Summary
このレポートでは、細菌の外膜タンパク質とひと補体レギュレータ ビトロネクチンの相互作用を特徴付けるためのプロトコルについて説明します。この結合反応およびビトロネクチン値の任意の細菌種の生物学的機能を研究するプロトコルを使用できます。
Abstract
細菌はホストの免疫反応を回避するための手段として補完するレギュレータを利用します。ここでは、ホストの免疫抵抗性の細菌の細胞の表面の再生の役割ビトロネクチン獲得を評価するためのプロトコルについて述べる。流れの cytometry の実験は、ヘモフィルスタイプ f の受容器の細菌外膜蛋白 H のリガンドとしてひと血漿ビトロネクチンを識別されます。酵素抗体法を用いて精製組換え蛋白質 H とビトロネクチン、蛋白質蛋白質の相互作用を特徴付けるし、バイオ層干渉法を用いて評価した結合親和性。正常およびビトロネクチン枯渇のひと血清で血清抵抗試金を使用してホストの免疫の回避の細菌の細胞表面タンパク質 H ビトロネクチンのバインディングの生物学的重要性を確認した.グラム染色に続いてビトロネクチン コーティングなしとスライド ガラスを使って細菌付着におけるビトロネクチンの重要性を調べた。最後に、ヒトの肺胞上皮細胞膜に細菌の付着を調べた。ここで説明されているプロトコルは興味の任意の細菌種の研究に容易に適応することができます。
Introduction
ビトロネクチン (Vn) は、線溶系の調節することによる恒常性の維持に関与する重要なひと糖です。Vn は 7 C5b6 複合体形成と C9 重合中に端末の補体経路を阻害することによって補完する調節因子としても機能します。いくつかの細菌性病原体は、抵抗補完沈着1,2,3の手段として細胞表面にヴァイオリンを募集する示されています。また、Vn は病原体2,4、5の内面化とホスト上皮細胞受容体、それによって促進付着細菌の「サンドイッチ」分子として機能します。Vn のバクテリアの細胞表面へのバインドは、他の現在正体不明の蛋白質によって媒介されます。完全にホースの免疫の回避で Vn バインディングの機能的役割の解明が必要になります (ヴァイオリン) 募集タンパク質の同定。
Vn 結合蛋白質を識別するに最初のステップは、関心の病原体は精製フローサイトメトリー ヴァイオリンをバインドできるかどうかをテストするのには、Vn が病原体のセルにバインドされているかどうかを決定するための便利で簡単な方法です。本研究では様々 なヘモフィルスタイプ f (Hif) 臨床分離株6の Vn の結合を評価しました。記載方法、定量細菌株の様々 の結合容量を区別するために使用することができます。以前の研究ではタンパク質 Hif の H (PH) を Vn 結合タンパク質7として特徴付けられます。したがって、本研究では野生型 (WT) Hif と Hif M10Δlphの突然変異体の Vn 結合のポテンシャルは、記述されていたプロトコルを用いて比較した.
Vn を病原体にバインドそれが決定されると、2 番目のステップは、潜在的な Vn 結合蛋白質を識別するために表面のプロテオームを特徴付けるためです。この目的8,9には、さまざまなアプローチを使用できますが、これらの方法論は、このレポートに記載されていません。Recombinantly大腸菌の選択した細菌の表面タンパク質の表現し、親和性クロマトグラフィーによる浄化する蛋白質蛋白質の相互作用を調べることに最も適した方法です。ここでは、メソッドを説明するために PH と Vn の分子相互作用を使用します。遺伝子組換えの PH とベトナム間の相互作用は、酵素免疫測定法 (ELISA)7とバイオ層干渉 (結合)10,11として知られている最近開発されたラベル無料手法を用いた特徴付けられました。Elisa は、タンパク質間相互作用を確認する使用ことができます、一方、バリは相互作用の速度論的パラメーターに関する詳細なデータを提供します。
細菌付着の Vn の機能的役割を勉強するには、2 つの異なるアッセイを利用できます。2 番目の分析検査上皮細胞の表面への付着に対し、ここで説明した最初の試金は Vn コーテッド ガラス表面の細菌付着の直接測定です。最初の試金のためスライド ガラスは、Vn でコーティングした、WT や Hif の突然変異系統のバインディングはグラム染色と顕微鏡で評価しました。この手法は、容易に Vn12をバインドする機能に基づく細菌を区別します。哺乳動物細胞への細菌の付着に II 型肺胞上皮細胞の単層培養菌を追加して分析しました。細菌付着がコロニー形成数を数えることによって評価されたユニット (CFUs)。付着、内面化された細菌は、Vn4,13の有無で区別できます。
