Abstract
Het lichaam van een zoogdier is uitgerust met verschillende lagen van de mechanismen die helpen om zich te verdedigen tegen pathogeen invasies. Professionele fagocyten van het immuunsysteem - zoals neutrofielen, dendritische cellen en macrofagen - behouden aangeboren vermogen te detecteren en te verwijderen zoals binnendringende ziekteverwekkers tot fagocytose 1. Fagocytose omvat gechoreografeerde gebeurtenissen membraan reorganisatie en actine remodellering op het celoppervlak 2, 3. Fagocyten succes internaliseren en de uitroeiing van buitenlandse moleculen alleen wanneer alle fasen van de fagocytose is voldaan. Deze stappen omvatten herkenning en binding van het pathogeen door receptoren patroonherkenning (PRRS) verblijvend aan het celoppervlak, vorming van fagocytische cup doorgaande actine verrijkte membraneuze uitsteeksels (pseudopods) het deeltjesvormige omringen en splitsing van de phagosome vervolgens fagolysosoom rijping dat resultaten in dehet doden van de ziekteverwekker 3, 4.
Imaging en kwantificatie van de verschillende stadia van fagocytose is een randvoorwaarde voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van dit proces in de cel. Dit manuscript rapporteert methoden om de verschillende fasen van fagocytose bestuderen. We beschrijven een microscoop-gebaseerde aanpak te visualiseren en kwantificeren van de binding, vorming fagocytische cup, en de internalisering van deeltjes door fagocyten. Zoals fagocytose ontstaat wanneer aangeboren receptoren op fagocyten tegenkomen liganden op een doeldeeltje groter dan 0,5 urn, de assays hier geïntroduceerde omvatten het gebruik van pathogene schimmels Candida albicans en andere deeltjes zoals zymosan en IgG-beklede parels.
Introduction
Ondanks de continue blootstelling aan pathogenen zoals bacteriën, virussen en schimmels, is het lichaam goed uitgerust met immuun mechanisme dat bescherming tegen infectie. Het aangeboren immuunsysteem is de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende ziekteverwekkers en vertrouwt vooral op fagocytische cellen die herkennen en internaliseren buitenlandse doelen.
Fagocytose is een evolutionair geconserveerd cellulaire proces dat de engulfment van ongewenste deeltjes groter dan 0,5 micrometer omvat. Fagocytische cellen brengen uiteenlopende immuunreceptoren (ook bekend als receptoren patroonherkenning, PRRS) aan het celoppervlak waarmee zij pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) aanwezig op pathogenen vóór verzwelging 3 herkennen. Pathogeen binding wordt gevolgd door clustering receptor op het celoppervlak en veroorzaakt de vorming van een fagocytische cup. Dit resulteert in-actine aangedreven membraan remodeling dat uitsteekt rondhet doel, uiteindelijk omhult het en knijpen-off om een discrete phagosomal vacuole 2, 5 vormen. De phagosome dan rijpt en verzuurt door latere fusie met late endosomen en lysosomen dat fagolysosoom 6 vormt.
Hoewel fagocytose wordt beschreven als receptor-gemedieerde en-actine aangedreven geval dit proces berust ook op spatiotemporeel modificatie van lipiden die het plasmamembraan samenstellen zoals phosphoinositides (PI) en sfingolipiden 7, 8. Terwijl actine polymerisatie wordt gedicteerd door een lokale ophoping van fosfoinositol-4,5-bifosfaat (PI (4,5) P2) aan de basis van de fagocytische cup, actine depolymerisatie afhankelijk van de omzetting van (PI (4,5) P 2 tot fosfoinositol-3,4,5-bifosfaat (PI (3,4,5) P3) 3, 9. Beide modificatieszijn essentieel als de eerstgenoemde leidt tot succesvolle uitbreiding van pseudopods rond het doel en deze maakt zinkende deeltjes in het cytosol van de fagocyt 10.
