo de permanencia, etc. a través de grupos. Establecer las longitudes de onda de excitación / emisión para el canal azul (para detectar DAPI) como 408/447 nm, para el canal rojo (para detectar Cyanine3) como 561/785 nm y para el canal verde (para detectar FITC) como 488/525 nm .
Análisis 5. Imagen
- Cuantificar el porcentaje de los vasos sanguíneos que gotean de acuerdo con los siguientes criterios 12: Incluir sólo los vasos sanguíneos con núcleos de células endoteliales dentro del plano de la sección en el conteo; considerar un vaso sanguíneo con fugas si muestra agradient de inmunotinción que rodea el buque.
- Para determinar el nivel de expresión, seleccionar regiones de interés y medir el valor de gris medio utilizando el software de análisis de imágenes.
- Para medir la anchura del proceso, elegir un área de la sección en la que los procesos son distintos (la capa exterior nuclear, ONL, por ejemplo). A continuación, seleccione un campo óptico cuando dichos procesos son visibles y continua. Ajuste la barra de escala de acuerdo a la configuración microscópica, dibujar una línea a lo largo del proceso y realizar la medición.
- Para analizar la continuidad del proceso, seleccione las regiones de interés, se aplican el filtro llamado varianza que mejora los bordes de la imagen mediante la sustitución de cada píxel con su varianza barrio, ajustar automáticamente el contraste y el brillo, contar las líneas y normalizar el recuento por el zona.
- Calcula significaciones estadísticas usando la prueba t de Student de dos colas. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001. PAGmucho el resultado como media ± SEM.
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Representative Results
Presentamos un sistema en tiempo eficiente y fácil de usar, de bajo costo para evaluar los tratamientos potenciales que podrían proteger contra la violación BRB inducida por la histamina. IgG se ve limitada dentro de los vasos de la retina de control (Figura 1A), pero se escapa de los vasos sanguíneos tras la exposición histamina (Figura 1B), lo que confirma que el modelo se ha establecido correctamente.
LXA4 fue elegido para demostrar la detección de fármacos contra la violación BRB en el sistema presentado. Disfunción BRB se atenúa tras el tratamiento con LXA4 (Figura 1D), que no tiene efecto significativo por sí mismo (Figura 1C). La inversión se cuantifica como un porcentaje de los vasos sanguíneos filtrados y el resultado es significativo (Figura 1E). Otros dos tipos de células de la retina, las células de Müller gliales (Figura 2) y las células ganglionares (
Figura 1:. La retina barrera de sangre se ve comprometida tras la exposición de histamina y rescatados por tratamiento LXA4 inmunotinción IgG (rojo) se presenta de retina que fue sin tratar (A), el daño inducido por sólo con histamina (B), se trató con solamente LXA4 (C ), o expuestos a tanto histamINE y LXA4 (D). En el control (A) y los grupos tratados con LXA4 (C), la IgG está restringida dentro de los vasos sanguíneos (BVS), mientras que en el grupo de histamina (B), la IgG se detecta fuera de la BvS donde forma nubes de fuga indicadas por una línea discontinua. La adición adicional de LXA4 rescata la disfunción de los vasos (D). Barra de escala, 20 micras. (E) La medición cuantitativa de la BvS de fugas a través de los grupos de prueba. La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student de dos colas. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001. La media ± SEM (n = 18) se representa en el gráfico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:
Figura 3: La continuidad de los procesos celulares del ganglio no se ve afectada por la LXA4. (A) La inmunotinción contra MAP2 se presenta de retina que fue sin tratar (A), el daño inducido por histamina con solamente (B) tratados con solamente LXA4 (C) o expuestos a ambos histamina y LXA4 (D). La tinción positiva se obtiene en los procesos y cuerpos celulares de las células ganglionares. Se presenta una imagen de la muestra de la tinción MAP2 (E) junto con su correspondiente imagen de filtro mejorada (F). Los procesos continuos se indican mediante puntas de flecha. Barra de escala, 20 m. (G) La densidad de las células ganglionares, procesos MAP2-positiva continua de todos los grupos se presentan. La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student de dos colas. *, P <0.05; **, P <0,01; ***, P <0,001. La media ± SEM (n = 18) se representa en el gráfico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
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