Vn 細菌血清抵抗性獲得の役割は、(すなわち、血清殺菌) 血清殺害の試金を使用して評価しました。血清抵抗性で、Vn 買収の意義を評価するには、Vn 枯渇血清 (VDS) の殺菌活性は、正常ひと血清 (NHS) と比較した.容易に使用法は血清抵抗性に基づく拘束力のない細菌対 Vn バインディングを区別します。いくつかの細菌性病原体4,12の血清抵抗性の Vn の役割を研究するこのメソッドを使いました。
宿主-病原体相互作用を研究するための多数の方法を報告されています。ここでは、一連のすべての病原体の研究に Vn の病態での役割を評価するために簡単に合わせることができるプロトコルについて述べる。我々 は様々 な病原体を使用してこれらのプロトコルをテストし、Hif はこのレポートのための例として選ばれました。
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Protocol
1. 細菌の表面タンパク質のリガンドとしてベトナムの解析
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フローサイトメトリーを用いた細菌の表面で Vn 結合の検出
注意: フローサイトメトリーでを使用して前方散乱、側方散乱肯定的なイベントのゲートへ。Vn との相互作用を調べる Hif 臨床分離 (n = 10)エシェリヒア属大腸菌BL21 と共に選ばれた7 (DE3) (図 1A) のネガティブ コントロールとして。- 文化 Hif 臨床は、10 μ G/ml NAD と 200 rpm で振とうしながら 37 ° C でヘミン培脳心臓注入 (BHI) で分離されます。大腸菌14の文化へルリア ベルターニカミラ培地を使用します。中間ログ段階で Hif を収穫 (外径600 0.3 =)15、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の pH 7.2, 1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) (ブロック バッファーを含む内の細菌を再停止しなさいとPBS-BSA)。10 にサスペンションを調整9 CFU/mL。
- 5 x 106 5 mL ポリスチレン丸底チューブ (12 × 75 mm2) CFU を含む因数を転送し、1 mL のブロック バッファーを追加します。、細菌を餌に 3,500 × gで 5 分間室温 (RT)16の懸濁液を遠心分離し、ペレットを乱すことがなく、上清を除去する慎重に吸引します。
- 50 μ L 250 を含むバッファーを妨げるのと細菌のペレットを再懸濁します nM (ヴァイオリン) を振ることがなく常温 1 時間サンプルをインキュベートし、。インキュベーション後、3,500 x gで 5 分での遠心分離によって細菌を餌して PBS と同様の遠心分離手順を使用して 3 つのペレットを洗ってください。
- 細菌のペレット PBS BSA で 1: 100 希釈でプライマリ羊抗ひと Vn ポリクローナル抗体 (Pab) の 50 μ L を追加します。常温では、1 h の懸濁液をインキュベートして 3 回非連結抗体 (1.1.3 のステップで説明します) を削除する PBS の細菌を洗ってください。
- 次に、50 μ L の PBS BSA 含むかに (FITC) を追加-ロバ反羊 Pab (1: 100 希釈) を共役し、RT で暗闇の中で 1 時間インキュベートします。
- 空のコントロールを準備するには、バッファーのみと Vn なし Pab をブロックで細菌を培養します。
- 3 回 1 mL のブロック バッファーを持つ細菌を洗浄し、セクション 1.1.2 で説明されているように、遠心分離によって懸濁液をペレットします。最後に、300 μ L の PBS による細菌のペレットを再懸濁し、流れ cytometry7によって分析します。
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ELISA 組換え PH とベトナムとの間の相互作用の解析
注: コントロールは、非特異的結合を除外する含まれる必要があります。人間要因 H (FH) または C4b 結合蛋白質 (C4BP) はそれぞれ正と負のコントロールとして使用されます。- 50 に分けて人間のタンパク質 (Vn、FH、C4BP) の各希釈トリス-HCl、pH 9.0 (コーティング バッファー) の nM。Polysorp マイクロ プレートの各ウェルにタンパク質溶液 100 μ L を分注します。蓋付きプレートを閉じ、マイクロタイター プレートの井戸に 4 ° C で一晩 (16 h) タンパク質の固定化を容易にするために保管します。