Cellen die het vermogen tot fagocytose hebben ofwel professionele fagocyten, zoals macrofagen / monocyten, granulocyten / neutrofielen en dendritische cellen (DC's) of niet-professionele fagocyten, zoals fibroblast epitheelcellen en 11. Fagocytose uitgevoerd door alle fagocyten speelt een centrale rol in het weefsel onderhoud en verbouwing, terwijl fagocytose uitgevoerd door professionele fagocyten is verantwoordelijk voor de coördinatie van het aangeboren en adaptieve immuunrespons tegen ziekteverwekkers. Professionele fagocyten niet alleen presenteren antigenen overspoelen en doodt de ziekteverwekker, maar ook de lymfoïde cellen van het adaptieve immuunsysteem. Dit draagt bij aan het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokines en de betrokkenheid van lymfoïde cellen, wat tot gevolgsuccesvolle blokkade van infectie 12.
Conventionele biochemische technieken zijn instrumenteel bij het verkrijgen van kennis over de moleculaire mechanismen van verschillende cellulaire processen tijdens fagocytose, zoals post-translationele modificaties en diverse hoge-affiniteit associaties tussen eiwitten zijn. Het is echter moeilijk om informatie over de ruimtelijke en temporele dynamica van fagocytische gebeurtenissen met de conventionele biochemische werkwijzen te verkrijgen. Live-cell imaging niet alleen stelt ons in staat om cellulaire gebeurtenissen in een tijd gevoelige manier te controleren, maar ook stelt ons in staat om informatie in te winnen bij een enkele cel niveau. Hier beschrijven we een methode om de verschillende stadia van fagocytose te onderzoeken, alsmede het gehele proces spatiotemporeel geanalyseerd met behulp van confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van DC2.4 en RAW 264,7 cellijnen
LET OP: De macrofaag-achtige cellijn RAW 264.7 en de dendritische cel lijn DC2.4 zijn beide muizen oorsprong, en de volgende voorwaarden werden gebruikt om de cellen groeien.
- RAW 264,7 cellen groeien in DMEM (Dulbecco's Minimal Eagle's medium) aangevuld met 10% geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Groeien DC2.4 cellen in vergelijkbare omstandigheden met die van RAW 264.7 cellen, met uitzondering van het gebruik RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium aangevuld met L-glutamine in plaats van DMEM.
2. Bereiding van fluorescerende geconjugeerde Deeltjes: C. albicans, Zymosan, IgG-beklede kralen
- Groeiende Candida albicans
- Enten C. albicans stam SC5314 uit een bevroren glycerol voorraad in 25 ml YPD, aangevuld met Uri (2% Bacto-pepton, 1%gistextract, 2% glucose en 80 ug / ml uridine) overnacht bij 30 ° C.
LET OP: Vermijd de groei van de Candida cultuur meer dan een OD 600 van 12. - Neem 1 ml van C. albicans en spin neer bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet met 1 ml PBS.
- Verzamel het pellet door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Herhaal stap 2.1.4.
- Bereken de multipliciteit van infectie (MOI) van C. albicans in verhouding tot het aantal fagocyten en de procedure voor fagocytose assay zoals beschreven in sectie 3. Een OD 600 van 1 equivalent is aan 2,5 x 10 7 Candida albicans per 1 ml.
OPMERKING: Genereren van Candida-BFP wordt gegeven in referentie 13.
- Enten C. albicans stam SC5314 uit een bevroren glycerol voorraad in 25 ml YPD, aangevuld met Uri (2% Bacto-pepton, 1%gistextract, 2% glucose en 80 ug / ml uridine) overnacht bij 30 ° C.
- Bereiding van Zymosan en IgG-beklede kralen
OPMERKING: Zymosan een β-glucan bevattendeschimmel koolhydraten deeltjes voorbereiding die afgeleid van Saccharomyces cerevisiae. Zymosan is bekend inflammatoire signalen in macrofagen en dendritische cellen te roepen, en het is uitgebreid gebruikt in fagocytose studies 13, 14, 15.- Kort vortex de buis die de deeltjes bevat, en aliquot een hoeveelheid die voldoende is voor een experiment in een 1,5 ml buis.
