Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Инструменты для изучения роли архитектурного белка HMGB1 в обработке Helix искажающие, Сайт-специфическая ДНК Interstrand сшивок

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54678
Automatic Translation
1, 1
1Division of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, The University of Texas at Austin

Abstract

Группа коробки Высокая мобильность 1 (HMGB1) белок представляет собой негистоновых архитектурный белок, который участвует в регуляции многих важных функций в геноме, такие как транскрипции, репликации ДНК и репарации ДНК. HMGB1 связывается с структурно искаженный ДНК с более высоким сродством, чем к каноническому B-ДНК. Например, мы обнаружили, что HMGB1 связывается с ДНК interstrand сшивок (МКСТ), которые ковалентно связывают две нити ДНК, вызывают искажение спирали, и если оставить неотремонтированный может привести к гибели клеток. Из-за их цитотоксическое, несколько ICL индуцирующие агенты в настоящее время используются в качестве химиотерапевтических агентов в клинике. В то время как ICL-агенты , формирующие показывают предпочтения для определенных последовательностей оснований (например, 5'-TA-3 'является предпочтительным местом для сшивания псорален), они в значительной степени вызывают повреждение ДНК в неизбирательным образом. Тем не менее, путем ковалентного связывания ИКЛ-индуцирующего агента к триплекс-образующих олигонуклеотидов (ФБПС), который связывается с ДНК в последовательности конкретныхСпособ, целевое повреждение ДНК может быть достигнута. Здесь мы используем TFO ковалентно конъюгированный с 'концом к 4'-гидроксиметил-4,5' в 5, 8-trimethylpsoralen (ГМТ) псорален, чтобы создать сайт-специфическую ICL на мутацию репортерной плазмидой, чтобы использовать в качестве инструмента изучить архитектурные изменения, обработки и ремонта сложных повреждений ДНК с помощью HMGB1 в клетках человека. Описаны экспериментальные методы для подготовки ФБПС-направленных ICLS на репортер плазмид, и допросить ассоциацию HMGB1 с ФБПС направленными ICL, в сотовой связи с использованием хроматин иммунопреципитации. Кроме того, мы опишем суперспирализацию анализы ДНК, чтобы оценить конкретную архитектурную модификацию поврежденной ДНК путем измерения количества оборотов сверхвитков введенных на псоралена-сшитый плазмиды HMGB1. Эти методы могут быть использованы для изучения роли других белков, участвующих в обработке и ремонту ТФО-направленных ICL, или других повреждений целевой ДНК в любой клеточной линии, представляющей интерес.

Introduction

Триплекс-образующих олигонуклеотидов (TFOs) связывают дуплекса ДНК в моде последовательности конкретных посредством связывания Хугстена-водорода с образованием тройной спиральные структуры 1-5. Триплекс технология была использована , чтобы допросить ряд биомолекулярных механизмов, таких как транскрипции, репарации повреждений ДНК и генного таргетинга (обзор в ссылках 6-8). TFOs широко используются для индукции сайт-специфического повреждения репортерных плазмид 9,10. Наша лаборатория и другие ранее использовали ФБПС, AG30, привязанный к псоралена молекулы индуцировать сайт-специфических ДНК interstrand сшивок (МКСТ) в гене supF на плазмиды pSupFG1 5,10-12. ICLS весьма цитотоксическое , как эти поражения ковалентного две нити ДНК, и , если оставить неотремонтированный, может блокировать транскрипцию генов и препятствовать механизм репликации ДНК 13,14. Из-за их цитотоксическое, ICL-индуцирующие агенты были использованы в качестве химиотерапевтических препаратов при лечениирака и других заболеваний 15. Тем не менее, обработка и ремонт ICL, в клетках человека не очень хорошо понял. Таким образом, более глубокое понимание механизмов, участвующих в обработке ICL, в клетках человека может помочь улучшить эффективность ICL на основе химиотерапевтических препаратов. ФБПС-индуцированные ICLS и их промежуточные ремонт имеют потенциал, чтобы вызвать значительные структурные искажения в спирали ДНК. Такие искажения являются вероятные цели для архитектурных белков, которые связываются с искаженной ДНК с более высоким сродством , чем к канонической В-форме дуплексной ДНК 16-20. Здесь мы изучали ассоциацию весьма обильной архитектурного белка, HMGB1 с ICL, в клетках человека с помощью иммунопреципитации хроматина (CHIP) анализов на псорален-сшитый плазмид и определили роль HMGB1 в модуляции топологии псоралена-сшитой ДНК плазмиды в человека раковых клеток лизатов.