- シンク上の逆さまの傾きによってマイクロタイター プレートから液を捨て、PBS/ウェルの 300 μ L で 3 回洗浄します。2.5% (w/v) BSA (PBS-BSA) を含む PBS で RT で 1 h のコーティングの井戸をブロックします。
- ブロッキング液を除去した後 0.05% (v/v) トゥイーン 20 (pbst;) ウェルあたりを含む PBS の 300 μ L で 3 回洗浄します。50 nM 組換え各サンプルに彼の付けられた PH も、室温 1 時間インキュベートの 100 μ L を追加します。コントロール井戸のみ 100 μ L の PBS BSA を追加します。
注: Hif から PH lph遺伝子に PCR によって増幅され発現タンパク質の C 末端に 6 × His タグを追加します pET26b 発現ベクターにクローニングします。組換えのベクトルは、式のエシェリヒア属大腸菌BL21(DE3) に変身しました。Ni NTA 樹脂15組換え蛋白質を浄化するために使用されました。 - タンパク質溶液を破棄し、3 回の pbst; 300 μ L/ウェルと井戸を洗浄することにより自由な蛋白質を削除します。100 μ L の PBS BSA 含む西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) を追加-(1:10, 000 希釈) 反彼の Pab を共役し、室温 1 時間インキュベート
- テトラメチルベンジジン 5% アセトンと 45% メタノール溶液中に溶解して溶液 20 mM を準備します。ソリューション B を準備するには、H2O 1,000 mL にクエン酸の 19.2 g を溶解、KOH を追加して 4.25 に pH を調整し、30% H2O2の 230 μ L を追加します。室温暗の両方のソリューションを格納します。使用する直前には、9.5 ml 溶液 elisa 法の検出試薬を準備するのソリューション B の 500 μ L をミックスします。
- 3 回 PBST の 300 μ L/ウェルと井戸を洗浄し、elisa 法の検出試薬を 100 μ l 添加を各ウェルに追加することによって抗原抗体の複合体を検出します。
- 1 M H2の 50 μ L を追加し、反応を停止する4/well。450 で井戸の光学密度を測定マイクロ プレート リーダーを使用して nm。
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遺伝子組換えの PH と Vn のバリを使用しての相互作用の速度論の研究
- 製造元のガイドライン11によるとアミン反応性センサー結合法、アミンを使用して人間の Vn を固定します。
- PBS を使用すると、直列 4 μ M を 0 からリガンド (組換え PH) を希釈し、結果のソリューションを 96 ウェル黒、平底マイクロ プレートに転送します。バリ楽器17を使用して 30 の ° C で実験を実行します。
- バリ データ解析ソフトウェアで、データ フォルダーをロードします。センサー選択を選択します。その後、選択 'よく '(PBS で Vn 被覆センサー) の参照減算。
- 'Y 軸のベースラインに整列'し'interstep 補正と協会に揃える」を選択します。[分析] タブが自動的に開きます「プロセス データ」を押します。
- [分析] タブでカーブ フィットの下「協会と解離」オプションを選択します。モデルを選択 ' 1:1 バインドとグローバル フィット '。『 カーブ フィット 』とエクスポート データ17をフィッティングを押します。
2. 細菌付着の Vn の役割のキャラクタリゼーション
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Vn コーティング ガラス表面の細菌付着に関する研究
- Vn の PBS とピペット 10 μ L ガラス顕微鏡にこの液の一滴としてスライドの 2 μ g/mL のソリューションを準備します。ネガティブ コントロールとしてひと血清アルブミン (HSA) とスライドしたコートで 30 分間スライドを乾燥させるドロップを許可します。
- タンパク質被覆ガラス スライドを 3 回洗浄コーティングされていない過剰なタンパク質を削除する PBS を含むビーカーに 2 秒間スライドを浸漬しました。滅菌プラスチック シャーレに新鮮な Hif 文化 (1.1.1 の手順で説明します) の 20 の mL を追加し、水没 Vn-/HSA コーテッド ガラス スライド培養培地で。20 rpm で振とうしながら 37 ° C 1 時間で料理を孵化させなさい。