OPMERKING: Gewoonlijk gebruiken we 01:10 verhouding (één cel, voeg 10 zymosan deeltjes of IgG-beklede korrels). - Voeg 1 ml ijskoude PBS, en verzamel de deeltjes door centrifugeren gedurende 1 min bij 10.000 x g.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude PBS.
- Herhaal de stappen 2.2.2-2.2.3
LET OP: Ga verder met punt 2.2.5 of bewaar de buis bij 4 ° C tot gebruik. - Ultrasone trillingen de deeltjes gedurende 10 seconden ultrasone badsonicator (120 V, 50-60 kHz) om een voorkomenny deeltje aggregatie.
- Kort vortex de buis die de deeltjes bevat, en aliquot een hoeveelheid die voldoende is voor een experiment in een 1,5 ml buis.
3. Fagocytose
OPMERKING: Fagocytose is een complex proces dat begint met de binding van de deeltjes op het celoppervlak van de fagocyten door interactie van PRRS met liganden op het oppervlak van het deeltje. Binding wordt gevolgd door het samenstel van actine en de bijbehorende eiwitten op het contactoppervlak en de vorming van een fagocytische cup. De daaropvolgende actine demontage vindt plaats op het phagosome en leidt tot volledige engulfment van de deeltjes. Hieronder beschrijven we de verschillende stadia van fagocytose.
- binding Assay
Opmerking: Het doel van dit experiment is de eerste stap van fagocytose die de interactie tussen de liganden op het doel deeltjes en de receptoren op de fagocyten gaat volgen.- Zaad ongeveer 5 x 10 4 cellen in een kamer zo in dat ze 60-70% confluent ten tijde van het experiment. Alterntief, plaat cellen op dekglaasjes (in 24- of 12-well formaat) of glazen bodem 96-putjesplaten. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2.
OPMERKING: Cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer of soortgelijke techniek. - Plaats de kamer schuif (of plaat) bij 10 ° C gedurende 10 minuten.
- Voorzichtig het medium te verwijderen uit elk putje met behulp van een pipet of afzuiger.
LET OP: Voer deze stap zorgvuldig elk putje van een chambered dekglaasje systeem is klein; Het is gemakkelijk om cellen te verstoren met de punt van een pipet of een sterke luchtstroom van een aspirator. - Meng de fluorescent gelabelde deeltjes met een celkweekmedium (bereid zoals hierboven beschreven). Voeg Candida -BFP (bij een MOI van 10), fluorescent geconjugeerd-zymosan of latex korrels-konijnen IgG-FITC (10 deeltjes per cel) aan de cellen. Gebruik een eindvolume van 200 pl media voor één kamer vormt zodat alle cellen vallen.
- Spin down de kamer dia bij 277g gedurende 3 minuten bij 10 ° C.
Opmerking: Deze centrifugatie stap helpt om het contact tussen de deeltjes en de cellen te verhogen, en synchroniseert het bindingsproces. - Onmiddellijk over de kamer dia naar een 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 5 minuten.
- Verwijder de kamer dia uit de incubator en zuig de media.
- Was de cellen 3x met ijskoude PBS.
OPMERKING: Controleer de aanwezigheid van niet-gebonden deeltjes met een lichtmicroscoop en was meerdere malen met PBS indien nodig. Het is essentieel om ongebonden deeltjes uit de put verwijderen om achtergrondruis te minimaliseren tijdens de analyse. - Fix cellen door toevoeging van 500 pl 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS verdund door incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
WAARSCHUWING: Deze stap vereist het gebruik van 4% PFA die zeer toxisch, corrosief en potentieel carcinogeen. Proper voorzichtigheid is geboden bij het gebruik van deze vloeistof. Ook beschermen monsters van licht. - Herhaal 3.1.9 stap tweemaal.
