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अनुभवजंय, Metagenomic, और गणना तकनीक तंत्र जो द्वारा कवक समझौता मधुमक्खी स्वास्थ्य रोशन

Published: October 9, 2017 doi: 10.3791/54631
Automatic Translation
1,2, 2, 3,4, 5, 1,3, 6,7,8
1Vegetable Crop Research Unit, USDA-ARS, 2Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics, Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution, University of Wisconsin-Madison

Summary

bumble मधुमक्खी पित्ती समृद्ध और मधुमक्खी लार्वा के लिए पराग की रक्षा के भीतर माइक्रोबियल consortia । अगली पीढ़ी sequencing का उपयोग करना, प्रयोगशाला और क्षेत्र के साथ-प्रयोगों पर आधारित, इस पांडुलिपि का वर्णन प्रोटोकॉल की परिकल्पना है कि फंजीसाइड अवशेषों पराग microbiome, और कॉलोनी जनसांख्यिकी बदल परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया, अंततः कॉलोनी के लिए अग्रणी नुकसान.

Abstract

उत्पादकों अक्सर फंजीसाइड अवशेषों को मधुमक्खियों को उजागर करता है जो रोग के खिलाफ फसलों की रक्षा के लिए खिलने के दौरान फंजीसाइड स्प्रे का उपयोग करें । हालांकि माना जाता है "मधुमक्खी सुरक्षित," वहां बढ़ते सबूत है कि पराग में फंजीसाइड अवशेषों मधुमक्खी गिरावट के साथ जुड़े रहे है (दोनों शहद और bumble मधुमक्खी प्रजातियों के लिए) । जबकि तंत्र अपेक्षाकृत अज्ञात रहते हैं, शोधकर्ताओं ने अटकलें लगाई है कि मधुमक्खी सूक्ष्म symbioses शामिल हैं । रोगाणुओं संरक्षण और/या पराग, जो लार्वा मधुमक्खियों के लिए पोषण के रूप में कार्य करता है के प्रसंस्करण में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं । माइक्रोबियल समुदाय में फेरबदल करके, यह संभावना है कि कवक इन सूक्ष्म मध्यस्थता सेवाओं को बाधित है, और इस तरह मधुमक्खी स्वास्थ्य समझौता । यह पांडुलिपि अप्रत्यक्ष तंत्र (ओं) जिसके द्वारा कवक कॉलोनी गिरावट पैदा हो सकता है की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन है । पिंजरा प्रयोगों को उजागर मधुमक्खियों फंजीसाइड-इलाज फूल पहले से ही पहले सबूत है कि कवक एक देशी bumble मधुमक्खी (Bombus impatiens) में गहरा कॉलोनी नुकसान का कारण प्रदान की है । कवक के क्षेत्र-प्रासंगिक खुराक, प्रयोगों की एक श्रृंखला का उपयोग फंजीसाइड उजागर पराग के माइक्रोबियल समुदाय की गतिशीलता का एक बेहतर विवरण प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है । पराग microbiome के भीतर कवक और बैक्टीरियल assemblages की संरचनात्मक संरचना में बदलाव अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और metagenomic विश्लेषण द्वारा जांच कर रहे हैं । प्रयोगों विकसित के साथ साथ कैसे कवक पराग के microbiome-प्रावधानों को प्रभावित एक यंत्रवत समझ प्रदान करने के लिए डिजाइन किया गया है । अंततः, इन निष्कर्षों के माध्यम से जो कवक कॉलोनी गिरावट पैदा हो सकता है अप्रत्यक्ष मार्ग पर प्रकाश डाला जाना चाहिए ।

Introduction

प्रबंधित और जंगली मधुमक्खी प्रजातियों में व्यापक गिरावट का सामना कर रहे हैं, दोनों प्राकृतिक और कृषि प्रणालियों के लिए प्रमुख निहितार्थ के साथ1। इस समस्या के कारणों को समझने के लिए ठोस प्रयासों के बावजूद, हनी मधुमक्खी गिरावट ड्राइविंग कारकों अभी भी अच्छी तरह से2,3,4समझ में नहीं आ रहे हैं । जंगली, देशी मधुमक्खियों की कुछ प्रजातियों के लिए, स्थिति गंभीर5,6बन गया है । यदि मधुमक्खी की आबादी तब तक कायम नहीं रह सकती जब वे औद्योगिक कृषि के साथ काटना, उनकी आबादी में गिरावट जारी रहेगी, और परागण (दुनिया भर में उत्पादन7के ३५%) की आवश्यकता वाली फसलें कम फसल सहना होंगी ।

जबकि कई संभावित कारकों जैसे कीटनाशक जोखिम, रोग, और पर्यावास हानि1,4,8,9,10 शहद मधुमक्खी गिरावट में फंसाया गया है, अपेक्षाकृत कम देशी मधुमक्खियों का स्वास्थ्य पर इन तनावों के इंटरैक्टिव प्रभाव के बारे में जाना जाता है, भीतर या कृषि प्रणालियों के पास । कई मौजूदा अनुसंधान के प्रयासों को कीटनाशकों पर ध्यान केंद्रित जारी है, (उदा, neonicotinoids11,12), हालांकि पिछले अनुसंधान इंगित करता है कि कवक भी स्मृति गठन बिगड़ने से मधुमक्खी गिरावट में एक भूमिका निभा सकता है, घ्राण रिसेप्शन13, नेस्ट मान्यता14, एंजाइम गतिविधि और चयापचय कार्य15,16,17. विश्व स्तर पर, कवक खिलने के दौरान फूलों की फसलों के लिए लागू किया जाना जारी है । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि मधुमक्खियों आमतौर पर हाइव18फंजीसाइड अवशेषों को वापस लाने के लिए, वास्तव में, अध्ययन के एक बड़े अनुपात का परीक्षण किया पित्ती फंजीसाइड अवशेषों निहित19,20दिखाया गया है । आगे काम से पता चला है कि फंजीसाइड अवशेषों हनी मधुमक्खी लार्वा मृत्यु दर21,22,23 की उच्च दर के साथ जुड़ा हुआ है और कालोनियों के भीतर "entombed पराग" की उपस्थिति है, जो हालांकि गैर विषैले, माइक्रोबियल गतिविधि से रहित है और पोषण24समझौता किया है । तथ्य यह है कि कवक लंबे समय पर विचार किया गया है "मधुमक्खी सुरक्षित," अब सबूत है कि फंजीसाइड अकेले जोखिम एक देशी bumble मधुमक्खी प्रजातियों में गंभीर कॉलोनी घाटा पैदा कर सकता है के बावजूद, Bombus impatiens25।