注: Hif M10 と Hif M10Δlphは液体 BHI 培地やチョコレート寒天培地プレート上に育った。Lphの突然変異のための媒体は 10 μ G/ml カナマイシン15と補われました。 - インキュベーション後、PBS が入ったビーカーに 3 回スライドを水没によってバインドされていない細菌を除去します。前述のグラム染色で細菌を視覚化します。
- 各スライドからそれを傾斜とティッシュ ペーパーの上に端に触れることによって余分な PBS を削除します。常温では、3-5 分用のスライドを風乾、各スライドの炎で 3 回を渡すことによって付着細菌を修正します。
- 染色トレイの端を 2 本の指でスライドを保持し、2.3% クリスタル バイオレット溶液の 3-4 滴 (200-300 μ L) を追加します。待機 60 秒、し、タップの穏やかな流れの下でスライドが 3-4 秒の水洗浄します。
- スライドに 0.33% ヨウ素液の 3-4 滴を追加します。1 分を待ってから、水道水の穏やかな流れの下でスライドをすすいでください。慎重にあぶらとり紙でスライドを乾燥させます。
- 75% イソプロピル アルコールのスライドに 25% アセトン脱色液の 3-4 滴を追加します。5-10 秒後に、水道水の穏やかな流れの下でスライドを洗います。
- 基本的な carbolfuchsin ソリューションの 3-4 滴 (200-300 μ L) を追加します。1 分を待ってから、水道水の穏やかな流れの下でスライドをすすいでください。あぶらとり紙を使用してスライドを乾燥させます。
- 100 倍率18倍の油浸対物レンズの選択、光学顕微鏡下で細菌を視覚化します。Hif WT と Vn と HSA コーティング ガラス表面に突然変異体の細菌の付着を比較します。
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Vn 依存へ上皮細胞への細菌付着に関する研究
注: この効率的な付着試験は私たちの以前の研究の4,7で使用されました。- 10% (巻/巻) 牛胎児血清 (FCS) (完全培地) と 5 μ G/ml ゲンタマイシン F12 培と 75 cm2培養フラスコで培養 A549 細胞 (II 型肺胞上皮細胞)。80% 合流まで 3 日間の 37 ° C で 5% CO2インキュベーターでフラスコを孵化させなさい (の confluency は倒立顕微鏡による細胞表面被覆率の可視化による推定できます)。次の 4 つのステップでは、アッセイの19,20の上皮細胞を準備する方法について説明します。
- 穏やかな旋回で 20 mL の PBS で 2 回フラスコ内でセル単一層を洗います。フラスコ表面から細胞をデタッチするには、細胞剥離酵素溶液 2 mL を追加し、37 ° C で 5 分間フラスコを孵化させなさいプラスチックの表面から細胞をすべて外しに手のひらでフラスコをタップします。上下に数回、また細胞塊を分散させます。
- F12 完全培地の 18 mL をフラスコに追加し、全体の細胞懸濁液を 50 mL の滅菌ファルコン チューブに転送します。RT で 200 x gで 5 分間細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します。F12 完全培地 10 mL に細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞懸濁液の 10 μ L を削除し、エッペン チューブに配置、トリパン ブルー溶液 90 μ L を追加します。診断にサンプルを読み込む (深さ 0.1 mm)、coverslip を配置した後。
- エリア A、B、C、および D のすべての実行可能なセルをカウント (16 の正方形から成っている各フィールドとそれぞれの正方形は、0.0025 mm2の面積を持つ)、平均細胞数を計算 ([A + B + C + D]/4)。次の式を使用しての 1 ミリリットルあたりのセル数を計算します。
実行可能な細胞/ml = 平均セル数 × 104 × 希釈率20。
注: ここでは、希釈倍率は 10 です。 - 103セル/mL 完全の含んでいる 5 μ G/ml ゲンタマイシン媒体を使用して x 5.0 に細胞懸濁液を希釈します。24 ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、細胞懸濁液 500 μ L を調剤します。セルが 90% 合流までは、37 ° c 5% CO2で板を孵化させなさい。
- 細菌の感染前に井戸からメディアを削除し、(FCS)、なし F12 媒体を追加し、37 ° C で一晩インキュベート