OPMERKING: Bij deze stap vullen elk flesje na verwijdering van de vorige PBS. - Stop de binding door incubatie met 500 pl 50 mM NH4 Cl in PBS gedurende 10 min.
- Was de cellen tweemaal met PBS zoals in stap 3.1.10.
- Doorlaatbaar cellen door toevoeging van 250 ul bindingsbuffer (0,1% saponine, 0,2% BSA in PBS) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Stain F-actine door toevoeging van fluorescent geconjugeerde phalloidin (1: 500 verdund in bindingsbuffer). Incubeer cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Was de cellen drie keer met PBS zoals in stap 3.1.10.
- Maak foto's met behulp van een confocale microscoop (63x objectief, en 402 nm en 488 nm laser) en het analyseren van beelden met behulp van ImageJ 16.
OPMERKING: Een succesvolle deeltje binding wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van een fagocytische cup op de plaats waar de deeltjes contact op met de fagocytische cel (figuur 1). Zie stap 3.2.5.
- Zaad ongeveer 5 x 10 4 cellen in een kamer zo in dat ze 60-70% confluent ten tijde van het experiment. Alterntief, plaat cellen op dekglaasjes (in 24- of 12-well formaat) of glazen bodem 96-putjesplaten. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Fagocytose Opname Assay
Opmerking: Dit experiment is ontworpen om de volledige internalisering van fluorescent gelabelde deeltjes door fagocyten via confocale microscopie (figuur 2) volgen.- Zaad ongeveer 5 x 10 4 cellen in een kamer zo in dat ze 60-70% confluent ten tijde van het experiment. Alternatief plaat cellen op dekglaasjes (in 24- of 12-well formaat) of glazen bodem 96-putjesplaten. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2.
OPMERKING: Cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer of soortgelijke techniek. - Houd de kamer schuift (of plaat) bij 10 ° C gedurende 10 minuten.
OPMERKING: Koeling is nodig om endocytose en fagocytose ongewenste blokkeren en vervolgens een gesynchroniseerde fagocytose hebben. - Perform stappen van 3.1.3 naar 3.1.5
- Breng de kamer dia naar een 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO 2 en incubeer gedurende verschillende tijdstippen. Fix cellen na 30, 60 en 90 min na infectie. Let op C. albicans beginnen te schimmeldraden op 60 min na infectie te vormen; fagocyten beginnen celdood (pyroptosis) vertonen na 90 min 8.
Opmerking: Dit is een aanbeveling en optimalisatie is essentieel afhankelijk van het celtype en de deeltjesvormige gebruikt. - Voer stappen van 3.1.7 naar 3.1.15. Analyseren van beelden met behulp van ImageJ 16.
OPMERKING: een geslaagde opname wordt gekenmerkt door een volledige internalisering van een deeltjesvormig in het cytoplasma van een fagocyt (figuur 2). Kleuren van de fagocyten met celoppervlak merker zoals phalloidin helpt de contour van cellen af te bakenen. Het is ook essentieel om z-stacks uitvoeren om te bepalen of de deeltjes is gebonden aan celoppervlak of completely geïnternaliseerd.
- Zaad ongeveer 5 x 10 4 cellen in een kamer zo in dat ze 60-70% confluent ten tijde van het experiment. Alternatief plaat cellen op dekglaasjes (in 24- of 12-well formaat) of glazen bodem 96-putjesplaten. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Live-Imaging van Phagocytosis
Opmerking: In dit protocol beschrijven we het gebruik van confocale microscopie aan de verschillende stadia van fagocytose via fluorescent geconjugeerd zymosan vangen. We gebruiken de dendritische cellijn die stabiel tot expressie DC2.4 mCherry gemerkte F-actine 8, een biosensor dat de verdeling van filamenteus actine in levende cellen toont. Aangezien fagocytose is een actine gestuurd proces live beeldvorming in deze cel maakt niet alleen alle bewegingen en dynamiek van F-actine netwerk vast te leggen, maar ook voor diverse fagocytische gebeurtenissen binnen de levende cellen (Figuur 3, Film 1) zichtbaar.- Zaad ongeveer 5 x 10 4 cellen in een kamer dia in een concentratie zodat ze 60-70% confluent ten tijde van het experiment. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2.
