Summary
Lipider er kjent for å spille en viktig rolle i cellulære funksjoner. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å bestemme lipid sammensetningen av neutrofiler, med vekt på kolesterolnivået, ved å bruke både HPTLC og HPLC for å få en bedre forståelse av de underliggende mekanismene for nøytrofil ekstracellulær felle dannelse.
Abstract
Lipid analyser utført ved høy-ytelses tynnsjiktkromatografi (HPTLC) er en forholdsvis enkel, kostnadseffektiv metode for å analysere et bredt spekter av lipider. Funksjonen av lipider (for eksempel i vert-patogen interaksjoner eller vert inngang) er blitt rapportert å spille en avgjørende rolle i cellulære prosesser. Her viser vi en fremgangsmåte for å bestemme lipid sammensetning, med en vekt på kolesterolnivået av primære blodavledede nøytrofiler, ved HPTLC i sammenligning med høy ytelse væskekromatografi (HPLC). Formålet var å undersøke rollen til lipid / kolesterol endringer i dannelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (garn). NET frigivelse er kjent som en vertsforsvarsmekanisme for å hindre patogener i å spre seg inne i verten. Derfor, blodavledede humane neutrofiler ble behandlet med metyl-β-cyklodekstrin (MβCD) for å indusere lipid forandringer i cellene. Ved hjelp av HPTLC og HPLC, har vi vist at MβCD behandling av cellene fører til lipidforandringer assosiert med en signifikant reduksjon i kolesterol-innholdet i cellen. På samme tid, MβCD behandling av de nøytrofile celler førte til dannelse av garn, som vist ved immunofluorescens-mikroskopi. I sammendraget, her presenterer vi en detaljert metode for å studere lipid endringer i nøytrofile granulocytter og dannelsen av Nets.
Introduction
Lipider har vist seg å spille en viktig rolle i celle homeostase, celledød, host-patogen interaksjoner, og cytokin frigjørings en. Over tid har interesse for og kunnskap om virkningen av lipider i host-patogen interaksjoner eller betennelse økt, og flere publikasjoner bekrefter den sentrale rollen av visse lipider, spesielt steroid kolesterol, i cellulære responser. Farmakologisk behandling med statiner, som brukes som inhibitorer av kolesterolbiosyntese ved blokkering av 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzym-A-reduktase (HMG-CoA-reduktase), kan fungere som anti-inflammatoriske midler ved å senke serumnivået av interleukin 6 og C-reaktivt protein 2. Kolesterol- og Glycosfingolipid anriket strukturer kan brukes av flere patogener, slik som bakterier og virus, som en inngangsport til verten 3, 4, 5,class = "ekstern referanse"> 6. Sfingolipider (f.eks, sfingomyelin) er blitt vist å bli brukt av patogener for å fremme deres patogenitet 7. I makrofager, mykobakterier bruk kolesterolanriket domener for å komme inn i cellen; en reduksjon av kolesterol hemmer mycobakteriell opptak 8. Videre infeksjon av makrofager med Francisella tularensis, en zoonotisk middel ansvarlig for tularemia (også kjent som kanin feber) 9, førte til en infeksjon som ble opphevet når kolesterol ble uttømt fra membranene 10. På lignende måte ble det invasjon av vertsceller med Escherichia coli via fettrike konstruksjoner vist seg å være kolesterol-avhengige 4. Dessuten, Salmonella typhimurium smitteforsøk av epitelceller viste at kolesterol er avgjørende for patogen adgang inn i cellene 11. Kolesterol uttømming inhibited opptaket av Salmonella 11. Videre en fersk undersøkelse utført av Gilk et al. viste at cholesterol spiller en viktig rolle i opptaket av Coxiella burnetti 12. I tillegg Tuong et al. funnet at 25-Hydroxycholesterol spiller en avgjørende rolle i fagocytose av lipopolysakkarid (LPS) -stimulerte makrofager 13. Fagocytose ble redusert når makrofager ble farmakologisk behandlet for å utarme kolesterol 14. Således, kolesterol og andre lipider synes å spille en viktig rolle i inflammasjon og infeksjon, siden deres utarming kan redusere risikoen for invasjon fra flere patogener 10, 11, 12.