- RT。 場所氷の上のプレートに 500 μ L の PBS を使用して 3 回細胞膜を洗浄し、中古冷蔵 F12 培 1 h 4 ° C でヴァイオリン加温プレートの 10 μ G/ml の 100 μ L を追加します。コントロールの井戸、F12 媒体のみを追加します。
- インキュベーション後、ピペッティングにより液を捨て、新たに育てられた Hif M10 の文化でルートを再懸濁します 1 mL の PBS で 2 回細胞層を洗う (ステップ 1.1.1) F12 中 (2 × 108 CFU/mL)。各ウェルにこの細菌懸濁液 100 μ L を追加し、37 ° C で 2 時間版を孵化させなさい
注: それぞれはよく約 2 × 105 A549 細胞を含まれています。感染症、細菌 CFU が追加された、2 × 10 の7 100 の感染症の多様性に対応します。 - ピペッティングでメディアを削除し、PBS で 3 回 A549 細胞を洗ってください。50 μ L/ウェルの細胞剥離液を追加し、37 ° C で 5 分間プレートを孵化させなさい
- 次に、F12 あたりも酵素反応を停止する完全な媒体の 50 μ L を追加します。4 つのガラス玉を含む 6 mL ガラス管に各ウェルから上皮細胞 (≈100 μ [すなわち、全体ボリューム]) を転送します。2 分間ボルテックスによる RT で細胞を溶解させます。
- 細胞ライセートの 10 μ L を 100 倍希釈 F12 媒体の 990 μ L に溶解液の 10 μ L を追加することによって。チョコレート寒天培地プレート上に希釈したサンプルの 10 μ L をプレートします。
- 37 ° C でチョコレート寒天培地プレートを一晩インキュベートし、コロニーをカウントします。各植民地は、1 CFU を表します。
- 10% (巻/巻) 牛胎児血清 (FCS) (完全培地) と 5 μ G/ml ゲンタマイシン F12 培と 75 cm2培養フラスコで培養 A549 細胞 (II 型肺胞上皮細胞)。80% 合流まで 3 日間の 37 ° C で 5% CO2インキュベーターでフラスコを孵化させなさい (の confluency は倒立顕微鏡による細胞表面被覆率の可視化による推定できます)。次の 4 つのステップでは、アッセイの19,20の上皮細胞を準備する方法について説明します。
3. ひと血清の殺菌活性に Vn 依存的抵抗性の解析
- 商業ソースから NHS で購入。上記12として VDS を準備します。180 と VDS を補充する nM Vn Vn NHS の存在に相当します。
- 56 ° C、30 分で補体蛋白質を不活性化するために NHS を加熱して熱非動化血清 (HIS) を準備します。
注: 最適な血中濃度 (5%) と 3.3 – 3.7 の手順に記載されている試金のための培養時間 (15 分) は、Hif15経験的に決定されたこれらのパラメーター可能性がありますその他の細菌性の病原体によって異なります。 - 中間ログ相に (この場合、Hif M10 と変異 Hif M10Δlph) の細菌の文化 (外径600 = 0.3)。3,500 x gで 10 分間遠心分離によって細菌をペレットします。
- 1 ブドウ糖ゼラチン Veronal バッファー (DGVB ++; pH 7.3) 含む 2.5% (w/v) グルコース、MgCl22 mM、0.15 mM CaCl2、および 0.1 %wt/vol のゼラチン量で細菌のペレットを再懸濁します。
- 追加 1.5 x 103 5% 血清を含む DGVB ++の 100 μ L に細菌の CFU (NHS、彼、VDS または VDS + 180 nM Vn)。300 rpm で振とうしながら 15 分の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。
- 0 分 (T0サンプル)、15 分 (Ttサンプル) チョコレート寒天培地プレートで反応混合物から 10 μ L 分注を削除します。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
- インキュベーション後、プレートに表示されるコロニーをカウントします。細菌の割合を殺した12次の方程式を使って計算: (CFU Tt)/(T0CFU) × 100。
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Representative Results