HMGB1 является весьма обильны и повсеместно экспрессируется без еготон архитектурный белок , который связывается с поврежденной ДНК и альтернативно структурированных субстратов ДНК с более высоким сродством , чем каноническая В-формы ДНК 17-20. HMGB1 участвует в нескольких процессах ДНК метаболизма, таких как транскрипции, репликации ДНК и репарации ДНК 16,21-23. Ранее мы показали , что HMGB1 связывается с ТФО направленными ICL , в пробирке с высоким сродством 20. Кроме того, мы показали , что отсутствие HMGB1 увеличил мутагенный обработку ФБПС-направленных ICL , и определил HMGB1 как ремонт нуклеотид иссечения (РЭК) кофактора 23,24. В последнее время , мы обнаружили , что HMGB1 связан с ТФО направленными ICL , в клетках человека и его набор таких поражений зависит от белка Нирова РФА 16. Отрицательный сверхспирализация ДНК было показано , способствовать эффективному удалению повреждений ДНК с помощью НЭК 25, и мы обнаружили , что HMGB1 вызывает отрицательную суперспирализацию преимущественно на ФБПС-направленных ICL-содержащих пласередине подложки (относительно неповрежденных плазмид субстратов) 16, обеспечивая лучшее понимание потенциальной роли (ами) HMGB1 как NER кофактора. Обработка ICL, до конца не изучен в клетках человека; Таким образом, методы и анализы, разработанные на основе молекулярных инструментов, описанных здесь, может привести к идентификации дополнительных белков, участвующих в ICL ремонта, которые в свою очередь могут служить фармакологические мишени, которые могут быть использованы для повышения эффективности химиотерапии рака.

Здесь, эффективный подход к оценке эффективности ТФО-направленного формирования ICL в плазмидной ДНК с помощью денатурирующего электрофореза в агарозном геле обсуждалось. Кроме того, с помощью плазмид, содержащих ТФО направленный ICLS, методы для определения ассоциации HMGB1 с ICL-поврежденных плазмид в клеточном контексте с использованием модифицированных анализов щепу были описаны. Кроме того, легкий способ для изучения топологических изменений, вносимых гое архитектурный белок HMGB1, в частности, на ICL поврежденных плазмидных субстратов в лизатах клеток человека были определены путем выполнения суперспирализацию анализов с помощью двумерного электрофореза в агарозном геле. Методики, описанные могут быть использованы для дальнейшего понимания участия репарации ДНК и архитектурных белков в обработке целевых повреждений ДНК на плазмид в клетках человека.

Опишем подробные протоколы для формирования ТФО сайт-специфические псорален ICL, на плазмидной ДНК, и последующей плазмиды жечных и суперспирализацию анализы для идентификации белков, которые ассоциированы с повреждениями, а также белки, которые изменяют топологию ДНК, соответственно. Эти анализы могут быть модифицированы, чтобы выполнить с другими ДНК-повреждающих агентов, TFOs, плазмидной субстратов и млекопитающих клеточных линий, представляющих интерес. На самом деле, мы показали , что существует по крайней мере один потенциальный уникальный и высокое сродство ТФО-связывающий сайт в пределах каждого аннотированного гена в геноме человека 26. Каккогда - либо, для ясности, мы описали эти методы для использования конкретного псорален-конъюгированного TFO (pAG30) на определенной мутации репортер плазмиды (pSupFG1) в клетках U2OS человека , как мы использовали в Мукерджи & Vasquez, 2016 г. 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Получение ФБПС-направленных ICL, на плазмидной подложках