OPMERKING: Cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer ofsoortgelijke techniek. - Houd de kamer dia's op ijs gedurende 10 min.
OPMERKING: Koeling is nodig om ongewenste opname te blokkeren, en een gesynchroniseerde fagocytose hebben. - Voer stappen van 3.1.3 naar 3.1.5
- Pre-warm de microscooptafel tot 37 ° C en equilibreren de kamer met 5% CO2. 30-45 min wachten voor de temperatuur en de CO 2 te stabiliseren voordat de beeldvorming.
Opmerking: omdat de CO2 en temperatuurniveaus zijn cruciaal voor fagocytose, is het belangrijk om op de microscoop verwarming voorafgaand aan het experiment om de klimaatkamer equilibreren. - Plaats de kamer dia met de cellen in de microscoop incubator behuizing geëquilibreerd bij 37 ° C en 5% CO2.
- Live imaging 17, 18.
OPMERKING: De instellingen voor de laservermogen (gain, pinhole, etc.) Afhankelijk van het type The microscoop en fluorescente probe gebruikt. Daarom raden wij overleg met de handleiding van de microscoop voor optimale conditie voor uw live-imaging 17,18.- Gebruik confocale laser scanning microscoop (en de bijbehorende software) voor levende beeldvorming. Gebruik 63x 1.4NA olie objectief met een pinhole van 1-1,1 Airy eenheden.
- Om de beeldvorming te starten, gebruikt het heldere veld om een representatieve regio op de kamer slide te vinden. Selecteer vervolgens het veld door te klikken op de optie Positie van de software. Om GFP in Spoor 1 gebruikte de filter set voor 488 nm laser met een beam splitter bij 582 nm, om golflengten tussen 488 en 582 nm te detecteren detecteren.
- Volg 2 selecteer een filter instellen optimaal voor mCherry (RFP) met behulp van een bundelsplitser bij 578 nm en het detecteren van golflengten tussen 578 en 600 nm. Gebruik 488 nm en 578 nm lasers met 50% laservermogen en een winst output van 600-700. Verkrijgen beelden elke 30 seconden voor een totaal van 90 min.
- Zaad ongeveer 5 x 10 4 cellen in een kamer dia in een concentratie zodat ze 60-70% confluent ten tijde van het experiment. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
-Microscoop gebaseerde methode om de verschillende stadia van fagocytose bewakingsmogelijkheden gepresenteerd. De verschillende gebeurtenissen tijdens de fagocytose van verschillende fluorescerende deeltjes door DC2.4 cellen worden getoond. Met de hier beschreven technieken, hebben we de rol van sfingolipiden in de vroege stadia van fagocytose. Daartoe DC2.4 dendritische cellen genetisch deficiënt SPTLC2, het enzym dat de eerste en snelheidsbepalende stap in de sfingolipide biosynthese katalyseert, gebruikt. In vergelijking met wild-type cellen, SPTLC2 - / - DC2.4 cellen aanzienlijk verminderd niveau van sfingolipiden zoals ceramide, sfingomyeline en glucosylceramide 8. SPTLC2 - / - DC2.4 cellen defect in het binden, en de opname van C. albicans, zymosan en IgG latex korrels 8. In figuur 1 is de binding van fluorescent geconjugeerd-zymosan deeltjes in DC2.4 cellen getoond (zie Section 3.1 voor details). SPTLC2 - / - DC2.4 cellen vertoonden significant minder binding van zymosan dan de controle DC2.4 cellen (p = 0,0008; Figuur 1A). Het aantal zymosan partikels per cel gebonden was significant hoger dan controlecellen SPTLC2 - / - DC2.4 cellen (p <0,0001 Figuur 1C). Vervolgens onderzochten we het vermogen van SPTLC2 - / - cellen DC2.4 C. albicans fagocytose. SPTLC2 - / - DC2.4 cellen vertoonden significant minder fagocytose van C. albicans (p <0,0005) in vergelijking met de controlecellen (figuur 2A, 2B). Zoals verwacht, SPTLC2-deficiënte cellen vertoonden significant hoger aantal niet-fagocytische cellen (p <0,05; figuur 1C) en verminderde het aantal C. albicans per cel (Figuur 1C, D). Deze resultaten onderstrepen de rol van een intact sfingolipide biosynthese in binding, en in tHij opname van deeltjes. Figuur 3 toont de time-lapse beelden het aantonen van de vroege stadia van fagocytose (zie paragraaf 3.3 voor gedetailleerde procedure). Film 1 toont de beeldvorming van levende cellen die stabiel tot expressie DC2.4 F-actine, een biosensor dat de verdeling van filamenteus actine in levende cellen (zie paragraaf 3.1 voor meer details) onthult.