फंजीसाइड जोखिम और कॉलोनी मृत्यु दर के बीच करणीय स्थापित करने के लिए, इन रसायनों के ढंग ढंग निर्धारित करने की आवश्यकता है । मिट्टी में सबूत के रूप में26, तलछट27, और जलीय वातावरण28, कवक को लक्षित करके, सबसे अधिक होने की संभावना कवक बहुतायत और पराग के भीतर विविधता-प्रावधानों को बदलने, जिससे एक प्रमुख समुदाय बदलाव लागू है कि दृढ़ता से बैक्टीरिया एहसान कर सकते हैं । कवक प्रतियोगियों या विरोधी के बिना, कुछ रोगजनक बैक्टीरिया अपेक्षाकृत अनियंत्रित पैदा कर सकते हैं, पराग प्रावधानों के बिगाड़ने की सुविधा । पिछले अनुसंधान का प्रदर्शन किया है कि सूक्ष्मजीवों, विशेष रूप से खमीर और रेशा कवक, मधुमक्खियों के लिए पोषण symbionts के रूप में सेवा29,30,31, परजीवी और रोगजनकों के खिलाफ की रक्षा३२ ,३३, और पराग भंडार की लंबी अवधि के संरक्षण प्रदान करते हैं । कवक, इसलिए, अप्रत्यक्ष रूप से यह सेवाएं प्रदान करने के लिए और/या अवसरवादी रोगजनकों के लिए संवेदनशीलता को बढ़ाने के द्वारा की जरूरत है कि माइक्रोबियल समुदाय को बाधित करने से अपरिपक्व मधुमक्खियों को नुकसान हो सकता है और12परजीवी । खाद्य उत्पादन पर बढ़ती मांगों के साथ, दुनिया भर में फसलों के खिलने के दौरान कवक के साथ हर साल छिड़काव किया जा रहा है, ऐसे फंजीसाइड प्रेरित प्रभाव की भयावहता को समझने की जरूरत है ।

करने की तारीख, प्राथमिक ज्ञान देशी मधुमक्खी माइक्रोबियल पारिस्थितिकी से संबंधित अंतराल निंनलिखित प्रश्नों के द्वारा प्रतिनिधित्व किया जा सकता है: किस हद तक फंजीसाइड मधुमक्खी पराग प्रावधानों के भीतर माइक्रोबियल समुदाय परिवर्तन करता है? एक बहुत ही बदल माइक्रोबियल समुदाय के साथ खपत पराग के बहाव के प्रभावों क्या हैं? इन पारिस्थितिकी मुनासिब सवालों के साथ ध्यान में रखते हुए, प्रयोगों 1 खुलासा के प्राथमिक लक्ष्यों के साथ विकसित किया गया था) कि फंजीसाइड अवशेषों अकेले एक देशी मधुमक्खी प्रजातियों में गंभीर कॉलोनी गिरावट का कारण बन सकता है; 2) की डिग्री है जो पराग प्रावधानों में माइक्रोबियल समुदायों को कवक द्वारा बदल रहे हैं, और 3) कैसे मधुमक्खी स्वास्थ्य एक गंभीर रूप से बदल माइक्रोबियल समुदाय से प्रभावित है । प्रायोगिक उद्देश्यों के लिए उपर्युक्त प्रश्नों का पता प्रयोगशाला के संयोजन और क्षेत्र आधारित प्रयोगों का उपयोग परिभाषित किया गया । राज्य के-the-कला metagenomic और क्षेत्र अवलोकन के पारंपरिक तरीकों के साथ आणविक तकनीक का प्रयोग, इस शोध के लिए एक साथ मधुमक्खी के स्वास्थ्य पर कवक के संभावित प्रभाव टुकड़ा करना है ।

इस अध्ययन का पहला उद्देश्य है कि फंजीसाइड जोखिम अकेले देशी मधुमक्खी प्रजातियों के बीच महत्वपूर्ण कॉलोनी नुकसान का कारण बन सकता है प्रदर्शित करने के लिए है । एक बड़े क्षेत्र पिंजरों को शामिल अध्ययन के लिए Bombus impatiens, एक सर्वव्यापी, अमेरिका में प्रचुर मात्रा में देशी मधुमक्खी (चित्रा 1, चित्रा 2, चित्रा 3) के कॉलोनी विकास पर फंजीसाइड जोखिम के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह कल्पना की थी कि फंजीसाइड-इलाज पित्ती कम फिटनेस मौजूद है, और गैर उजागर पित्ती की तुलना में असामान्य जनसांख्यिकी । इस प्रयोग से प्राप्त डेटा इस परिकल्पना का समर्थन किया, कि पराग के भीतर फंजीसाइड अवशेषों का प्रदर्शन एक देशी bumble मधुमक्खी प्रजातियों में गहरा कॉलोनी घाटे का एकमात्र कारण25हो सकता है । इस अध्ययन का दूसरा उद्देश्य पराग microbiome के फंजीसाइड एक्सपोजर की प्रतिक्रिया की जाँच करना है. यह कल्पना की है कि पराग के भीतर रोगाणुओं के समुदाय संरचना-कवक को उजागर प्रावधानों अनुपचारित पराग से अलग हो जाएगा । जबकि कवक बहुतायत और विविधता के लिए काफी गिरावट की उंमीद कर रहे हैं, बैक्टीरिया और/या एक प्रमुख कवक प्रजातियों की संभावना अंय प्रतिस्पर्धा कवक के अभाव में अनियंत्रित हो जाना होगा । इन -vivo परीक्षणों की एक श्रृंखला के माध्यम से, माइक्रोबियल समुदाय संरचना में इन पारियों metagenomics का उपयोग कर विश्लेषण किया जाएगा ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. bumble मधुमक्खी कॉलोनी पर फंजीसाइड एक्सपोजर के प्रभाव की जांच फील्ड पिंजरे प्रयोगों का उपयोग सफलता

  1. एक जई के साथ लगाए मैदान में दस जाल पिंजरों की स्थापना की । प्रत्येक पिंजरे के चारों ओर एक खाई खोदना, और यह सुनिश्चित करने के लिए कि मधुमक्खियों से बच नहीं सकते जमीन में जाल पिंजरे के सभी चार किनारों खोदना । स्टॉक कमरों के साथ पिंजरों, फूल पौधों कि मधुमक्खियों के लिए आकर्षक हो जाना जाता है ( जैसे अनाज, borage, alyssum, ब्रह्मांड, और सूरजमुखी) (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ).
  2. एक ट्रे के साथ पिंजरों के पूरक (३६ सेमी x ४२ सेमी) में खिलने तिपतिया घास । पिंजरे के एक कोने के भीतर क्लस्टर पुष्प संसाधनों, एक स्थान पर कब्जा लगभग २.५ एम एक्स 1 मी. जई द्वारा शेष पिंजरे क्षेत्र वनस्पति ।
  3. बेतरतीब ढंग bumble मधुमक्खी कालोनियों आवंटित, प्रत्येक युक्त श्रमिकों और एक एकल रानी, एक उपचार (फंजीसाइड उपस्थित/ N = उपचार के प्रति 5 कालोनियों, 10 कालोनियों कुल), तो उंहें एक क्षेत्र पिंजरे के भीतर जगह ( N = 1/ -21 जुलाई २०१४).
  4. ओरिएंट कालोनी बक्से ऐसी है कि कॉलोनी & #39; एस दक्षिण की ओर इशारा करने के लिए इष्टतम नौवहन शर्तों के साथ मधुमक्खियों प्रदान करते हैं । चीनी पानी मूत्राशय के साथ कालोनियों घूस देना, पित्त बक्से के अंदर रखा अमृत की उपलब्धता के पूरक हैं ।
  5. एक क्षेत्र पर क्लोरोथेलोनिल आधारित फंजीसाइड लागू-प्रासंगिक स्तर (20 छ/एल) पांच फंजीसाइड उपचार पिंजरों में फूल पौधों को, एक हाथ से आयोजित कीटनाशक स्प्रेयर का उपयोग कर, दो बार अध्ययन के दौरान (0 और 13 दिन) । कोट फूल समान रूप से ऐसी है कि कोई और तरल पुष्प सतहों का पालन करता है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ).
    6. फील्ड केज स्टडी के समापन पर
  6. ने बी impatiens कालोनियों को पिंजरों से हाथ से हटा कर, स् कूल में रखकर छत्ते को-20 & #176; C फ्रीजर के लिए 20 min.
  7. बाँझ संदंश का उपयोग मधुमक्खियों को हटाने और लार्वा की संख्या रिकॉर्ड, कोषस्थों, वयस्क महिलाओं ( मैं . e . चारार), और वयस्क नर । एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर माता रानी, लार्वा, कोषस्थों, वयस्क महिलाओं ( यानी विचारार), और वयस्क पुरुषों के शुष्क वजन रिकॉर्ड ।
< p class = "jove_title" > 2. पराग में माइक्रोबियल समुदायों पर फंजीसाइड एक्सपोजर के प्रभाव की जांच करें-bumble मधुमक्खी घोंसले Vivo परीक्षणों में प्रयोगशाला आधारित का उपयोग कर के प्रावधानों