細菌の表面に Vn バインディングは、フローサイトメトリーによって決定されました。すべて Hif 臨床分離株におけるテストは、細胞表面に Vn を採用しました。大腸菌陰性対照ひずみ (図 1A)、Vn 細胞表面との相互作用はみられませんでした。図 1Bに示すように、PH は表面 Hif 細胞の主要な Vn 結合蛋白質。WT Hif ひずみによるベトナムのバインド M10 シフトを引き起こしました、人口で一方 Hif M10Δlph Vn がバインドされないコントロールに同じような出現します。
PH と Vn の蛋白質蛋白質の相互作用は、elisa 法とバリで推定されました。人的要因 H、Vn、C4BP とバインドする許された組換え PH (マイナス コントロール) は ELISA プレート マイクロタイターの井戸の上にコーティングします。バインドされている PH の推定、反彼の Pab。PH と Vn C4BP と比較して H、因子と有意な相互作用が明確に示唆 (図 2A)。PH と Vn の相互作用は、バリを使用してリアルタイムで推定されました。図 2Bは、Vn 被覆センサー表面の PH バインド応答曲線を示しています。結合親和性 (この場合も、Kd = 2.2 μ M) の定常状態の拘束運動データのあてはめによる推定されました。
細菌展示細胞表面 (Hif M10Δlph) PH の表現に欠けているは、WT 細胞 (図 3A) と比較して Vn コーティング ガラス表面への付着を減少します。さらに、上皮細胞の表面に Vn の存在は大幅 Hif (図 3B) の付着を増強しました。PH 中和作用が細菌付着に大きく貢献するいると推察されました。
Vn は、よく知られている補体阻害剤です。補体阻害活性を見積もるには、血清を介した殺害を目の前に検討した、ヴァイオリン WT Hif 細胞展示 M10Δlph変異細胞よりも高い血清抵抗性。彼 (図 4A) の存在下で殺された細菌はありません。興味深いことに、WT Hif 展示、VDS の減らされた生存と Vn の補充は細菌の生存を増加しました。ただし、Hif M10Δlphひずみ (ヴァイオリン) は細胞表面 (図 4B) に募集できるので Vn 枯渇に応答しませんでした。これらの結果は、Vn が補体を介した殺害 (図 4A B) から細菌を保護する重要な宿主因子であることを明確に示します。
図 1:ヘモフィルス血清型 f 結合表面表現博士を介して (ヴァイオリン)(A) 流れの cytometry 結果 Hif 臨床分離株の細胞に Vn のバインドを表示します。各臨床分離株 (5 x 106 CFU) は Vn。 バインド リガンドが羊アンチ Vn Pab とロバの FITC 結合反羊二次抗体を使用して検出された 250 nM 人間と孵化します。大腸菌BL21 (DE3) のネガティブ コントロールとして含まれていた。帳票分析 3 つの独立した実験で誤差範囲から平均蛍光強度を表す (B) の SD 流れ cytometry ヒストグラム Vn WT Hif M10 と PH 削除 Hif M10Δ の表面の結合を示すようにデータが表示されます。lphの変異体。3 つの独立実験の 1 つから代表的なデータが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 組換え PH (ヴァイオリン) にバインドします。(A) ELISA 結果 (ヴァイオリン)、FH、C4BP 組換え PH の結合を示します。FH は、C4BP ネガティブ コントロールとして使用されていたに対し、肯定的な制御として使用されました。蛋白質蛋白質の相互作用を分析する (ヴァイオリン)、FH、C4BP モルでコーティングされた (50 nM) マイクロタイター プレートの井戸に濃度。次に、50 nM 組換え PH His6x を追加しました。バインドされている PH は反彼の Pab を HRP 共役を使用して検出されました。表示されるデータは、3 つの独立した実験から帳票分析の手段と誤差範囲の SD を示す * * *、 P≤0.001。Vn を PH バインド (B) BLIanalysis: AR2G センサーと PH の拘束運動組換え Vn ヒトアルプミン抗体 (0.25-4 μ M) Vn にバリの楽器を使用して記録されました。各濃度平衡、得られた信号を用いた平衡親和定数を計算し、定常状態速度論に従ってデータが装着されました。実験を 3 回繰り返したし、1 つの代表的なデータセットが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: PH と Vn の相互作用強化ガラス表面と上皮細胞に細菌付着します。(A) 光顕微鏡画像 Hif の Vn コーティング ガラスへの付着を示します。