Figuur 1: Binding test van zymosan in DC2.4 cellen. (A) Controle en SPTLC2 - / - DC2.4 cellen werden geïncubeerd met fluorescent geconjugeerd zymosan en hun vermogen te binden de deeltjes onderzocht met confocale microscopie. Pijlen geven plaatsen van bindend. Schaal bar = 100 micrometer. (B, C) Kwantificering van het aantal gebonden zymosan deeltjes (B) en het aantal deeltjes gebonden zymosan per cell (C) getoond. Gebonden deeltjes werden gekwantificeerd en gepresenteerd als het percentage ten opzichte van de controle. Alle grafieken tonen SD van drie onafhankelijke experimenten, en ten minste 200 cellen werden geteld voor elk experiment. Ongepaarde t-test werd gebruikt om de significantie van de waargenomen verschillen te analyseren. ** P <0,001. Schaal bar = 100 micrometer. Herdruk met toestemming van Tafesse et al. 2015 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fagocytose C. albicans in DC2.4 cellen. (A) Cellen werden geïnfecteerd met C andida -BFP zoals beschreven in stap 3.2. Op 90 min na infectie werden cellen gefixeerd en gekleurd met fluorescent geconjugeerd phalloiden in beeld gebracht met behulp van confocale microscopie. (B - D) Kwantificering van het aantal geïnternaliseerde Candida -BFP, niet-fagocytische cellen en het aantal Candida -BFP per cel wordt weergegeven. Alle grafieken tonen SD van drie onafhankelijke experimenten, en ten minste 200 cellen werden geteld voor elk experiment. Ongepaarde t-test werd gebruikt om de significantie van de waargenomen verschillen te analyseren. ** P <0,001. Schaal bar = 100 micrometer. Herdruk met toestemming van Tafesse et al. 2015 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Time-lapse beeldvorming van C. albicans opname aan het begin van fagocytose visualiseren. Wild-type cellen die stabiel tot expressie DC2.4 F-actine -mCherry (F-actine) geïncubeerd met Candida -BFP (getoond in rood) en afgebeeld met behulp van confocale microscopie. Beelden die zijn vastgelegd op 30 sec intervallen worden weergegeven. Sterretjes geven de verschillende stadia van actine remodellering tijdens fagocytose. Schaal bar = 100 micrometer. Herdruk met toestemming van Tafesse et al. 2015 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: Live-imaging. Wild-type DC2.4 cellen stabiel tot expressie F-actine-mCherry (in het groen) werden geïnfecteerd met Candida -BFP (in het rood). Levende beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van confocale microscopie zoals beschreven in stap 3.3. Herdruk met toestemming van Tafesse et al. 2015 8.s / ftp_upload / 54646 / 54646mov1.avi "target =" _ blank "> Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Professionele fagocyten, zoals macrofagen en dendritische cellen, overspoelen en elimineren binnendringende ziekteverwekkers maken fagocytose derhalve een belangrijk onderdeel van de gastheer afweersysteem. Daarbij fagocyten ondergaan uitgebreide membraan reorganisatie cytoskelet herschikking hun celoppervlak 8, 19, 20. Om dit beter te begrijpen dynamisch proces, visualisatie van de verschillende stadia van fagocytose essentieel. Hier beschrijven we een microscoop-gebaseerde methode werd gebruikt om de verschillende stappen van fagocytose controleren.