  1. चूर व्यावसायिक रूप से एक ठीक एक मानक का उपयोग कर पाउडर के लिए खरीदा पराग प्रयोगशाला बॉल-मिल । ७०% इथेनॉल में भिगोने के द्वारा पाउडर पराग निष्फल, यह यूवी प्रकाश के तहत रात भर वाष्पित करने के लिए अनुमति देता है । चढ़ाना द्वारा पराग के बांझपन की पुष्टि ~ ०.५ सामान्य प्रयोजन के आगर मीडिया. पर एमजी
    1. करने के लिए सूखी, निष्फल पराग, निष्फल पिपेट का उपयोग कर, क्षेत्र फंजीसाइड की प्रासंगिक खुराक जोड़ें: प्रोपिकोनाज़ोल पर १४.३%; उपचार के लिए २२.९% पर azoxystrobin (०.७४ & #181; l और ०.६५ & #181; l क्रमशः/ मिश्रित अच्छी तरह से निष्फल लकड़ी की छड़ें का उपयोग कर ।
  2. जगह 6 प्रयोगात्मक पित्ती (n = 3 नियंत्रण और उपचार के लिए प्रत्येक) एक स्वच्छ, स्वच्छ प्रयोगशाला में कमरे के तापमान पर बनाए रखा benchtop । प्रत्येक दिन वजन ४.२७ पराग के जी < सुप वर्ग = "xref" > ३४ , < सुप वर्ग = "xref" > ३५ कवक के साथ मिश्रित (उपचार के लिए) या बाँझ पानी (नियंत्रण के लिए) एक हुड के अंदर मानक रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर.
      जाल गत्ता बॉक्स के पक्ष द्वारा प्रदान की दरवाजे का उपयोग
    1. पित्ती संलग्न, पित्ती के अंदर पराग परिचय । प्रत्येक सप्ताह निष्फल चीनी समाधान के साथ पित्ती के पूरक । चार सप्ताह तक फीडिंग रेट्स जारी रखें ।
  3. लैब आधारित अध्ययन के समापन पर-20 & #176 में रखकर पित्ती को ठंडा करें; सी फ्रीजर के लिए 20 min. बाहर पराग-प्रावधानों के भीतर निहित निष्फल संदंश और spatulas और बाँझ भंडारण ट्यूबों में जगह का उपयोग कर बाहर परिमार्जन । स्टोर पर-८० & #176; ग. गिनती और प्रयोग के प्रारंभ और अंत में श्रमिकों और रानी माँ के वजन (चरण १.७) रिकॉर्ड.
  4. पराग-प्रावधान नमूना व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करने से डीएनए अलग (विवरण के लिए सामग्री तालिका देखें).
    1. जोड़ें पराग के ०.२५ जी-निष्कर्षण ट्यूबों के लिए प्रावधान, संक्षेप में मिश्रण करने के लिए भंवर ।
    2. बनाने के लिए एक २०० मिलीग्राम/एमएल lysozyme समाधान में, पर्याप्त के लिए ५० & #181; L नमूना/ पूरी तरह से हल करने के लिए जोरदार शेक ।
    3. Add ५० & #181; L के lysozyme समाधान के साथ निष्कर्षण ट्यूबों में यह नमूना है, और कई बार पलटने से अच्छी तरह से मिश्रण. 10 मिनट के लिए ट्यूब मशीन में ३७ & #176; C एक जल स्नान में । यदि हाला का गठन हुआ है, तो हीट सॉल्यूशन को ६० & #176; C उपयोग करने से पहले भंग होने तक.
    4. Add ७० & #181; जलीय lysis समाधान के एल निष्कर्षण ट्यूबों के लिए, टेप के साथ एक flatbed भंवर पैड पर क्षैतिज सुरक्षित, और भंवर के लिए 10 min. केंद्रापसारक ट्यूबों के लिए १०,००० एक्स जी में कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए ।
    5. एक साफ 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण । Add २५० & #181; प्रोटीन वर्षा समाधान के एल, और 5 एस के लिए भंवर 4 & #176 पर एक बर्फ स्नान में 5 मिनट के लिए सी ।
      नोट: अपेक्षा के बीच ४०० & #181; l से ५०० & #181; l के supernatant. Supernatant अभी भी कुछ कणों में शामिल हो सकता है ।
    6. १०,००० x g पर 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों केंद्रापसारक, और ६०० के लिए स्थानांतरण & #181; supernatant के एल एक साफ 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब । Add २०० & #181; जलीय अवरोधक हटाने समाधान के एल, भंवर संक्षेप में, और 4 पर मशीन & #176; C 5 min. के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों १०,००० x जी में 1 मिनट के लिए के लिए स्थानांतरण ७५० & #181; supernatant के एल एक साफ 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में ।
    7. जोड १२०० & #181; supernatant के लिए जलीय बांध समाधान के एल, और 5 एस के लिए भंवर लगभग ६७५ & #181 लोड; supernatant के एक स्पिन फिल्टर पर एल, और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक । के माध्यम से प्रवाह त्यागें.
    8. दोहराएँ 2.4.7. दो बार.
      नोट: प्रत्येक नमूना संसाधित करने के लिए तीन लोड की कुल आवश्यक हैं ।
    9. Add ५०० & #181; एल इथेनॉल, और 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर १०,००० x g पर के माध्यम से प्रवाह त्यागें, और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर फिर से केंद्रापसारक में १०,००० x g. Place स्पिन फ़िल्टर में एक साफ 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब.
    10. Add १०० & #181; फिल्टर झिल्ली के केंद्र को रेफरेंस बफर का एल. १०,००० x जी पर 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक स्पिन फ़िल्टर छोड़ें । स्टोर एकत्र डीएनए बीच-20 & #176; ग र-८० & #176; ग
  5. अनुक्रमण के लिए पृथक डीएनए का उपयोग करें ।
    1. यों, और पृथक डीएनए को 2 एनजी/& #181; L को fluorometric विश्लेषण द्वारा सामान्य करना.
