Summary
Her presenterer vi en protokoll for å vurdere frø survivor, spiring og dvalen under feltforhold ved hjelp av nedgravde, merket frø strimler og tetrazoliumklorid (TZ) levedyktighet testing.
Introduction
Det overordnede målet med denne metoden er å vurdere en pålitelig frø overlevelse over tid under feltforhold.
Jord frøbanker er en reserve av spredt, levedyktige ennå ungerminated frø fordelt enten på jordoverflaten, i overflaten kull, eller i jorda profil, som kan vedvare forbigående eller i mange år 1,2. Når frøet grav metoder som ligner de som presenteres her ble brukt til en 17-årig studie ved hjelp av flere dusin arter, ble levedyktige frø finnes i mange av de artene som ble testet tre. Seed dvalen er en blokk til frø spiring til den riktige kombinasjonen av vilkår for frøplante overlevelse oppstår fire. Gjenværende sovende kan tillate frø for å overleve tøffe forhold, som for eksempel lave vintertemperaturer, næringsbegrensning eller sesong tørke, før en ekstern trigger for dvalen-release gjør det mulig for spiring. Triggere for dvalen-release kan variere fra eksponering til utvidet kalde, forbindelser igjen av fire, eller fysisk angrep på frøet pelsen gjennom slitasje eller kontakt med dyr magesyre 5. Som spiring signaler kan være slekter eller arter spesifikke og ofte et resultat av tidligere naturlig utvalg, er mistilpasset frøspiring det som foregår på et upassende tidspunkt, og kan resultere i frø eller frøplante dødelighet eller dårlig frøplante vekst. Mens dvalen har blitt klassifisert i en rekke typer basert på mekanismene for dvalen meldingen (for eksempel fysisk dvalen, fysiologiske dvalen), gjenstår seks frø dvalen en av de minst forståtte temaene i plantebiologi. Dermed feltstudier som gir mulighet for vurdering av status av individuelle frø eller grupper av frø i henhold til relevante økologiske forhold har høyere forklaringskraft enn de som bare stole på standard spiring tester i laboratoriet.
Utnyttelse av kjente frø egenskaper kan gi innsikt i mekanismene for dvalen. Kontroll av frø dvalen er complex, inkludert genetisk kontroll av fysiologiske og morfologiske faktorer. Mens en full forståelse av bredden av dvalen mekanismer har ennå ikke klarlagt, har en generell modell dukket opp, som involverer en tilbakemelding forholdet mellom de to plantehormoner gibberellinsyre (GA) og abscisinsyre (ABA) 7. I denne generalisert modell for frø med en fysiologisk komponent til deres dvalen, GA tjener som signal for dvalen utgivelsen, mens ABA tjener til å opprettholde den sovende tilstand. Maternal genetiske effekter samt mors vekstmiljø kan påvirke dvalen og andre frø egenskaper, som størrelse, gjennom moderlig generert vev og utviklings signaler 8. Matern generert eksterne strukturer (eller frø gulvbelegg) kan opprettholde dvalen, til tider i kombinasjon med fysiologiske signaler. Siden maternelle frø gulvbelegg styres av moren plantens gener, kan de ikke gjenspeiler frøet faktiske atom genetiske make-up. Vi har ossed de solsikke achenes fra en rekke crop-wild hybrid krysser å erte disse mødre vs. embryo genetiske effekter på frø kjennetegn 9,10. Dermed studiedesign som inkluderer ulike arter, krysstyper eller genotyper kan fange opp informasjon om økologi og genetikk av frø dvalen, spiring og overlevelse.
Et viktig eksempel på hvordan frøspiring og overlevelses fenotyper kan påvirke populasjons dynamikk kan sees i avlings-vill hybrid soner. Utvalg under temmingen av dyrket planter eliminerer mest dvalen og reduserer et frø evne til å overleve utenfor vekstsesongen. Likevel genflyt, eller hybridisering mellom dyrket og vill typer i crop-wild hybrid soner kan gjeninnføre beskjære alleler (eller genetiske varianter) inn i en vill populasjon, med potensielle effekter på frøbanken dynamikk. Hybrider mellom dyrket og ville slektninger potensielt finnes i korn-wild hybrid soner kan haen rekke mellomliggende dormancy fenotyper, med bare noen få fenotyper som forventes å overleve forholdene utenfor vekster (f.eks vintermånedene) 11.