Nylig var vi i stand til å vise at Lipidendringer, spesielt uttømming av kolesterol fra celle, indusere dannelsen av nøytrofil extracellular feller (garn) i humane, blodavledede nøytrofiler 15. Siden oppdagelsen av garn i 2004, har de vist seg å spille viktige roller i bakterie entrapment, og dermed i å hindre spredning av smitte 16, 17. NET består av en DNA-ryggrad forbundet med histoner, proteaser, og antimikrobielle peptider 16. Frigjøringen av garnene med nøytrofiler kan induseres av invaderende patogener 18, 19 og kjemiske substanser som forbol-myristat-acetat (PMA) eller statiner 16, 20. Men de detaljerte cellulære mekanismene, og spesielt den rollen av lipider i denne prosessen, er fortsatt ikke helt klart. Analysen av lipider kan føre til en bedre forståelse av de som er involvert i en rekke forskjellige cellulære prosesser og interaksjoner, for eksempel frigjøring av NET mekanismer. Cholesterol og sfingomyelin er viktige bestanddeler i cellemembranen og lipid mikrodomener, hvor de legger stabilitet og lette gruppering av de som er involvert i proteinhandel og signaleringshendelser 21 proteiner. For å undersøke den mekanistiske rolle av visse lipider, amfifile farmakologiske midler, så som cyklisk oligosakkarid metyl-β-cyklodekstrin (MβCD), kan brukes til å endre den lipidsammensetningen av en celle og for å redusere kolesterol in vitro 15. Her presenterer vi en metode for å bruke HPTLC for å analysere den lipidsammensetningen av nøytrofiler som respons på MβCD. HPLC ble brukt til å bekrefte nivået av kolesterol i nøytrofile befolkningen. Videre beskriver vi en fremgangsmåte for å visualisere dannelsen av nett ved immunofluorescens-mikroskopi i humane, blodavledede nøytrofiler som respons på MβCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samlingen av perifert blod i denne protokollen ble godkjent av lokale menneskelige forskningsetikk provisjon. Alle mennesker gitt sin skriftlig informert samtykke.
1. Isolering av human blodavledede Neutrophils ved densitetsgradientsentrifugering
- Isolering av humane, blodavledede nøytrofiler
- Lag ~ 20 ml blod på 20 ml av natrium-diatrizoat / dekstranoppløsning nær en flamme og uten blanding.
- Sentrifuger i 30 minutter ved 470 x g uten brems.
- Fjern de mononukleære celler og den gulaktig plasmalaget. Overfør polymorfnukleær celle (PMN) fase (annen fase med akkumulerende celler; figur 1 og 2) inn i en ny 50 ml rør og fylle det opp til 50 ml med 1 x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Sentrifuger i 10 minutter ved 470 xg med brems.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 5 ml sterilt vann for skyvr 5 s for å lysere erytrocytter.
- Umiddelbart fyll opp til 50 ml med 1 x PBS og sentrifugeres i 10 min ved 470 x g.
- Fjern supernatanten. Pelleten skal være hvite. Hvis det fortsatt er rødt, gjentar du trinn 1.1.5 og 1.1.6.
- Resuspender pelleten i 1000 mL av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium. Telle celletallet ved hjelp av trypanblått-farving i et hemocytometer under et lysmikroskop.
- Fremstill en cellesuspensjon i RPMI i en konsentrasjon på 2 x 10 6 / ml. Omtrent 2,5 x 10 7 neutrofiler kan høstes fra 20 ml blod.
- Farmakologisk behandling av nøytrofile celler til lipid analyse
- Bruk 5 x 10 7 celler fra trinn 1.1.9. Juster celletallet i ren Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) medium i nærvær eller fravær av 10 mM MβCD eller 25 nM PMA i et totalt volum på 300 ul i et 1,5 ml reaksjonsrøret.
- Inkuber prøvene iReaksjonsrørene i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Sentrifuger i 10 minutter ved 470 xg med brems.
- Fjern supernatanten og cellepelleten suspenderes i 300 ul HBSS.
- Sentrifuger i 10 minutter ved 470 xg med brems.
- Cellepelleten suspenderes i 1 ml kloroform / metanol (1: 1), homogenisere den med en 26-G kanyle ved å suge prøven inn og ut i en 1 mL sprøyte 10 ganger, og lagrer prøvene ved -20 ° C.