      1. प्रत्येक निकाले गए नमूने के लिए तपसिल में प्रतिक्रियाओं को 28S की सापेक्ष मात्रा (संयंत्र) की तुलना करने के लिए तैयार, इसके (कवक) का विश्लेषण, और 16S (बैक्टीरियल) प्रत्येक पराग के घटक-प्रावधान नमूना < सुप वर्ग = "xref" > ३६ . सुनिश्चित करें कि प्रत्येक प्रतिक्रिया कुल डीएनए के 10 एनजी होता है, विषम cyanine डाई आधारित मास्टर मिक्स के 2x, और २.५ & #181; एल फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमरों के प्रत्येक जोड़े 28KJ/28B < सुप वर्ग = "xref" > ३७ फॉर प्लांट एंड ITS1/इसके 5.8 आर फंगल डीएनए के लिए < सुप क्लास = "xref" > 38 .
    2. बढ़ाना डीएनए निम्न पैरामीटर का उपयोग: 2 min pre-विकार पर ५० & #176; c, 2 min प्रारंभिक विकार at ९५ & #176; c, ४० चक्रों का (15 एस at ९८ & #176; c, 15 एस at ५८ & #176; c, ६० s at ७२ & #176; c), जिसके बाद एक वक्र पिघला ।
    3. 16S rRNA V3/V4 चर क्षेत्र और उसके/5.8 s rRNA स्पेसर क्षेत्र को लक्षित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पुस्तकालयों का उपयोग कर एक 2 कदम, नेस्टेड पीसीआर प्रोटोकॉल तैयार करते हैं ।
      1. Add १२.५ & #181; प्रत्येक प्राइमरी और 2x मास्टर मिक्स के 5 pmol को डीएनए का एल. प्रत्येक क्षेत्र के लिए अलग प्रतिक्रियाओं बनाओ (16S या इसके; तालिका 1 देखें) । संशोधित क्षेत्र विशिष्ट प्राइमरों के रूप में पहले से वर्णित < सुप class = "xref" > 39 , < सुप क्लास = "xref" > 40 sequencer-विशिष्ट एडाप्टर को जोड़ने के लिए जीन-विशिष्ट दृश्यों के लिए बदस्तूर न्यूक्लियोटाइड जुगाड़.
      2. निंनलिखित मापदंडों का उपयोग प्रारंभिक प्रवर्धन प्रदर्शन: 3 min प्रारंभिक विकार पर ९५ & #176; ग, के 25 चक्र (30 s at ९५ & #176; c, 30 एस at ५५ & #176; c, 30 एस at ७२ & #176; c), 5 min फाइनल एक्सटेंशन at ७२ & #176; c.
      3. प्रारंभिक प्रवर्धन के बाद, पुस्तकालय का आकार सत्यापित करें, और electrophoretic गतिशीलता द्वारा मात्रा, और एक 1x मात्रा ठोस चरण प्रतिवर्ती आई एम का उपयोग कर साफobilization मोती अवशिष्ट प्राइमरों और रिएक्शन रिएजेंट को हटाने के लिए । पूल 16S और इसके amplicons मात्रात्मक प्रत्येक नमूने के लिए एक एकल amplicon पूल बनाने के लिए.
      4. निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग कर sequencer विशिष्ट एडेप्टर और नमूना विशिष्ट दोहरी अनुक्रमित जोड़ें ( तालिका 1 देखें). Add २.५ & #181; प्रत्येक प्राइमरी और 2x मास्टर मिक्स के 5 pmol को प्रवर्धित डीएनए के एल. निंन पैरामीटर्स का उपयोग करके लायब्रेरी प्रवर्धन करें: 3 min प्रारंभिक विकार at ९५ & #176; c, 8 चक्र के (30 s at ९५ & #176; c, 30 एस at ५५ & #176; c, 30 एस at ७२ & #176; c), 5 min फाइनल एक्सटेंशन at ७२ & #176; c.
    4. निंनलिखित पीसीआर, स्वच्छ समाप्त ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण मोतियों की एक 1 एक्स मात्रा का उपयोग कर पुस्तकालयों । गुणवत्ता और electrophoretic गतिशीलता, और fluorometry, क्रमशः का उपयोग कर समाप्त पुस्तकालयों की मात्रा का आकलन करें । 2 & #181; M और पूल sequencing करने से पहले के लिए पुस्तकालयों का मानकीकरण.
    5. के अनुरूप एक मंच पर अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रदर्शन माध्यमिक पीसीआर में जोड़ा, पूरे amplicon कवर करने के लिए एक उपयुक्त लंबाई के साथ < सुप वर्ग = "xref" > ४१ .
  6. अनुक्रम एनोटेशन और माइक्रोबियल संरचना विश्लेषण ।
    1. युग्म-अंत sequencing डेटा (R1 और R2) सभी अनुक्रम लायब्रेरी के लिए एकल contigs में संयोजित करें । R1 और R2 दोनों फ़ाइलों को मर्ज करने के बाद, प्रत्येक लायब्रेरीज़ के लिए एक एकल फसता फ़ाइल का उत्पादन किया है ।
      नोट: यह चरण और नीचे वर्णित प्रक्रियाओं (जब तक अंयथा इंगित) Mothur संस्करण में किया जाता है 1.38.0 < सुप वर्ग = "xref" > ३८ .
    2. स्क्रीन प्रत्येक फसता अस्पष्ट कुर्सियां, अप्रत्याशित लंबा दृश्यों, और लंबी homopolymers हटाने के लिए फ़ाइल ।
      नोट: स्क्रीनिंग, और अनुक्रम हटाने के लिए पैरामीटर है maxambig = 0, maxlength = ६००, और maxhomop = 8 दोनों जीनों के लिए । समान अनुक्रम निकालें, लेकिन सभी लायब्रेरीज़ (Mothur में उर्फ गणना तालिका) के लिए अलग से एक आकस्मिक तालिका रखें ।
    3. सिल्वा डाटाबेस १२३ संस्करण के खिलाफ जीन 16S पुस्तकालय के अद्वितीय दृश्यों संरेखित करें, और जीन अपने डाटाबेस के खिलाफ अपने पुस्तकालय < सुप वर्ग = "xref" > ४२ .
      नोट: अनुक्रम जीनस स्तर करने के लिए राज्य स्तर से व्याख्या की जानी चाहिए ।
      1. बाद में, क्लस्टर के साथ संरेखित अनुक्रम फ़ंक्शन प्री. क्लस्टर का उपयोग करते हुए = 5, और निकालें chimeras.
    4. वर्गीकृत विधि का उपयोग कर अनुक्रम वांग < सुप वर्ग = "xref" > ४३ सिल्वा (जीन 16S के लिए) पर आधारित है और अपने (जीन के लिए) वर्गीकरण फ़ाइलें (कटऑफ मूल्य ८०%).
      5. R < सुप वर्ग में
    5. लोड = "xref" > 44 Mothur में वर्गीकरण प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न आकस्मिक सारणी (प्रति जीन एक) । प्रत्येक वर्गीकरण स्तर पर, माइक्रोबियल समुदाय परिवर्तन के आगे विश्लेषण के लिए पुस्तकालय प्रति सापेक्ष बहुतायत प्राप्त करते हैं ।
      नोट: प्रत्येक वर्गीकरण स्तर पर, जब सापेक्ष बहुतायत सभी प्रायोगिक दोहरावों के लिए 2% से कम है वर्गीकरण समूहों को एक साथ मर्ज करें ।