Formålet med dette manuskriptet er å vise hvordan, ved hjelp av frøet begravelse strimmel metode, kan vi vurdere spiring, uvirksom, og overlevelse av en rekke frø typer ved forskjellige tidsperioder for å undersøke deres naturlige variasjoner under feltforhold. I vårt eksempel, benyttet vi solsikkefrø fra 15 crop-wild hybrid krysstyper siden vi er interessert i mors og embryo genetiske effekter på frø egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Samle Seed fra flere arter eller Kontrollerte Crosses av en enkelt art
Merk: Dette eksemplet brukt frø fra 15 krysstyper innenfor arten solsikke (solsikke) ved hjelp av wild, hybrid, og avlingstyper som mors (frø produsere) foreldre.
- Ved slutten av vekstsesongen, samle modne frø hoder i merket poser. Clean frø fra agnene og sted frø i konvolutter merket med foreldrekrysstypen i standard format (dvs. mors x fars).
- Bulk frø sammen i store konvolutter ved hjelp av like mengder frø fra like mange identiske foreldrekrysstyper. For eksempel 100 frø fra 10 krysstyper med samme mors- og fars foreldre. Merk konvoluttene med identifisering (krysstypeinformasjon). Disse store konvolutter er seedet mestere for bruk i å fylle grav strimler i punkt 2.
| maternal Parent | |||
| Paternal Parent | Wild: WxW | F 1: WXC | Crop: CXC |
| Wild: WxW | 0% WxW | 25% F 1 XW † | 50% CxW † |
| BC: WxF1 eller F1xW | 12,5% WxBC | 37,5% F 1 XBC | 62,5% CxBC |
| F 1: WXC | 25% WxF en † | 50% F 1 xF 1 | 75% CXF en † |
| F 2: F 1 xF 1 | 25% WxF 2 | 50% F 1 xF 2 | 75% CXF 2 |
| Crop: CXC | 50% WXC † | 75% F 1 xC † | 100% CXC |
Tabell 1. Foreldre kryss types produsert fra hånd pollinering. Sunflower crop-wild hybridkrysstyper ble produsert med hånd-pollinering for bruk i frø begravelse eksperiment. For alle krysstyper, mors foreldre oppført først og fars forelder oppført andre. Cross typene som er merket med † er en del av gjensidige krysset type par med samme% avlings alleler, men forskjellige mors foreldre. Tabell er tidligere publisert i: Pace, BA et al. (2015) 15.
2. Lag Custom Seed Grav Strips
MERK: I dette eksemplet hadde vi tre fjerning dato behandlinger og 15 gjentak, så vi kreves 45 strips totalt. Dette eksemplet bruker 15 avdelinger per stripe slik, kreves vi nok finmasket polyester eller myggnetting for å huse 15, 7 x 10 cm avdelinger. Se figur 1.
- Start med å kutte en 20 x 105 cm stripe av stoff for hvert frø stripe.
- Mål og merk avdelinger, deretter kaste stoffet i to. Ved hjelp av en high-temperatur limpistolen, forsegle en kort (10 cm) enden. Når limet kjøler litt, men ikke helt, trykker stoffet sider sammen for å skape en sel.
FORSIKTIG: Høy temperatur lim og limpistol tips kan forårsake brannskader hvis hudkontakt er langvarig. - Lim linjer fra den brettede kanten til den åpne korte enden på hver avdeling mark. Trykk de to stoff sidene sammen langs limet linjer for å sikre sel uten hull mellom avdelinger. Frø migrerer mellom avdelinger bidra til eksperimentelle feil.
MERK: Nå som avdelingene har blitt opprettet, bør utbrettet kant være åpen og klar til å motta frø og deres identifiserbar informasjon (krysset type navn). - Tilfeldig tildele frø krysstyper til avdelinger for hver stripe.
- Fyll frø kamre med et ensartet antall frø (20 for hvert kammer er brukt i dette eksempelet). For etiketter bruke industri permanente markører på cut-to-fit plast hage dart, slik at de er i stand til åtåle begravelse.