- Farmakologisk behandling av nøytrofile celler for NET kvantifisering ved immunfluorescens
- Tilberede poly-L-lysin-belagte 48-brønners plater med dekkglass.
- Plasser en 8 mm glass dekkglass i hver brønn, tilsett 55 ul sterilt 0,01% Poly-L-lysin, og inkuber i ~ 20 minutter ved romtemperatur (RT).
- Vask to ganger med 200 ul av 1 x PBS. Oppbevar platene med 200 ul av 1 x PBS per brønn i et kjøleskap inntil bruk.
- Bilefully det tilsettes 100 ul cellesuspensjon (2 x 10 5/100 ul) fra trinn 1.1.9 per brønn i midten av hver dekkglass.
- Tilsett 100 ul pr brønn av enten den endelige 10 mM MβCD eller den avsluttende 25 nM PMA.
- Sentrifuger i 5 min ved 370 x g med brems.
- Inkuber i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Sentrifuger i 5 min ved 370 x g med brems.
- Fikser cellene med 155 ul 4% PFA, pakk dem inn i plastfilm parafin, og lagre dem over natten ved 4 ° C eller i 10 minutter ved RT.
NB: For data på NET dannelse indusert av MβCD, se Neumann et al. 15.
- Tilberede poly-L-lysin-belagte 48-brønners plater med dekkglass.
2. Lipid Isolering og analyse av humane, blodavledede Neutrofiler
- Isolere lipider fra humane perifere blod-avledet nøytrofiler basert på Bligh og Dyer 22 og Brogden et al. 23
- På is, pipette neutrofilene (tilstede i metanol og kloroform-løsning) til et 15 ml skrukork glassrør med en polytetrafluoretylen (PTFE) sel og homogenisere dem ved risting i 1 min. Bruk glassrør for å hindre at lipidene fra å binde seg til plastoverflater. Bruk PTFE-hetter for å hindre forurensning fra gummi / plast.
- Tilsett 2 ml metanol, etterfulgt 1 min senere av 1 ml kloroform. Rist på nytt i 1 minutt.
- Rotere glassrørene ved romtemperatur og 50 omdr./min i 30 min.
- Nedsentrifugering av proteinfraksjonen ved sentrifugering av løsningen ved 7 ° C og 1952 x g i 10 min.
- Dekanter supernatanten forsiktig inn i en ny 15 ml glassrør med skrukork, slik at det proteininneholdende pellet bak. Oppbevar pellet ved -20 ° C for senere kvantifisering.
- Tilsett 1 ml kloroform, vent i 1 min, tilsett 1 ml dobbeltdestillert vann, og invertere glassrør med skrukork med prøven i 30 sekunder.
- Hvis det er nødvendig, utføre et eventuelt ytterligere rensetrinn ved å gjenta trinn 2.1.8.
- Tørk prøvene i en vakuum-konsentrator ved 60 ° C og lagres ved -20 ° C inntil bruk.
- Fremstille de følgende fire drifts løsninger og fargeløsning.
- Løsning 1: Bland etylacetat (26,6%), 1-propanol (26,6%), kloroform (26,6%), metanol (26,6%), og kaliumklorid (9,6%). Forbered KCl ved oppløsning av 0,25 g KCl i 100 ml av HPLC-kvalitet vann.
- Løsning 2: Bland n-heksan (73%), dietyleter (23%), og sitronsyre (2%).
- Løsning 3: 100% n-heksan.
- Fremstill den fargeløsning etterblande destillert vann (90 ml) behandles med 7,5 g kobbersulfat, og deretter legge til 10 ml av fosforsyre.
- Fyll opp til 5 mm av hver oppløsning i en separat glasskammer. Legg til en hvilken som helst form for filterpapir for å øke løpehastigheten i hvert kammer.
- Pre-inkubere en 20 x 10 cm HPTLC silikagel 60 glassplate i det første ventil løsning inntil løpe oppløsningen når toppen av platen. Deretter tørkes det i 10 minutter ved 110 ° C.
MERK: Disse plater kan lagres for fremtidig bruk i aluminiumsfolie, og tørket i 10 minutter ved 110 ° C før bruk. - Oppløs lipid pellet oppnådd fra trinn 2.1.10 i 200 ul kloroform / metanol (1: 1) løsning og inkuberes i 15 min ved 37 ° C for å oppløse.