細菌, 可視化されたグラム染色によって。3 つの独立実験の 1 つからの代表的な画像が表示されます。このパネルは、免疫学のジャーナル7で以前公開されてし、免疫学者のアメリカの協会の許可を得てここで再現します。WT Hif M10 の (B) 付着細胞 A549 細胞存在と Vn の不在で、3 つの独立した実験から帳票分析の手段をプロットし、誤差範囲を表す SD. *、 p 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: Vn Hif 細胞表面に募集した血清を介した殺害から細菌を保護する。(A) WT Hif M10 と変異 Hif M10Δlph 5 %nhs または彼で 15 分間培養します。殺菌に Hif M10 (B) 抵抗 Hif M10Δlph効果 5 %vds と VDS は、3 つの独立した実験から帳票分析の 250 nM 精製 Vn データを表す手段で補完と誤差範囲の sd を示す * * *、 p 。≤0.001;NS は、重要ではないです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
細菌性病原体は、細胞表面に Vn を募集し、補足物の要因の成膜および膜の攻撃の複合体2の完了を防ぐためにこの補完するレギュレータを利用します。Vn は、上皮細胞の表面に付着し、その後内面化を仲介する病原体ができ細菌の表面タンパク質とホスト細胞の表面の受容器、ブリッジの分子としても機能します。本研究では血清抵抗性および強化を提供する i) へのバインド (ヴァイオリン) の細菌細胞、ii) 蛋白質蛋白質の相互作用および親和性定数の表面および iii) Vn の機能的役割を推定するためのプロトコルについて述べる宿主細胞の表面に付着します。
フローサイトメトリーは、Vn を細菌にバインドを検証する一般的に使用される量的手法です。ただし、Vn 濃度を最適化する必要が、Vn 結合容量 (と種々 の受容体) は菌種によって異なることが。ここで説明アッセイ、1-100 μ g/mL (ヴァイオリン) の線形結合と彩度パラメーターを推定する使用されました。WT Hif のバインドのパターン、Hif M10Δlph変異陰性対照大腸菌細胞の比較 (ヴァイオリン) 濃度 20 μ G/ml の明確な違いを示した (250 nM)。したがって、この濃度は、すべて流れの cytometry の実験で使用されました。Vn の飽和点以上の濃度での使用では、誤検知信号を作り出すことができます。第一次および二次抗体の希釈には、各病原体の個別に最適化する必要があります。良好な信号を示す抗体の最大希釈を選択する必要があります。この研究では、2.5 %bsa をブロッキング剤として使用されます。しかし、BSA は、普遍的なブロッキング試薬のすべての病原体に適してではありません。BSA は非特異的な抗体の相互作用をブロックしていない場合、他のブロッキング試薬使用できます、魚ゼラチンなど。Vn の細菌の病原体の細胞の表面に結合は、複数の受容器21,22によって媒介される多くの場合。いくつかの受容器ある高 Vn 結合親和性、低結合親和性を示すことができる他の人。したがって、フローサイトメトリーによる評価 (ヴァイオリン) 相互作用の減少表面蛋白質 1 つだけ遺伝子の削除可能性がありますされません。フローサイトメトリーに代わりに、蛍光抗体法 (IFA) または透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用して細菌の細胞の表面の蛋白質の結合を確認できます。Fluororeagent された抗体の退色は、フローサイトメトリー、IFAs の両方で問題が発生することができます、TEM、面倒なサンプル前処理、工芸品23,24を導入することの実質的なリスクがあります。フローサイトメトリー解析が短時間内で多くのサンプルをテストの可能性と単純なサンプル準備のプロトコルのため IFA および TEM に確かに望ましい。