MERK: Alternative merkingsmetoder kan anvendes. - Etter hvert kammer er fylt med frø og etiketten, forsegle kammeret umiddelbart med høy temperatur limpistol. Fortsett til hele frø stripen er helt forseglet. Etikett samlet strimmel i det første kammeret med replikat, blokkere og / eller behandling informasjon.
MERK: For vår studie, siden vi hadde time flytting, blokker, og gjenskape strimler i blokker, vi inkludert all denne informasjonen. - Se etter gap mellom avdelinger og plass lim som trengs før du går videre til neste brett.
- Fyll frø kamre med et ensartet antall frø (20 for hvert kammer er brukt i dette eksempelet). For etiketter bruke industri permanente markører på cut-to-fit plast hage dart, slik at de er i stand til åtåle begravelse.
Figur 1. Burial frø stripe skjematisk. Eksempel på grav stripe viser krysstypen identifikasjon for enkelte avdelinger. Maternal forelder er oppført først med fars forelder oppført andre. Fargene indikerer annerledes mors foreldre,med gult for vill, blå for F en hybrid, og rødt for avling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Bury Seed Strips i felt
- Grav tomter til den angitte dybde til huset strimler. Tildel strimler til individuelle blokker i hvilke strimler er tilfeldig anordnet for å tillate fjernelse dato som skal brukes som hovedflekk og rommet identitet (i dette eksempelet, av krysstypen) som subplot i analysen.
- Dekk strimler med jorden. Cut metallnett maskinvare klut til å være 10 cm større enn plott og sted enn begravet strimler. Bruk U-pins å sikre kanter og dekke klut kanter med jord.
MERK: Dette dekker er for å utelukke gravende frø rovdyr. Som et annet alternativ, Mercer et al. 13 konstruert og begravet bokser av maskinvare klut som omringet frø strimler på grunn av intens gopher press på sitt felt locasjon.) - Plasser farget Sakkyndige flagg for å skille stripe plassering og fjerning datoer for å utfylle klare skriftlige kilder.
4. Grav Strips og evaluere Seed
- Grave opp frø strimler tildelt en gitt fraflytting. Opprettholde strimlene i en kjølig fuktig miljø før de når laboratoriet hvor frøet evalueringen vil finne sted. Dette kan gjøres ved å pakke strimlene i vått avispapir og plassere dem i en kjøler for transport eller overnatting frakt.
- Skyll gjørme og jord fra strimler i vann til strips er rent nok til at eksterne rusk ikke skjuler frø.
- Bruke saks for å klippe åpne en avdeling av gangen. Count spirer frøene og fjerne dem. Count klart døde frø (f.eks råtnende eller råtne frø). Plasser ungerminated frø på merket, våt Petri-sized blotter papir til ytterligere skille ungerminated, sovende, og døde frø.
- Plasser petriskåler med ungerminatedfrø i et vekstkammer sett for standard spireforhold: 25 ° C / 10 ° C 12 timers dag / natt. Tillat frø en uke for å spire. Enhver som gjør, teller disse som levedyktig, men ungerminated siden de ikke spire under feltforhold.
- Etter vekstkammeret behandling, resterende test ungerminated frø for levedyktighet ved hjelp tetrazoliumklorid (TZ) 13. For å oppnå dette, utgjør en prosent løsning av TZ passende for studie arter som bruker AOSA Tetrazolium Testing håndbok 14. For dette eksempel er en 1% oppløsning anvendt.
- Skjær ungerminated frøene i to og en halv plassere ble embryoet og stivelse er synlige i en petriskål inneholdende nok TZ oppløsning til å dekke frø (frø kan flyte, er dette i orden).
- Plasser TZ petriskåler i en inkubator innstilt på 30 ° C og vente 3 timer. Merk: Høyere temperaturer vil resultere i en raskere reaksjon, om ønsket, men overstaining er en risiko.