- Bruke en linjal og en myk blyant for å markere lasting stedene for det ønskede antall prøver, pluss minst ett standard. Mark kjørt distanse på omtrent 4 cm og 6 cm for det første og annet ventil løsning, henholdsvis.
- For å laste prøven, vasker den 10 mL sprøyte 3 ganger i kloroform / metanol (1: 1) før lasting hver ny prøve. Legg 10 ul av hver prøve dråpevis, prøver å konsentrere prøven på så lite areal som mulig. Prøver som skal lastes i det minste i duplikater.
- Sett platen loddrett inn i det første kammeret med rennende oppløsning 1 (trinn 2.2.1.1). Sikre at platen er parallell med veggen av glasskammer for å oppnå en jevn migrasjonshastighet.
- Når oppløsningsmidlet linjen har nådd det første merket, fjerne platen, tørker den og plasserer den i den andre oppløsning. Gjenta tilsvarende trinnene for den andre og for tredje drifts løsninger; la platen i løsningen inntil oppløsningsmiddelfronten når toppen av platen, og deretter fjerne og tørke den ved romtemperatur i 1 min.
- Plassere platen i kobbersulfatoppløsning i 7 s. Fjern platen, tørkes grundig, og bake den i en ovn i 7 minutter ved 170 ° C. Vent på platen avkjøles.
- USIng et tynnsjiktskromatografi og gel-analyse-programvare, samt en bildebehandling, skanner og analysere som tidligere beskrevet av Brogden et al. 23.
- Fest en 100 x 4,6 mm kolonne til en 5 um / 4,6 mm vakt patron og varme den til 32 ° C. Bruker metanol som den mobile fase ved en strømningshastighet på 1 ml / min ved 65 bar og en UV-detektor for måling ved 202 nm for å kvantifisere mengden av kolesterol i hver prøve.
- Vask HPLC maskinen grundig før analysering av prøver, å utføre følgende trinn: rengjøring av pumpen, vasking av nålen, skylling potten, spyling av sprøyten, og vasking av pumpen spylingen. Vask alle med vann. Til slutt, utføre et system spyling med metanol ved en strømningshastighet på 5 ml / min i 5 minutter.
- For å etablere en standardkurve kolesterol, tilberede minst 4 konsentrasjoner som variererfra 0,05 mg / ml til 2 mg / ml av kolesterol i kloroform / metanol (1: 1) 24.
- Resuspender prøvene oppnådd fra trinn 2.1.10 i 500 ul kloroform / metanol (1: 1) i ravfarvet 1,5 mL glass flasker med skrukork rød PTFE / silikon hvite lokk.
- Kvantifisere konsentrasjonene kolesterol ved hjelp av standard fremstilt i trinn 2.3.3.
MERK: Fyll i prøvetagnings protokollen, som starter med den minst ene standard og en negativ kontroll, fulgt av prøvene. - Uttrykke resultatene som arealet under kurven og sammenligner mellom de aktuelle eksempler ved å bruke en hvilken som helst statistisk programvare.
MERK: Resultatene kan også kvantifiseres mot en standard kurve, og kan vises som den totale kolesterol mengde per ml, g eller antall celler. Standardkurven ligning bør beregnes ved bruk av verdiene oppnådd i trinn 2.3.3.
3. visualisering og kvantifisering av nøter
- Visualization av nøter
MERK: visualisering av NET er basert på tidligere publisert arbeid av Neumann et al. 15.- Vask de faste prøver fra trinn 1.3.8 tre ganger med 200 ul av 1 x PBS.
- Blokk og permeabilisere med 100 ul 2% BSA, 0,2% Triton X-100 i PBS per brønn i 45 minutter ved RT.
- Tilsett 100 ul av primære antistoffer: mus monoklonalt anti-DNA-histon-1-antistoff (fortynne massen med 2,2 mg / mL, 1: 5000 i PBS inneholdende 2% BSA og 0,2% Triton X-100) eller polyklonalt antistoff mot myeloperoksidase (MPO; kanin anti-MPO; fortynne 1: 300 i PBS inneholdende 2% BSA og 0,2% Triton X-100). Inkuber over natten ved 4 ° C.
- Vask 3 ganger med 200 ul av 1 x PBS.
- Tilsett 100 ul av det sekundære antistoff (fluorescens-merket geit anti-mus; 1: 1000 i BSA-PBS-Triton X-100 og geit anti-kanin, 1: 1 000 BSA-PBS-Triton X-100) i 1 time ved RT i mørket.