De belangrijkste betekenis van de levende beeldvormingstechniek is dat het opmerkelijke vermogen om de gastheer-pathogeen-interface op moleculair niveau te volgen. Doordat visualisatie van de belangrijkste stappen van de microbiële infectie, live beeldvorming geeft kritisch inzicht in de fundamentele aard van de immuunresponstegen pathogenen 8, 10, 21, 22. Naast fagocytose, kan de hier beschreven technieken worden uitgebreid tot andere typen receptor gemedieerde endocytose, waaronder macropinocytose 10 bestuderen. Levende beeldvorming is ook een waardevolle benadering van de gastheer-pathogeen relatie intracellulaire bacteriën zoals Mycobacterium tuberculosis en Salmonella typhi, en parasieten zoals Leishmania en Toxoplasma gondii bestuderen 22, 23.
Er zijn verschillende voordelen van beeldvorming van levende cellen via andere technieken zoals conventionele biochemische benaderingen. Live-cell imaging laat ons toe om de ruimtelijke en temporele dynamiek van cellulaire processen 8 monitoren. Bovendien, live beeldvorming stelt ons in staat te winnen op de hoogteatie op een enkele cel resolutie 21. Fagocytose is een dynamisch proces dat cellulaire bundeling van receptoren, actine en membraanlipiden remodeling omvat in een kwestie van een paar minuten 10. Live-imaging maakt het mogelijk om deze informatie in een tijd gevoelige manier, die anders moeilijk te bereiken vast te leggen.
De belangrijkste beperking van deze techniek is dat het zorgvuldige optimalisatie van de experimentele omstandigheden en microscoop opstellingen. Er zijn een aantal belangrijke factoren van cruciaal belang voor het succesvol verkrijgen van afbeeldingen. De kwaliteiten van het fluorescerende proteïne (of biosensor) gebruikt om de fagocyten (zoals F-actine) en de aard van de kleurstof gebruikt om de deeltjesvormige etiket visualiseren kritische aspecten van beeldvorming. Voor live imaging, even belangrijk is het evenwicht van het milieu kamer van de microscoop setup. Afhankelijk van het instrument, kan het evenwicht te nemen van 15 minuten tot enkele uren. Since CO 2 toevoer beoogt een geschikte pH in het kweekmedium te behouden, moet voldoende runtime voorafgaand aan het opzetten van het experiment mogelijk te maken. Ingeval de CO 2 toevoer onvoldoende en / of onregelmatige, zwitterionische organisch chemisch buffermiddel zoals HEPES kan worden aangevuld met de groeimedia. blootstelling van fluorescente deeltjes en levende cellen op lange termijn aan confocale laser kan leiden tot fototoxiciteit en bleken. Optimaliseren laservermogen (hoe minder belichtingstijd hoe beter) en ervoor te zorgen dat de luiken gesloten zijn in tussen beeld acquisities kunnen deze problemen verminderen. Kortom, de hier beschreven technieken zijn ideaal voor het bestuderen van dynamische relatie tussen pathogenen en fagocyten tijdens fagocytose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Wendy Zalm en Nicki Watson van de Keck-faciliteit op het Whitehead Institute of MIT voor de beeldvorming.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1x) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
References
- Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R.
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S.
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Botelho, R. J., et al. Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis. J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).
- Tafesse, F. G., et al. Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans. PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).
- Kwik, J., et al. Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin. PNAS. 100, 13964-13969 (2003).
- Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D.
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).
- Strijbis, K., et al. Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages. PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).
- Li, X., et al. The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance. Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).
- Esteban, A., et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages. PNAS. 108, 14270-14275 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
- Jaumouille, V., et al. Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering. Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).
- Forestier, C. L. Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis. Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).
- John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii. Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).