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Representative Results

फील्ड केज स्टडी:

पिंजरे प्रयोगों से प्राप्त डेटा से पता चला कि bumble मधुमक्खी कालोनियों फंजीसाइड जोखिम के लिए एक महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया थी । फंजीसाइड-इलाज पित्ती काफी कम श्रमिकों का उत्पादन (१२.२ ± ३.८, मतलब ± एसई) से नियंत्रण पित्ती (४३.२ ± ११.२, एफ1, 9= ६.८, पी = ०.०३) (चित्रा 4) । इसके अतिरिक्त, फंजीसाइड-इलाज पित्ती (०.९१ जी ± ०.१५) के मधुमक्खी बायोमास नियंत्रण पित्ती (२.३६ जी ± ०.५५ की तुलना में काफी कम था; च 1, 9 = ८.३, पृ = ०.०२). फंजीसाइड-इलाज पित्ती में कम बायोमास का यह पैटर्न भी मां रानियों के बीच मनाया गया । क्वींस फंजीसाइड-इलाज पित्ती एक काफी कम बायोमास के साथ प्रस्तुत (०.१४ जी ± ०.०४) नियंत्रण पित्ती की रानियों से (०.२७ जी ± ०.०१; Z = २.५, p = ०.०१) । हालांकि, फंजीसाइड जोखिम लार्वा की संख्या, कोषस्थों, और उपचार भर में पुरुषों को प्रभावित नहीं किया । असतत जीवन चरणों के बायोमास (लार्वा, कोषस्थों, श्रमिकों, और वयस्क पुरुषों) और लार्वा, कोषस्थों, और श्रमिकों के लिए व्यक्तिगत वजन फंजीसाइड-इलाज और नियंत्रण पित्ती भर में कोई फर्क नहीं दिखा ।

प्रयोगशाला आधारित अध्ययन:

प्रयोगशाला-आधारित प्रयोगों से प्राप्त आंकड़ों से संकेत मिलता है कि फंजीसाइड एक्सपोजर, नियंत्रण और फंजीसाइड-इलाज पित्ती से पहले सांख्यिकीय मतलब कार्यकर्ता गिनती (नियंत्रण पित्ती = २८.० ± ३.१; फंजीसाइड-स्वास्थ्यकर्मी पित्ती = ३१.६७ ± २.०; n = 3 प्रत्येक) और रानी वजन (नियंत्रण पित्ती = ०.७७ g ± ०.०४; फंजीसाइड-इलाज पित्ती = ०.७४ ग्राम ± ०.०१) । हालांकि, अध्ययन के अंत में, कार्यकर्ता गिनती नियंत्रण पित्ती (६७.६७ ± ४.३) में काफी अधिक था, फंजीसाइड-इलाज पित्ती (४५.३३ ± ३.८) की तुलना में (t4 = ३.८९, पी = ०.०१) । कार्यकर्ता जनसंख्या ~ १५०% से नियंत्रण पित्ती में फंजीसाइड-इलाज पित्ती में ~ ४५% की तुलना में वृद्धि हुई । इसी तरह, रानी मां के अंतिम वजन नियंत्रण पित्ती (०.७६ छ ± ०.०२) में अपेक्षाकृत अपरिवर्तित रहे एक ~ ३५% फंजीसाइड-इलाज पित्ती (०.४९ ग्राम ± ०.१६) में कमी की तुलना में । एक साथ ले लिया, इन परिणामों को पहले से प्रकाशित परिणाम के साथ संगत कर रहे है25 और कम कार्यकर्ता संख्या और कम रानी मां वजन (चित्रा 5) द्वारा सबूत के रूप में फंजीसाइड जोखिम प्रभावित कॉलोनी स्वास्थ्य संकेत मिलता है ।

पराग के Metagenomic विश्लेषण-प्रावधानों फंजीसाइड-इलाज और नियंत्रण पित्ती (चित्रा 6) से एकत्र माइक्रोबियल समुदायों के बीच अलग मतभेदों का संकेत दिया. एक कमी थी (& #62; ९५%) सामांयतः पृथक Streptomycetales के सापेक्ष बहुतायत में, फंजीसाइड-इलाज पित्ती में Enterobacteriales । दिलचस्प है, इन दोनों समूहों को उनके रोधी गतिविधि और पराग में भूमिका के लिए जाना जाता है-30संरक्षण,४५ भौंरा छत्ता वातावरण के भीतर । आदेश Rickettsiales, जो arthropods के आम रोगजनकों शामिल है के जीवाणु सदस्यों४६, फंजीसाइड पित्ती का इलाज में बहुत अधिक बहुतायत दिखाया । फंजीसाइड-इलाज पित्ती कवक के आदेश Eurotiales और Sordariales से संबंधित एक कम बहुतायत था, और आदेश के एक उच्च बहुतायत Capnodiales और Ascosphaerales पित्ती नियंत्रण की तुलना में (चित्रा 7) । के रूप में की उंमीद है, दोनों बैक्टीरिया और कवक के लिए, शैनन के विविधता सूचकांक (एच) और समानता (ई) नियंत्रण की तुलना में फंजीसाइड-इलाज पित्ती में कम था, हालांकि इन मतभेदों को सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं थे (बैक्टीरिया: एच नियंत्रण पित्त ी =१.२५ ± ०.३, एचफंजीसाइड-इलाज पित्त ी = ०.८२ ± ०.२, ईनियंत्रण पित्त ी = ०.४६ ± ०.१; ईफंजीसाइड-इलाज पित्त ी = ०.३१ ± ०.१; कवक: एचनियंत्रण पित्त ी =०.९९ ± ०.३, एचफंजीसाइड-इलाज पित्त ी = ०.७२ ± ०.४, ईनियंत्रण पित्त ी = ०.५७ ± ०.२; ईफंजीसाइड-इलाज पित्त ी = ०.४२ ± ०.२) । हालांकि इस तरह के समुदाय बदलाव के चयापचय और कार्यात्मक प्रभाव का ब्यौरा इस अध्ययन के दायरे से परे था, कॉलोनी गिनती के साथ संयुक्त, और वजन डेटा, इन परिणामों का सुझाव है कि फंजीसाइड जोखिम कॉलोनी स्वास्थ्य में गिरावट को प्रभावित कर सकता है मधुमक्खियों और पराग microbiome के बीच सहजीवन में खलल डालना । लार्वा उत्तरजीवी को प्रभावित विशिष्ट माइक्रोबियल समूहों की भूमिका में आगे की जांच बेहतर स्वस्थ मधुमक्खी आबादी को बनाए रखने में पराग microbiome की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए सिफारिश की है ।