- Vask 3 ganger med 200 & #181; l av 1 x PBS.
- Dekk fjerne ved hjelp av pinsett og plassere dem med forsiden ned med 3 ul av monteringsmedium inneholdende DAPI på objektglass.
- Undersøke prøvene ved hjelp av et konfokalt omvendt-basen fluorescens mikroskop utstyrt med en HCX PL APO 40X 0,75-1,25 oljeimmersjonsobjektiv 15.
- Kvantifisering av netto-frigjørende kjerner
- Åpne et bildebehandlingsprogram (f.eks ImageJ) og dra og slipp bilde av interesse i verktøylinjen.
- Klikk på "Plugins", "analysere" og "celleteller."
- Trykk på "Initialize" -knappen i telleren vinduet og velge en teller type (f.eks, klikk på syv i rødt for NET-frigjørende celler og 8 i gult for ikke-frigjørende celler, som vist i figur 6B-I og II).
MERK: Kriteriene for NET-positive celler: Positively farget grønn kjerne + et mindre tett nucleus (tap av lobulation) eller et tap av den runde formen på kjernen + en økt størrelse på kjernen, eller en forekomst av en distinkt ekstracellulært avlegger. - Klikk hver celle man følger til de ovennevnte kriteriene og skrive regnet celle tall i en datablad av en analyse programvare.
- Beregne hvor stor andel av netto-frigjørende celler ved anvendelse av det opptalte celletallet fra NET-frigjørende og ikke-frigjørende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Humane, blodavledede neutrofiler ble isolert ved tetthetsgradient sentrifugering (figur 2). For å undersøke virkningen av lipid forandringer ved neutrofiler ble cellene behandlet med 10 mM MβCD, som tømmes kolesterol fra cellen. Deretter ble lipidene isolert fra prøvene etter Bligh og Dyer (figur 1, venstre panel), som beskrevet av Brogden et al. 23. De fremstilte lipid prøvene ble applisert på silikagel HPTLC-plater og løp ved hjelp av en tre-løsning protokoll, som har blitt optimalisert for å separere og å visualisere et bredt spekter av lipider, inkludert kolesterol, kolesterolestere, sfingomyelin, fosfolipider, og triacylglycerides, frie fettsyrer , monoacylglyserol, fosfatidyletanolamin, kardiolipin, fosfatidylserin og fosfatidylcholin (figur 3A). Oksygenerte derivater av kolesterol (oxysterols) er ikke detekterbare wed denne metode. En ytterligere kvantitativ analyse av kolesterol ble utført ved anvendelse av HPLC (figur 3B). Regresjonen verdi for kolesterol var markert bedre ved bruk av HPLC (figur 4A) sammenlignet med HPTLC (figur 4B). For å visualisere garnene ble cellene stimulert med de ovenfor nevnte stimuli, fiksert og farget for DNA / histon-1 (grønn), MPO (rød), og DNA (blå) som typisk NET-markører (Figur 5A). Som vist i figur 5A, en tydelig forekomst av MPO, DNA / histon 1, og DNA som forekommer i garnene når cellene ble behandlet med 10 mM MβCD i 2 timer. Deretter ble effekten av kolesterolreduksjon ble mikroskopisk analysert. Derfor, cellene ble farget for DNA (blå) og DNA / histon 1 (grønn), og NET-frigjørende kjerner ble tellet ved bruk av celleteller plugin fra bildebehandling ImageJ (figur 5B). Ubehandlet nøytrofile fungerte som en kontroll for spontaneounetto dannelse (figur 5B-i). I den viste figuren er det en netto frigjøring i ubehandlede neutrofiler etter 2 timers inkubering var 3,89%, mens ved behandling av cellene med 10 mM MβCD resulterte i 35,17% NET dannelse (figur 5B).
Figur 1: Skjematisk viser trinnene som er involvert i å bestemme lipidsammensetning og ekstracellulære felle frigivelse fra humane, blodavledede nøytrofiler. Neutrofiler ble isolert ved hjelp av en densitetsgradient og behandlet med metyl-β-cyklodekstrin (MβCD) for å indusere Lipidendringer og NET dannelse. Deretter blir lipider isolert og analysert ved hjelp av enten HPTLC eller HPLC, og garn blir visualisert og kvantifisert ved immunfluorescens.