ELISA (図 2A) によって、無細胞系でのタンパク質間相互作用を行った、バリ (図 2B)。これらの技術の両方で、(結合) のバイオ センサーやマイクロ プレート (elisa 法) のいずれか、動員結合パートナーの 1 つはなかった。バリと elisa 法の利点は、彼らがアクティブなバインディング サイト外の非特異的な相互作用を防止するネイティブ状態のタンパク質間相互作用の解析を有効にすることです。ただし、バリのユーティリティは、固定化技術によって制限できます。ここでランダムに使用するプロシージャを結合アミンは、タンパク質の表面に露出したアミン グループとバイオ センサーの表面のアミド結合を形成します。これはさまざまな方向のセンサーの表面へのタンパク質固定化の結果します。1:1 の結合動態モデルを適合しない異種結合の可能性があります。ビオチン センサーを選択し、固定化される組換え蛋白質のストレプトアビジン タグを追加することによってこの問題を解決できます。バリの信頼性は、表面プラズモン共鳴 (SPR) のそれに似ています。協会と分子の解離は、いずれかの技法を使用してリアルタイムで測定できます。ただし、バリ デバイスは、マイクロを使用しないし、維持するために簡単にできます。さらに、96 の相互作用でテストできます同時にバリ、スプレーを使用して、一度に 4 つのサンプルをテストできるに対し最適化する必要がありますバリのもう一つの重要なステップがあります。センサーが再利用される場合再生条件も最適化してくださいと各蛋白質蛋白質の複合体のために異なる場合があります。本研究では 10 mM エチレンジアミン四酢酸センサー再生に適したが見つかりました。
細菌付着の Vn の役割は、直接 Vn でコーティングされたガラス表面を使用してテストされました。すべての細菌の病原体のバインディングを分析するこのアプローチを用いることができるグラム陰性との両方の肯定的な細菌を含む。これ Vn に病原体の容量結合のための迅速な評価を提供する定量的手法です。合理的な結果を得るためには、Vn コーティングを最適化する必要があります。ここで説明した分析では、1、2、および 5 μ G/ml でヴァイオリンにコーティングを検討したと 2 μ G/ml でした (図 3A) 本研究で実施した実験の最適濃度をことが判明します。過剰な Vn 表面にコーティングは、簡単にサンプルを修正し、染色中に取り除かれることができる層が厚いを作成でした。さらに、細菌の培養はならない細胞の大きな塊これは、ボルテックス文化、因数をスライドに追加する前に回避します。
上皮細胞の表面に細菌の付着はカンテン平板を用いた (図 3A) を検討しました。このアッセイも最適化する必要が慎重に細菌付着で Vn の役割の観察を有効にします。ベトナムの異なる結合部位 (C 末端) の細菌の細胞表面のインテグリン受容体 (N ターミナル RGD 結合部位) に。Vn のインテグリンにバインドは、シグナリングとインテグリン Vn 複雑な1の取り込みを誘導します。細菌なしそのような複合体内在化されている、結果は解釈が困難になります。したがって、Vn は 4 ° C で単層上皮細胞に追加しなければなりません。Vn は、上皮細胞表面のインテグリン受容体を飽和が、無料 (ヴァイオリン) は、細菌の Vn 依存的インテグリン結合をブロックできますようオフに、その余分な Vn を洗浄された必要があります。この分析では、推定合計細菌カウント上皮細胞に関連付けられている (すなわちで構成される読み出し表面接続型および細菌を内在化している)。この試金は、ゲンタマイシン4処理によって外部および細胞内の細菌集団を区別するために拡張できます。
ここで説明したプロトコルで使われる血清殺菌アッセイは、以前公開された手順12,22から部分的に変更されました。アッセイは、ここで説明 1.5 × 10 が3 CFUs の Hif 前述の試金 (図 4A) でより長い 5 分、15 分間 5 %nhs で培養します。WT Hif と PH を欠いている同質遺伝子変異の違いよりも 10 分 15 分で顕著であった。したがって、私たちはこの実験の 15 分潜伏期間を選択しました。血清の殺菌効果は、血中濃度、培養と菌数の時間によって異なります。すべての病原体を示す血清; 殺菌を回避するため顕著な能力適度に抵抗力があるまたは敏感である他のいくつかの病原体、血清に完全に耐性ができます。検討した各特定病原体の血清中濃度を最適化する必要したがって。それにもかかわらず、ここで説明されているアッセイを殺す血清は血清にグラム陽性細胞1,5に大きな殺菌効果があるないためグラム陰性菌の研究に限定されます。
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Disclosures
著者は金融利益相反があります。
Acknowledgments
この作品は、アンナの財団とエドウィン ・ ベルガー、Lars Hierta、o. e.、Edla ・ ヨハンソン財団、スウェーデン医学研究評議会からの補助金によって支えられた (許可番号 K2015 57 X-03163-43-4、www.vr.se)、大学でがん財団マルメ ・家庭的社会 (性の基礎) とスコーネ郡評議会の研究・開発財団の病院。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