Figure 1
चित्रा 1: अंदर एक Bombus impatiens घोंसला. चिंता कोशिकाओं के लिए कर रहे कार्यकर्ताओं की उच्च संकल्प छवि । चिंता कोशिकाओं को किसी भी समय कई अंडे और लार्वा शामिल कर सकते हैं । पराग-प्रावधानों को कक्ष में आवधिक रूप से पेश करने पर लार्वा फ़ीड का विकास करना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: बड़े क्षेत्र के पिंजरों मधुमक्खी कालोनियों घर के लिए खड़ा किया । प्रत्येक मेष पिंजरे (N = 10) एक व्यावसायिक रूप से खरीदा Bombus impatiens छत्ता, साथ ही में खिलने संयंत्र प्रजातियों मधुमक्खियों को आकर्षित करने के लिए जाना जाता के साथ शेयर किया गया था । फूल पिंजरे के एक कोने में रखता था और शेष क्षेत्र जई घास के साथ वनस्पति था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: हाल ही में छिड़काव सूरजमुखी पर फंजीसाइड अवशेष । फंजीसाइड के क्षेत्र प्रासंगिक खुराक 0 दिन और प्रयोग के 13 पर छिड़काव किया गया । एक कीटनाशक स्प्रेयर का उपयोग करके, फूल को चारा मधुमक्खियों के साथ सीधे संपर्क से बचने के लिए शाम को एक फंजीसाइड समाधान के साथ समान रूप से लेपित किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: पिंजरे प्रयोग में bumble मधुमक्खियों पर फंजीसाइड अवशेषों के प्रभावों । bumble मधुमक्खी कालोनियों कि पराग पर फंजीसाइड अवशेषों को उजागर किया गया कॉलोनी के आकार में महत्वपूर्ण गिरावट प्रदर्शित (रिडक्टवयस्क महिला बहुतायत में आयनों) एक ही महीने के दौरान । त्रुटि पट्टियां ± 1SE का प्रतिनिधित्व करती हैं; प & #60; ०.०५. यह आंकड़ा Bernauer एट अल से संशोधित किया गया था । 25. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एक प्रयोगशाला में bumble मधुमक्खियों पर फंजीसाइड अवशेषों के प्रभावों पर आधारित प्रयोग । bumble मधुमक्खी कालोनियों कि फंजीसाइड को उजागर किया गया इलाज पराग कॉलोनी आकार में महत्वपूर्ण गिरावट आती है (वयस्क कार्यकर्ता बहुतायत में कटौती) और रानी मां के वजन में गिरावट का प्रदर्शन एक ही महीने के दौरान । त्रुटि पट्टियां ± 1SE का प्रतिनिधित्व करती हैं; पी = ०.०३ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: फंगल और बैक्टीरियल विविधता के metagenomic वर्गीकरण के पाइ चार्ट क्रम रैंक पर । विश्लेषण के आधार पर (क) 16S और (ख) पराग-प्रावधान नमूनों के नियंत्रण और फंजीसाइड-उपचारित पित्ती से एकत्र किए गए इसके आधार पर वर्गीकरण. नियंत्रण पित्ती उच्च विविधता और माइक्रोबियल वितरण में भी प्रदर्शन किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: फंजीसाइड एक्सपोजर के जवाब में आदेश में प्रतिशत परिवर्तन बैक्टीरिया और कवक के सापेक्ष बहुतायत रैंक । का उपयोग कर माइक्रोबियल समुदायों के Metagenomic वर्गीकरण (ए) 16S और (ख) इसके आधार प्राइमरों कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्राइमरी जोड़ी प्राइमरी टाइप प्राइमरी सीक्वेंस
28KJ/28B प्लांट GGC GGT एएए टीटीसी CGT सीसी/
CGT CCG TGT टीटीसी AAG ACG
ITS1/इसके 5.8 फफूंद टीसीसी GTA GGT गाा CCT GCG G/
झूठ एटीसी CGT टीजीटी TGA AAG टीटी
16s फॉरवर्ड/ नेस्टेड बैक्टीरियल 5 '-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTACGGGNGGCWGCAG-3 '/
5 '-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3 '
ITS1F प्राइमरी ITS4/ नेस्टेड फंगल 5 '-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '
5 '-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '
अनुकूलक प्राइमर 5 '-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC [55555555]
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '
5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [77777777]
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3 '

तालिका 1: डीएनए प्रवर्धन में प्रयुक्त प्राइमरी जोड़े और प्राइमरी दृश्यों की सूची. संदर्भ के लिए पाठ देखें ।

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Discussion

मधुमक्खी के स्वास्थ्य पर कवक के प्रभाव में जांच कीट प्रबंधन रणनीतियों के एक अध्ययन पहलू बनी हुई है । हमारे अध्ययन का उद्देश्य है कि स्पष्ट रूप से संभावित मधुमक्खी गिरावटें ड्राइविंग कारकों को अलग पूरक तकनीकों का एक सूट का उपयोग करके इस ज्ञान अंतर पुल । योजना, औचित्य, और इन प्रयोगों के प्रतिपादन नीचे विस्तृत रहे हैं ।

यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि कोई मधुमक्खियों पिंजरे प्रयोगों के जाल से बचने के लिए अनुमति दी जाती है, क्योंकि यह जनसांख्यिकी विश्लेषण समझौता होगा । यह भी महत्वपूर्ण है कि कृत्रिम घोंसले पर्याप्त इंसुलेशन बारिश और सीधे सूरज की रोशनी से बचाने के लिए है । ध्यान रखा जाना चाहिए ताकि सीधे घोंसलों पर कवक का छिड़काव न किया जाए । कालोनियों को चीनी जल मूत्राशय के साथ इकट्ठा अमृत पूरक और निर्जलीकरण को रोकने के साथ प्रदान किया जाना चाहिए ।

भोजन परीक्षण आधारित प्रयोगशाला के लिए, सख्त रोकनेवाला स्थितियों जब पराग भोजन तैयार करने के लिए संक्रमण को रोकने के लिए बनाए रखा जाना चाहिए । व्यावसायिक रूप से खरीदा पराग पाउडर और यूवी का उपयोग करने से पहले निष्फल किया जाना चाहिए । छत्ता स्वच्छता ऐसे पेंट्री पतंगों और एक प्रकार की मछली के रूप में बाहरी परजीवी से संक्रमण को रोकने के लिए बनाए रखा जाना चाहिए । द्रव मूत्राशय निष्फल चीनी समाधान के साथ पूरक होना चाहिए निर्जलीकरण को रोकने के लिए । पूर्व उपचार जनगणना के लिए, देखभाल अत्यधिक हैंडलिंग से तनाव मधुमक्खियों और उंहें लंबे समय तक के लिए छत्ते के बाहर रखने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए ।

के रूप में डीएनए उपज उंर और सामग्री शुरू करने के प्रकार पर निर्भर करता है, केवल ताजा या अच्छी तरह से जमे हुए नमूनों डीएनए निष्कर्षण और प्रवर्धन में इस्तेमाल किया जाना चाहिए । डीएनए निष्कर्षण के लिए नमूना वजन ०.२५ ग्राम से अधिक नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह डीएनए उपज कम हो जाएगा । डीएनए पैदावार जेल ट्रो का उपयोग मात्रा होना चाहिए । अग्रिम electrophoretic ठहराव अलग डीएनए के qPCR प्रतिक्रियाओं के लिए आगे बढ़ने से पहले महत्वपूर्ण है कुशल प्रवर्धन४७सुनिश्चित करने के लिए ।

metagenomic विश्लेषण के लिए, माइक्रोबियल गतिशील का एक अधिक व्यापक विश्लेषण के लिए व्याख्या अनुक्रम की राशि को सीमित द्वारा प्राप्त किया जा सकता है (अनुक्रम के बीच संतोषजनक मतभेदों के अंश आराम से) और वर्गीकरण समूहों की संख्या को कम करने, के रूप में वैसे विलय के रूप में जो रिश्तेदार बहुतायत काफी कम है (& #60; 2%) ।

रूढ़िवादी नमूना आकार (N = 5 दोनों फंजीसाइड इलाज और अनुपचारित पिंजरे अध्ययन पित्ती) के लिए डेटा, जो अधिक से अधिक प्रतिकृति का उपयोग करके भविष्य के अध्ययनों में कम हो जाएगा में विचरण फुलाना कर सकते हैं । अधिक से अधिक संकल्प और परिणामों के लिए सांख्यिकीय शक्ति जोड़ने के लिए, मधुमक्खी कालोनियों की जनगणना की जाएगी और पहले और फंजीसाइड जोखिम के बाद तौला । अब समय के लिए पिंजरे प्रयोग रनिंग नई क्वींस, जो एक अतिरिक्त प्रतिक्रिया चर के रूप में सेवा कर सकते है के उत्पादन की अनुमति होगी । वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए इन संशोधनों के साथ, भविष्य के अध्ययन पित्ती जनसंख्या गतिशीलता के बारे में अधिक से अधिक विवरण प्रदान करेगा ।