<li> Fjern petriskåler fra inkubatoren og evaluere. Frø som har farget rødt i embryoer er germinable, mens ufargede frø er døde. Ta kontakt med AOSA Tetrazolium Testing håndbok for mer detaljer om sært marginale saker og spesielle arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cross typer med variert mors foreldre og beskjære allel prosent (tabell 1) skilte seg over fjerning datoer prosent spirer, ungerminated, og døde frø (fig. 2 og 3). Ved hjelp av TZ testing av ungerminated frø, fant vi noen virkelig sovende frø på andre fjerning (tidlig vår) (tabell 2), mens alle frø ungerminated av den tredje fjerning (vår) ble funnet å være virkelig sovende.
Generelt lavere avlings allel prosenter redusert mistilpasset spiring senhøstes (fig. 2). Ved tidlig om våren fjerning, alle kryss typer hadde høy spiring, men skilte seg i sin andel døde og ungerminated (fig. 3). Spesielt krysstyper med crop mors foreldre hadde høyere dødelighet mens mors vill kryss typer var mer sannsynlig å forbli ungerminated. Innen våren,spiring falt for noen krysstyper. Mens counter-intuitive, er dette trolig på grunn av frø dødelighet innenfor grav striper til tidligere spirende krysstyper. Følgelig dødeligheten var høyere for flere kornlignende krysstyper (dvs. de med høyere avlings allel prosenter) produsert av plante mors foreldre (Fig. 3)
Figur 2. Spiring ved første fjerning sent i høst. Spiring av solsikke crop-wild krysstyper på første fraflytting, sent i høst. Cross typer er organisert på y-aksen ved å øke avlingen allel prosenter som merket. Maternal forelder er oppført først for hver av krysstypen. Spiring minste kvadraters middel (med SE stolper) etterfulgt av den samme bokstav er ikke signifikant forskjellig ved anvendelse av en Tukey-Kramer justering for multiple sammenligninger. Figur er tidligere publisert i: Pace, et al. (2015) 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Prosent Germinated, ungerminated, og dødeligheten for den andre fjerning (tidlig på våren) og tredje fjerning (vår). Prosent spirer for tidlig på våren (A), vår (B), prosent ungerminated for tidlig på våren (C), vår ( D), og prosent døde for tidlig om våren (E) og fjæren (F) fjerning datoer. Solsikke korn-vill hybrid krysstyper er organisert ved å øke avlingen allel prosentandeler, med den mest avling som på toppen av y-aksen og mest vill-lignende i bunnen av y-aksen. Cross typen mors foreldre er oppført først. minste kvadraten anordning for spirer, ungerminated og død frø (med SE stolper), etterfulgt av den samme bokstav er ikke signifikant forskjellig ved anvendelse av en Tukey-Kramer justering for multiple sammenligninger. Figur er tidligere publisert i: Pace, et al (2015) 15.. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| krysstypen | TZ Dormant | Standard feil |
| WxW | 0,071 | 0,0131 |
| WxBC | 0,041 | 0,0126 |
| WxF1 | 0,089 | 0,0136 |
| WxF2 | 0,054 | 0,0126 |
| F1xW | 0 | 0,0126 |
| F1xBC | 0,013 | 0,0126 |
| WXC | 0,075 | 0,0131 |
| F1xF1 | 0,007 | 0,0126 |
| F1xF2 | 0,013 | 0,0126 |
| CxW | 0 | 0,0126 |
| CxBC | 0 | 0,0126 |
| F1xC | 0 | 0,0126 |
| CxF1 | 0 | 0,0126 |
| CxF2 | 0 | 0,0126 |
| CXC | 0 | 0,0126 |
Tabell 2. Frø egnet til å bidra til en vedvarende frø bank. Minste kvadrat gjennomsnitt for prosentandelen sovende fraksjon av ungerminated frø ved den andre (tidlig på våren) fjerning. Frø ble bestemt til å være levedyktig ved hjelp tetrazolium kloride etter inkubasjon i gunstige spireforhold. Tabell er tidligere publisert i: Pace, et al (2015) 15..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi metoder for bruk av frø grav strips til å observere frøspiring, dvalen og dødelighet av ulike frø aksjer ved forutbestemte tidsperioder på feltet. Fordelene med å bruke strimler i stedet for individuelle pakkene ligger i (1) hastigheten av strimmelen og kammeret konstruksjon enn opprettelsen av individuelle pakker; og (2) den enkle og raske å fjerne flere avdelinger i en bevegelse uten fare for å utelate en pakke eller fjerne en utilsiktet. Som to av fjerning datoer i eksempelet som presenteres her var i vintermånedene når jorda er hard og feltforhold er kalde, reduserer denne metoden både arbeidskraft og potensialet for menneskelige feil. Seed strimler også hjelpe til eksperimentelle logistikken ved at forskere å random kompartment steder i laboratoriet på en måte som ikke kan endres av menneskelig svikt i felten. Gjennom valg av flyttetider som omfattet bredden i spådd naturlig spiring gangene vi vari stand til å gjøre slutninger om frøbank dynamikk i vårt eksempel potensialet for hybrid frø til å vedvare i frøbanken og bidra til fremtidige bestander. En begrensning ved denne metoden er at noen migrasjon av frø mellom kamrene kan være uunngåelig, avhengig av størrelsen på frøet. Av denne grunn (og som nevnt i protokollen) er det viktig at etterforskerne dobbeltsjekke høy temperatur lim sel mellom avdelinger for å minimere frø migrasjon.