  1. Выдержите эквимолярные количества плазмиды pSupFG1 10,11 ДНК (плазмидной ДНК 5 мкг является хорошей отправной точкой) с псоралена-конъюгированного ФБПС AG30 в 8 мкл триплекс буфера для связывания [50% глицерина, 10 мМ Трис (рН 7,6), 10 мМ MgCl 2] и дН 2 O до конечного объема 40 мкл в янтарной трубки. Тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируйте реакции при бане 37 ° C воды в течение 12 ч.
  2. Подогреть UVA лампу, чтобы обеспечить полную мощность. Поместите реакцию триплекс на парафиновой пленки, и поместите парафиновой пленки на льду под UVA (365 нм) лампы. Поместите майларовую фильтр между лампой и реакции.
  3. UVA облучить для суммарной дозы 1,8 Дж / см 2. Хранить образцы при температуре 4 ° С для последующего использования.
    Внимание: Носить соответствующую защитную одежду и защитные очки с УФ облучения.
  4. Линеаризацию 200 нг полученного выше плазмиды с повторнымстрикция фермент Eco R1 в 20 мкл общего объема с помощью производителя поставляется 10х буфера. Тепло денатурации фермента в течение 20 мин при 65 ° С. Спин образцов в течение 10 мин при 10000 х г и хранят при температуре 4 ° С.
  5. Подготовка 50x щелочного буфера [1,5 М NaOH, 50 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)]. Добавить 0,5 мг агарозы 50 мл дН 2 O. Отварить, чтобы растворить агарозы и поместить его в водяной бане 50 ° C.
  6. После того, как температура растворенного агарозу вплоть до 50 ° С, добавляют 1 мл 50x щелочного буфера, перемешать, а затем налить гель в лоток гель. Дайте время гель для отверждения при комнатной температуре перед использованием.
  7. Добавляют 4 мкл 0,5 М ЭДТА до 20 мкл линеаризованной ДНК образца и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.
  8. Добавить 6х щелочной гель загрузочного буфера (300 мМ NaOH, 6 мМ ЭДТА, 18% (вес / объем) с высокой молекулярной массой полисахарид, 0,06% Бромкрезоловый Зеленый в дН 2 O) к образцам и к лестнице ДНК в 1 кб.
    Примечание: Важно использовать 6х щелочной буфер гель загрузки, пожалуйста, обсуждение см.
  9. Образцы нагрузки на гель в холодной комнате и работать на ночь в 1x щелочной буфер (12-16 ч) при 3,2 вольт на сантиметр. После того, как образцы были введены в гель, поместить стеклянную пластину на верхней части геля, чтобы предотвратить его плавающим.
  10. Нейтрализовать образцы путем замачивания гель в буфере нейтрализации [1 М Трис-Cl (рН 7,6), 1,5 М NaCl, 3 М ацетата натрия (рН 5,2)] в течение 45 мин при комнатной температуре.
  11. Пятно гель для ДНК с 4 мкл 1% бромистым этидием (EtBr) в 50 мл воды в течение 1 ч при комнатной температуре. Destain с водой в течение 15 мин. Визуализируйте ДНК с использованием системы визуализации.
    Внимание: EtBr является мощным мутагенным и может всасываться через кожу. Избегайте прямого контакта с EtBr.

2. Трансфекция и Иммунопреципитаци ФБПС-направленных ICL-содержащих плазмид в клетках человека