पराग के hydrophobic प्रकृति अपने कुशल पानी के साथ मिश्रण को रोकते हैं । चूर और एक ठीक पाउडर, मिश्रण की प्रक्रिया में एड्स के लिए पराग granules झारना । पराग पाउडर की मात्रा वांछित संगति प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । देखभाल के लिए अच्छी तरह से तरल पदार्थ (पानी या फंजीसाइड) मिश्रण करने के लिए सक्रिय अवयवों का एक समरूप वितरण प्राप्त करने के लिए और यहां तक कि चारा के लिए वितरण लिया जाना चाहिए ।

के रूप में अतिरिक्त डीएनए पीसीआर प्रतिक्रियाओं को बाधित कर सकते हैं, यह सिफारिश की है कि नमूना से अधिक वजन नहीं करना चाहिए ०.२५ जी अत्यधिक भंवर इस कतरनी डीएनए के रूप में बचना चाहिए, उपज कम । कम डीएनए उपज भी lysis बफर के लिए लंबे समय तक निवेश का एक परिणाम हो सकता है । बैक्टीरियल प्राइमरों अधिमानतः 16S rRNA के V7-V9 क्षेत्र से चुना जाना चाहिए chloroplast डीएनए के गैर विशिष्ट प्रवर्धन को कम करने के लिए४८। इसके अलावा, इस तरह के 18S राइबोसोमल आरएनए जीन के रूप में अन्य जीनों के अनुक्रमण, पराग में माइक्रोबियल विविधता की एक बेहतर समझ प्रदान कर सकते हैं, साथ ही फंजीसाइड उपयोग पर जनसंख्या परिवर्तन.

Mothur के साथ प्रक्रिया करने के लिए पुस्तकालयों की राशि को देखते हुए, कंप्यूटिंग समय काफी अधिक हो सकता है । singletons निकालना जब एक दूसरे के खिलाफ दृश्यों की तुलना (यदि कंप्यूटिंग संसाधन सीमित हैं, उंहें कल्पना निस्पंदन से पहले हटा) काफी आवश्यक समय परिचालन वर्गीकरण इकाइयों कंप्यूटिंग के लिए कम कर सकते हैं ।

पिंजरे प्रयोगों मधुमक्खियों के प्राकृतिक उड़ान रेंज सीमित (के रूप में उंहें करने के लिए परिदृश्य भर में व्यापक रूप से चारा देने का विरोध), और यह डिग्री है जो इस तरह के प्रतिबंध प्रतिक्रिया चर प्रभावित कर सकते है स्पष्ट नहीं है । हालांकि नियंत्रण और उपचार पिंजरों बायोटिक और अजैव चर की एक ही श्रृंखला का अनुभव, यह एक पिंजरे के भीतर microenvironment के लिए नियंत्रित करने के लिए रसद असंभव है ।

के भीतर समुदाय माइक्रोबियल बातचीत के सच गुंजाइश अभी तक बहुत जटिल है और प्रयोगात्मक परीक्षणों के माध्यम से दोहराने के लिए जटिल है । जबकि हमारे डेटा की संभावना पराग-प्रावधानों के भीतर कुल माइक्रोबियल विविधता का एक सबसेट दस्तावेज़, यह इंटरैक्टिव प्रभाव है कि बैक्टीरिया और उपस्थिति में कवक के बीच प्रबल हो सकता है में पहली अंतर्दृष्टि है/

संरेखित अनुक्रम४९ या कार्यात्मक चयापचय पराग बैक्टीरियल विविधता५० के आधार पर राज्यों की भविष्यवाणी के लिए वैकल्पिक डेटाबेस का उपयोग पराग microbiome का एक व्यापक दृश्य प्रदान कर सकते हैं । अंत में, बेहतर चयापचय और फंजीसाइड आवेदन के बाद माइक्रोबियल समुदायों के कार्यात्मक गतिशील विशेषताएं, पराग microbiome के पूरे जीनोम अनुक्रमण आवश्यक है ।

पिंजरे व्यावसायिक रूप से खरीदा पित्ती का उपयोग प्रयोग एक अर्द्ध नियंत्रित सेटिंग में प्रतिक्रिया चर को मापने के लिए सबसे अच्छा चौखटे में से एक प्रदान करते हैं । ' मधुमक्खियों प्राकृतिक पारिस्थितिकी (चारा दक्षता, सामाजिक संरचना, वंश देखभाल) के लिए ंयूनतम परिवर्तन के कारण, पिंजरे प्रयोगों तरक़ीब और तनाव को कम करने, प्रयोगशाला आधारित के दौरान कृत्रिम पर्यावरण और मैनुअल हैंडलिंग द्वारा शुरू प्रयोगों.

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, कोई अध्ययन अभी तक पराग के भीतर माइक्रोबियल सामुदायिक गतिशीलता पर कवक के प्रभाव का आकलन करने के लिए आयोजित किया गया है bumble मधुमक्खियों का प्रावधान । कवक के संपर्क में एक या अधिक संवेदनशील प्रजातियों को समाप्त कर सकते हैं, फफूंद और बैक्टीरिया के बीच पारिस्थितिक संघर्ष विराम को बाधित । एक क्रूसिबल के रूप में क्षेत्र और प्रयोगशाला आधारित परीक्षणों का प्रयोग इन बातचीत खेलने के लिए, इस अध्ययन का उद्देश्य है कि निवासी माइक्रोबियल प्रजातियों के तबाही पराग microbiome, जो बारी समझौता मधुमक्खी स्वास्थ्य में हो सकता है की पारिस्थितिकी संतुलन बिगाड़ना कर सकते है प्रदर्शन करना है ।

संस्कृति जैसे कमजोर पड़ने और मानक मीडिया पर चढ़ाना पर निर्भर तकनीक पर कब्जाकेवल दिए गए वातावरण से माइक्रोफ्लोरा का एक अंश । यह माइक्रोबियल विविधता का एक सकल प्रतिनिधित्व करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और unculturable रोगाणुओं जा सकता है न पता चला५१। सूक्ष्मजीवों की चौड़ाई का अध्ययन करने के लिए, वैज्ञानिकों संस्कृति स्वतंत्र तकनीक है, जो अधिक समावेशी और व्यापक हैं, उदाहरण के लिए metagenomic विश्लेषण और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए पर भरोसा करना चाहिए । इन शक्तिशाली आणविक तकनीकों से भारी ड्राइंग, इस अध्ययन के लिए पराग microbiome में अधिक से अधिक संकल्प प्राप्त करने के उद्देश्य से पारंपरिक संस्कृति आधारित अकेले तकनीक द्वारा प्रदान की है ।