Noen problemer med frø grav eksperimenter kan unngås ved å tenke klokt om timing. Velg begravelse og fjerning datoer til tider som er relevante for de naturlige sykluser av studie arter og studie mål. Det er best å plante så snart etter naturlig frø skur som mulig. Datoer for fjerning skal velges basert på observasjon av peak frøplante fremveksten tid for vurdering av normal spiring atferd; tillegg av tidligere dato gir også forskerne å fange opp tidlig spiring. Because vårt tidligere arbeid hadde indikert at noen mistilpasset spiring ble oppstår på grunn av fullstendig mangel på dvalen i enkelte kryss typer, valgte vi en veldig tidlig fraflytting bare et par uker etter begravelsen (fjerning 1, sen høst) 15, 16.
Fordelen med strips enn individuelle pakker er at et dusin eller flere rom kan være begravet, fjernes, og vurderes som en, noe som åpner for komplekse eksperimentelle design som involverer alt fra flere fjernings dateres til vanning eller nærings behandlinger. Etterforskerne bør passe på å konstruere blokker som gjør at behandlingene de er mest opptatt av forståelse for å være den viktigste effekten. Vårt eksempel strekes frø oppførsel over tid, men andre behandlinger kan anvendes som vil kreve hensyntagen til felt layout og replikere ordning i blokker i løpet av den eksperimentelle designfasen. Ved tilfeldig tildele stripe begravelse posisjon i blokker, kan fjerning tid analyseres som den viktigste effekten.
<p class = "jove_content"> Etter fjerning av frø strimler, forbereder en pre-merket stabel av Petri-sized blotter papir for hele stripen før vurdering begynner reduserer menneskelige feil. Tilsvarende åpning og evaluere et enkelt kammer i en tid bidrar til å opprettholde nøyaktighet. Når du plasserer ungerminated frøene i vekstkamrene, være sikker på at dag og natt temperaturer matche optimale frøspiring forhold for studie arter. Mens vanlige spireforhold (25 ° C / 10 ° C 12 timers dag / natt) kan være aktuelt for en rekke arter, er dette ikke tilfelle for alle arter.Tenk at TZ behandling søknad og evaluering av frø fargemønstre sterkt påvirker studien utfallet. Ved vurdering av ungerminated frøene etter at vekstkammeret behandling, konsultere litteratur (eller AOSA Tetrazolium Testing Håndbok 14) for riktig konsentrasjon av TZ for en gitt art. Mens bedømme enkelte TZ farget seeds, er det viktig å huske forskjellen mellom frø levedyktighet og et frø evne til å spire-svakt farget frø kan tyde respiring vev, noe som kan være i stand til å dukke opp fra jorda og produsere en frøplante. Det sagt, virkelig sovende frø er de som forblir ungerminated under optimale spireforhold, men når testet er fortsatt sterkt levedyktig. Disse frøene er de eneste frø egnet til å bidra til en vedvarende frøbank og spirer i årene fremover.