Figur 3: HPTLC og HPLC-analyse av lipider isolert fra nøytrofiler. (A) Standard anvendt for å identifisere tilstedeværende lipider i neutrofiler via HPTLC (venstre felt). CE: Kolesterol estere, TG: Triacylglycerides, FFA: Gratis fettsyrer, Chol: Kolesterol, MG: monoacylglycerolen, PE: fosfatidyletanolamin, CL: kardiolipin, PS: fosfatidylserin, PC: Phosphatidylcholine, og SM: sphingomyelin. (B) representativt resultat som viser en kolesterol-spesifikke topp for 2 mg / ml ved 4.980 min ved anvendelse av HPLC-protokollen beskrevet her.
Figur 4: HPLC og HPTLC analyser av kolesterol. Grafer som viser forholdet mellom kolesterolkonsentrasjonen og område, som målt ved HPLC (A), og båndintensiteten, som målt ved HPTLC (B). Den minimale deteksjonsgrensen for HPLC var 0,0016 mg / ml, med en regresjon verdi for standardkurven av 0,998 N = 3, SEM (A). Kolesterol i området fra 2 mg / ml ned til 0,05 mg / ml kan være semi-kvantifisert ved bruk av HPTLC (B), med et minimum deteksjonsgrensen på 0,05 mg / ml N = 3, SEM. Regresjonen verdi for den HPTLC standardkurven er 0,918.
Figur 5: Representative fluorescens mikrografer som viser nettstrukturer og subsequent NET kvantifisering. (A) Neutrofiler stimulert med 10 mM MβCD i 2 timer og ble farget for (ii) MPO (red), (iii) DNA / histon-1 (grønn), og (iv) DNA (blå). (I) overlapping av (ii), (iii) og (iv). (B) Cellene ble inkubert i 2 timer med (i) HBSS medium eller (ii) 10 mM MβCD, og frigjorte garn var farget for kjerner (blå) og DNA / histongenene 1 (grønn). NET-negative kjerner ble merket med telleren 8 (gul) og NET-positive kjerner med telleren 7 (rød).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene som beskrives her, kan brukes til å analysere bestemte lipider, så som kolesterol, ved HPTLC eller HPLC, og for å undersøke effektene av farmakologiske Lipidendringer på dannelsen av NET (se Neumann et al. 15).
HPTLC er et forholdsvis kostnadseffektiv og enkel metode for å analysere et bredt spekter av lipider i et stort antall prøver. Denne metoden har vært brukt i mange forsknings- områder, inkludert antibiotika kvantifisering 25, lipid lagring i lysosomale lagringssykdommer 26, og bestemmelse av kolesterol og cholesterylglucoside nivåer i epitelceller 27. Metoden som beskrives her ble modifisert og optimalisert for å isolere lipider fra et renset nøytrofile populasjon; imidlertid, kan en litt modifisert versjon også anvendes for å isolere lipider fra vevsprøver (se Brogden et al. 23). Ved hjelp av dette møttehod, lipider kan også bli effektivt separert, identifisert, og semi-kvantifisert mot en kjent standard. Et kritisk trinn i denne metode er bruken av den respektive heter buffer, ettersom bruken av en hvilken som helst annen buffer eller medium kan føre til forurensning lipid og lipid uspesifikke bånd i prøvene. Fordi følsomheten er begrenset med HPTLC, bør HPLC bli anvendt som en mer nøyaktig metode for absolutt kvantifisering.
HPLC muliggjør kvantifisering og identifisering av kolesterol og dens forskjellige former eller derivater ved å utføre en sammenligning med en kjent lipid. Ved å bruke den protokoll som er beskrevet ovenfor, er det mulig å sikkert kvantifisere ned til 0,0016 mg / ml kolesterol (figur 4A), med et lineært forhold mellom opp til 10 mg / ml (R = 0,990). Den HPTLC Måten muliggjør kolesterol deteksjon ned til 0,05 mg / ml, men med en sigmoid kurve og en lavere korrelasjonskoeffisient med R = 0,906 (figur 4B). Jo høyere følsomhet og høyere korrelasjon koeffisient gjør således HPLC et mye overlegen metode for nøyaktig kvantifisering av lipider, som senere gjør det mulig å bli detektert mindre forskjeller mellom prøvene. Imidlertid kan begge metoder brukes i kombinasjon; HPTLC kan brukes for å få en oversikt i hvilke lipidene kan endres, og HPLC kan bli anvendt i en mer målrettet metode for å kvantifisere forskjellen mellom et bestemt lipid i en gitt prøve. Når man sammenligner målingene med de verdier som oppnås med andre 28, 29, er mindre kolesterol kvantifisert i totalt antall nøytrofile. Dette kan forklares med den metoden som er benyttet. Andre studier benyttet en fluorimetrisk deteksjon, som er basert på en enzymkoplet reaksjon som påviser både fri kolesterol og cholesterylesters.