इस अध्ययन से परिणाम bumble मधुमक्खी फंजीसाइड को उजागर कालोनियों के भीतर श्रमिकों की संख्या में गहरा नुकसान का पता चला है । एक bumble मधुमक्खी कॉलोनी के लिए सफल होने के लिए, श्रमिकों के लिए पर्याप्त संसाधनों और माता रानी और विशेष रूप से लार्वा के विकास के लिए देखभाल प्रदान करने की आवश्यकता है । अंत में, कॉलोनी के लक्ष्य के लिए संसाधन पर कब्जा (पराग और अमृत) इस तरह की है कि कई बेटी के रूप में संभव के रूप में क्वींस गर्मियों के अंत तक उत्पादन किया जा सकता है अधिकतम है । स्वस्थ बेटी-रानियां एक कॉलोनी के लिए फिटनेस के उपाय हैं । श्रमिकों में बड़ी कटौती है, तो, प्रभावी रूप से कॉलोनी के अगले वर्ष के लिए क्वींस उत्पादन करने की क्षमता में कटौती । इस अध्ययन में, न केवल कार्यकर्ता संख्या में काफी कमी आई थी, लेकिन मां फंजीसाइड से क्वींस कम बायोमास के साथ प्रस्तुत पित्ती का इलाज, शायद विचारार द्वारा अपर्याप्त खाद्य आपूर्ति का एक परिणाम के रूप में । पराग प्रावधानों के भीतर माइक्रोबियल बातचीत की जटिलता को देखते हुए, यह कवक और इन नमूनों में योगदान बैक्टीरिया के बीच सटीक इंटरैक्टिव प्रभाव विचार करना कठिन है । हालांकि, यहां वर्णित के रूप में दोहराया और दोहराया प्रयोगों से व्युत्पंन परिणाम, इन दो माइक्रोबियल समूहों के बीच स्थानांतरण symbioses में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा (चाहे प्रतिस्पर्धी, mutualistic, या खानेवाला) xenobiotic तनाव के जवाब में, और पराग microbiome पर इसके बहाव प्रभाव ।

शक्तिशाली आणविक उपकरणों के उपयोग के माध्यम से, पराग microbiome की पारिस्थितिकी जटिलता बेहतर हल किया जा सकता है । प्रारंभिक समझ प्राकृतिक रूप से होने वाली बैक्टीरिया और कवक के एक बहुतायत से पता चलता है, सामूहिक रूप से कॉलोनी फिटनेस बनाए रखने में योगदान । विशेष रूप से, खमीर कि पराग प्रावधानों से अलग थे जीवाणुनाशक और fermentative गुण सहन करने के लिए जाना जाता है, दोनों जिनमें से लार्वा मधुमक्खियों के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस तरह के पारिस्थितिक संघों मधुमक्खियों और उनके पराग microbiome के बीच पारस्परिक के एक उच्च स्तर के सुझाव हैं । पराग-प्रावधानों, इसलिए, एक आपात विविधता प्रभाव का प्रतिनिधित्व करते हैं, के बारे में एक माइक्रोबियल समुदाय की खेती प्रमुख कार्यात्मक भूमिकाओं के शामिल द्वारा लाया । इन प्रमुख symbionts के अभाव में पराग-प्रावधान में अज्ञात अंशों का समझौता प्रतीत होता है. इस दिशा में काम जारी रखा, संभावना इन रोगाणुओं के कार्यात्मक विविधता की व्याख्या करेगा और मधुमक्खी symbionts के रूप में उनकी भूमिका नकाब उतारना ।

हाल के अनुसंधान के रूप में19,24,५२,५३,५४मधुमक्खियों को हानिरहित होने के रूप में कवक की धारणा को खारिज कर दिया है । इस अनुसंधान का उद्देश्य मधुमक्खियों पर फंजीसाइड प्रभावों ड्राइविंग तंत्र को अलग करने के लिए है, जिससे फंजीसाइड उपयोग और मधुमक्खी गिरावट के बीच कारण प्रभाव संबंध रोशन । अवधारणा है कि मधुमक्खी सूक्ष्म symbioses पराग में फंजीसाइड अवशेषों द्वारा काफी बदल दिया जा रहा है चारों ओर परिकल्पना केंद्र । अंततः, यह काम फिर से कैसे कवक देखा और कृषि और शहरी वातावरण में इस्तेमाल किया जाता है फ्रेम होगा । मौजूदा वैश्विक परागण संकट के प्रकाश में, प्रस्तावित अनुसंधान देशी मधुमक्खी पारिस्थितिकी पर नए ज्ञान उत्पंन, के रूप में यह कृषि उत्पादन प्रथाओं से संबंधित है । कवक पिछले agrichemical समूह रहने के लिए प्रभावी रूप से खिलने के दौरान फसलों के लिए आवेदन सीमित नियमों से मुक्त हो । नतीजतन, दोनों प्रबंधित और जंगली मधुमक्खियों लगातार कवक को उजागर कर रहे हैं । साहित्य की बढ़ती शरीर से पता चलता है कि, हालांकि कवक संपर्क पर मधुमक्खियों के लिए घातक नहीं हैं, ऊंचा खुराक पर, जोखिम काफी हानिकारक है, उच्च लार्वा मृत्यु दर21 और बदल विचारार व्यवहार करने के लिए अग्रणी । आशा है कि यह काम तंत्र (ओं) से रोशन होगा जिसके द्वारा कवक परागण को नुकसान पहुंचा रहे हैं । इसके अलावा, इस अनुसंधान समझदार कीट प्रबंधन नीति के आधार फार्म और सर्वोत्तम प्रबंधन प्रथाओं के उत्पादकों को सूचित करेंगे । इस काम में सुधार कीटनाशक छिड़काव के लिए दिशानिर्देश देने में भी सहायक होगा, जो कीटनाशक कानूनों और विनियमों को प्रभावित कर सकता है । अधिक मोटे तौर पर, इन निष्कर्षों किसी भी प्रबंधित पारिस्थितिकी तंत्र में जो फूल पौधों पराग द्वारा दौरा कर रहे है कीड़ों का संग्रह करने के लिए प्रासंगिक हो जाएगा । मधुमक्खी के वैश्विक अनुमान के साथ विशिष्ट परागण सेवाओं असाधारण उच्च५५जा रहा है,५६, अगर यह काम मधुमक्खी की आबादी की कमी को कम कर सकते हैं, संभावित प्रभावों पर्याप्त होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक (ओं) के साथ तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए प्रवर्धन और अनुक्रमण सुविधाओं और सेवाओं, केटलीन कार्लसन, जेनिफर आदत, जेक ओटो, और अधिकतम हास प्रदान करने के लिए विस्कॉंसिन जैव प्रौद्योगिकी केंद्र डीएनए अनुक्रमण सुविधा के विश्वविद्यालय का धंयवाद आणविक विश्लेषण । यह काम USDA-कृषि अनुसंधान सेवा विनियोजित कोष द्वारा समर्थित (वर्तमान अनुसंधान सूचना प्रणाली #3655-21220-001) था । इसके अतिरिक्त समर्थन राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा प्रदान किया गया (अनुदान सं. देब-१४४२१४८), डो ग्रेट झीलों ऊर्जा अनुसंधान केंद्र (विज्ञान के डो कार्यालय मांक DE-FC02-07ER64494), और USDA राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान (हैच परियोजना १००३२५८) । C.T.H. जैव चिकित्सा विज्ञान में एक बेंच विद्वान और एक अल्फ्रेड Toepfer संकाय साथी, बेंच चैरिटेबल ट्रस्ट और अलेक्जेंडर वॉन पीरु फाउंडेशन, क्रमशः द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR

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References

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Steffan, S. A., Dharampal, P. S.,… More

Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).

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