En rekke programmer for disse metodene er mulig utover de som er beskrevet her. Seed grav strimler kan tilpasses for nesten hvilket som helst antall eksperimentelle enheter og eksperimentelle design. De kan brukes til å sammenligne ulike arter, frø størrelser, eller vilkår / behandlinger. Ved å bygge på disse metodene har potensiale til å utdype kunnskap om grunnleggende frø biologi mange arter i en økologisk relevant sammenheng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small coin envelopes | Any | ||
| Large coin envelopes | Any | ||
| fine meshed polyester mosquito netting | Any | ||
| high-temperature glue gun | Any | ||
| high-temperature glue stick refills | Any | ||
| Industrial permenant markers | Any | ||
| plastic garden labels | Any | ||
| scissors | Any | ||
| Shovel | Any | ||
| Metal mesh hardward cloth | Any | ||
| Surveyor's flags, multiple colors | Any | ||
| Wet newspaper | Any | ||
| cooler | Any | ||
| blotter paper | Any | ||
| petri dishes | Any | ||
| Temp. controlled growth chamber | Any | ||
| razor blades | Any | ||
| Petri dishes | Any | ||
| Tetrazolium chloride | Any | ||
| water | Any | ||
| heat incubator | Any |
References
- Walck, J. L., Baskin, J. M., Baskin, C. C., Hidayati, S. N. Defining transient and persistent seed banks in species with pronounced seasonal dormancy and germination patterns. Seed Sci Res. 15 (3), 189-196 (2005).
- Alexander, H. A., Schrag, A. M. Role of soil seed banks and newly dispersed seeds in population dynamics of the annual sunflower. Helianthus annuus. J Ecol. 91, 987-998 (2003).
- Burnside, O. C., Wilson, R. G., Weiseberg, S., Hubbard, K. Seed longevity of 41 weed species buried 17 years in eastern and western. Weed Sci. 44 (1), 74-86 (1996).
- Baskin, C. C., Baskin, J. M. Seeds: Ecology, biogeography, and evolution of dormancy and Germination. , Academic Press. San Diego, CA. (2001).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Baskin, J. M., Baskin, C. C. A classification system for seed dormancy. Seed Sci Res. 14 (1), 1-16 (2004).
- Donohue, K., et al. Environmental and genetic influences on the germination of Arabidopsis thaliana in the field. Evolution. 54 (4), 740-757 (2005).
- Roach, D. A., Wulff, R. D.
- Pace, B. A., Alexander, H. M., Emry, J. D., Mercer, K. L. Seed fates in crop-wild hybrid sunflower: crop allele and maternal effects. Evol Appl. 8 (2), 121-132 (2015).
- Alexander, H. M., Emry, D. J., Pace, B. A., Kost, M. A., Sparks, K. A., Mercer, K. L. Roles of maternal effects and nuclear genetic composition change across the life cycle of crop-wild hybrids. Am J Bot. 101 (7), 1176-1188 (2014).
- Stewart, N. C., Matthew, J., Halfhill, D., Warwick, S. I. Transgene introgression from genetically modified crops into their wild relatives. Genetics. 4, 806-817 (2003).
- Mercer, K. L., Shaw, R. G., Wyse, D. L. Increased germination of diverse crop-wild hybrid sunflower seeds. Ecol Appl. 16, 845-854 (2006).
- Delouche, J. C., Still, T. W., Rapset, M., Lienhard, M. The tetrazolium test for seed viability. Mississippi Sta Uni Ag Exp Sta Techn Bull. 51, 1-63 (1962).
- Association of Official Seed Analysts. Tetrazolium Testing Handbook. , 653 Constitution Avenue NE, Washington, DC 20002, USA. (2010).
- Alexander, H. M., Emry, D. J., Pace, B. A., Kost, M. A., Sparks, K. A., Mercer, K. L. Roles of maternal effects and nuclear genetic composition change across the life cycle of crop-wild hybrids. Am J Bot. 10 (7), 1176-1188 (2014).
- Weiss, A. N., Primer, S. B., Pace, B. A., Mercer, K. L. Maternal effects and embryo genetics: germination and dormancy of crop-wild sunflower hybrids. Seed Sci Res. 23, 241-255 (2013).