Her, HPTLC og HPLC blir brukt i kombinasjon for å verifisere at MβCD fører til en betydelig reduksjon av kolesterol som også tidligere er vist av Gorudko et al.ss = "ekstern referanse"> 28. De viste en 60% reduksjon av kolesterol i nøytrofiler med 10 mM MβCD. I tillegg kan en liten reduksjon av sfingomyelin nivå, men ikke kolesterolestere var påvisbar i de nøytrofile celler når de ble behandlet med MβCD (se Neumann et al. 15). På samme tid, uttømming av kolesterol fører til dannelse av nett (se Neumann et al. 15). Disse finne korrelerer godt med det fenomen at behandling av nøytrofile celler med statiner, inhibitorer av 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzym A (HMG-CoA), det hastighetsbegrensende enzym i biosyntesen av kolesterol, øker dannelsen av garn. Men siden statin behandling av nøytrofile celler utviser sterkere NET induksjon sammenlignet med MβCD behandling (se Neumann et al. 15 og Chow et al. 20), ytterligere effekter av statiner for eksempel på prenylated membran-forankret effektor protemoduler kan også være involvert i dannelsen av garn.
Dannelsen av nøter er en forholdsvis ny beskrevet vertens motstandsmekanisme. De ekstracellulære DNA Fibrene har nå blitt beskrevet, ikke bare hos pattedyr 30, 31, men også i kylling, fisk, reker, og plantene 32, 33, 34, 35. Ved stimulering av nøytrofile celler med patogener eller andre stimuli, er garn frigjøres i det ekstracellulære rom, hvor de innfange og muligens drepe invaderende patogener 36. Studerer lipidsammensetningen av et aktivert nøytrofil kan hjelpe til å forstå de cellulære mekanismer som formidler dens antimikrobielle aktivitet. Siden vi målte bare den totale lipid nivået av de nøytrofile celler, gjenstår det å være bestemt hvor lipidinnholdet er forskjellig og er påvirket av MβCD i helcelle versus plasma membraner og mellom forskjellige membranmikrodomener. Dette krever imidlertid spesifikke membranseparasjonsfremgangsmåter som tidligere er beskrevet (Xu et al.). 37
Dessuten kromatin, humane NET inneholde flere nøytrofile proteiner, så som MPO; elastase, det antimikrobielle peptidet LL-37; eller calgranulin 17, 36. Nyere forskning har fokusert mye på rollen til de spesifikke proteiner og morfologiske endringer, som initierer og letter dannelsen av nett 15, 38, 39. Men så langt er det bare begrenset kunnskap om viktigheten av visse lipider i løpet av denne prosessen 15, 20. Derfor er dette en spesielt interessant område å bli utforsket nærmere i fremtiden. Endelig kunnskap på lipidmembranen modifikasjonerkan tjene som en basis for terapeutiske tilnærminger for å styrke immunforsvaret mot infeksjoner. Som et eksempel ble det vist at uttømming av kolesterol kan hjelpe i å bekjempe antibiotikaresistente patogener som H. pylori, ettersom det ble påvist at kolesterol forbedrer motstanden av de insektene mot antibiotika og antimikrobielle peptider 40. Lignende studier kan være nyttig for å forstå host-patogen interaksjoner med ulike bakteriearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et fellesskap av Akademie für Tiergesundheit (AFT) og et fellesskap fra PhD-programmet, "Animal og Zoonotiske infeksjoner," ved University of Veterinary Medicine, Hannover, Tyskland, gitt til Ariane Neumann.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1x working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| ImageJ | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µL syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26 G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 mL | BD Bioscience | 309659 | |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E.
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M.
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