  1. Пластинчатые 400000 клетки млекопитающих (например, U2OS Osteosarcoma клеток) на 60 мм чашку в Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) без антибиотиков 24 ч до трансфекции. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
  2. Перед трансфекцией теплой ростовой средой и забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) до 37 ° С в водяной бане. Подогреть трансфекцию реагента до комнатной температуры.
  3. Выдержите 30 мкл реагента для трансфекции с 500 мкл 1x среды для выращивания (смесь 1) и 2 мкг ФБПС-направленных ICL-содержащих плазмид в 500 мкл 1х среды для выращивания (смесь 2) в отдельных 14 мл с круглым дном пробирки в течение 10 мин при комнатная температура.
  4. Добавить смесь 1 смешать 2, хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Выдержите в течение 25-30 мин при комнатной температуре.
  5. Вымойте клетки дважды с теплым PBS. Добавьте в смесь для трансфекции по каплям моды распределяя равномерно по всей пластине клеток. Добавьте 1 мл питательной среды к плите и довести до конечного объема 2 мл. Смешайте мыLL. Место культуры пластины в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 4 ч.
  6. Заменить носитель со средствами массовой информации 3 мл роста, дополненной 10% FBS, и инкубируют еще в течение 16 часов. Не используйте антибиотики.
  7. Treat клеток с 80 мкл 37% -ного формальдегида на свежей пластины до конечной концентрации приблизительно 1%, и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре в отсутствие света.
    Внимание: Формальдегид является токсичным и должны быть обработаны в соответствии с его инструкциями по технике безопасности. Формальдегид воздействие может нанести вред коже, глаз и дыхательных путей.
  8. Угашайте сшивание формальдегида путем добавления 300 мкл охлажденного глицина (поставляется в продаже наборов) на одну пластину и инкубацию в течение 5 мин. Извлеките носитель и дважды промывали охлажденным PBS, а затем собирают клетки путем соскоба в 1 мл охлажденной (4 ° С) PBS, в микроцентрифужных трубки. Хранить образцы на льду во все времена.
  9. Готовят клеточные осадки центрифугированием при 4 ° С в течение 5 мин медленнот 13400 XG с помощью настольным охлаждаемой центрифуге. Пипеткой из супернатант и поместить осадок клеток на льду.
  10. Гомогенно ресуспендируют осадок в 1 мл охлажденной (4 ° С) буфера А (поставляется в продаже наборов) и инкубировать на льду в течение 10 мин. Смешать изредка переворачивая пробирку. Гранул клетки, как и раньше (см шаг 2.9 выше).
  11. Гомогенно ресуспендируют осадок в 1 мл охлажденной (4 ° C) буфера В (поставляется в продаже наборов) и инкубировать на льду в течение 10 мин с периодическим перемешиванием инвертированием. Гранул клетки центрифугированием, как и ранее (см шаг 2.9 выше).
  12. Ресуспендируют клеток снова в 200 мкл охлажденном буфере В. Добавляют 2 мкл микрококковую нуклеазы (MNase) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Смешать реакции иногда слегка ударяя по пробирке. Остановить реакцию MNase, помещая пробирку на льду и добавл 40 мМ ЭДТА. Гранул клетки, как и раньше (см шаг 2.9 выше).
  13. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 1x хроматина immunoprecipitation буфер (ЧИП) буфер (поставляется в коммерчески доступных наборов) с добавлением ингибиторов протеаз.
  14. Поместите ресуспензированной клетки в тонкостенной пробирке. Разрушать ультразвуком образцов, пуская их на водяной бане в течение ультразвуковом 20 сек, а затем 20 сек инкубации на льду. Повторите шаги Озвучивание 9 раз для генерации ~ 800-1200 фрагментов BP.
    1. К 20 мкл образцов, обработанных ультразвуком добавляют 3 мкл 5 М NaCl и 1 мкл РНКазы А. Хорошо перемешать встряхиванием и инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин. Затем добавляют по 2 мкл протеиназы К и инкубировать в течение 2 ч при 65 ° С. Очищают образцов с использованием набора для очистки ПЦР. Выполнить образцы на 1% -ном агарозном геле и визуализировать с EtBr.
      Примечание: Максимальная интенсивность полученной ДНК должна быть на уровне или ниже 1000 б.п..
  15. В трех отдельных трубок, добавить 30 мкл лизата в предварительно охлажденный силиконизированный трубки, а затем добавляют 70 мкл охлажденного буфера 1x фишке с добавленными ингибиторами протеазы. Добавить 1 мкмг анти-иммуноглобулина G (IgG), анти-гистона H3 (в качестве положительного контроля) или анти-HMGB1 антител к соответствующим трубам. Выдержите в течение ночи в холодном помещении с непрерывным вращением.
  16. Ресуспендируют белок G бусин однородно в холодном помещении. Добавьте 4 мкл белка G бусин на пробирку и инкубировать в течение еще 2-4 ч в холодном помещении с вращением.
  17. С помощью магнитной стойки, Шарик бусинки и удалить супернатант. Добавить 200 мкл буфера 1x ChIP смешанный с ингибитором протеаз к осадку и моют в течение 5 мин в холодном помещении с вращением. Повторите мыть два раза.
  18. Выполните одно дополнительное мытье с высоким содержанием соли 1x ChIP буфера (содержащего 70 мМ NaCl).
  19. Ресуспендируют гранул с 160 мкл буфера для элюции (поставляется в коммерчески доступных наборов) и инкубируют при 37 ° С при вращении в течение 30 мин.
  20. Гранул шарики и собирают супернатант в новую пробирку. Добавить 6 мкл 5 М NaCl и 2 мкл протеиназы К и инкубировать в течение ночи при температуре 65° С.
  21. Очищают ДНК с использованием набора для очистки ПЦР - продукта и элюции ДНК с использованием 50 мкл дН 2 O.
  22. Выполните ПЦР с 16 реакций с использованием наборов праймеров для участка (участков) , представляющих интерес, и решить продукты на агарозном геле 1% , окрашенном EtBr.

3. суперспирализацию Анализ и 2-мерных Электрофорез в агарозном геле

  1. Готовят синтез ДНК ремонт буфера (45 мМ Hepes-КОН, рН 7,8; 70 мМ KCl, 7,4 мМ MgCl 2, 0,9 мМ ДТТ, 0,4 мМ ЭДТА, 2 мМ АТФ, 20 мкМ дНТФ, 3,4% глицерина и 18 мкг бычьего сывороточного альбумина) , Хранить при температуре -80 ° С. Оттепель на льду и перед использованием добавляют 40 мМ фосфокреатина и 2,5 мкг креатинфосфокиназы.
  2. Подготовка 10x суперспирализацию буфер [500 мМ Трис (рН 8,0), 500 мМ NaCl, 25 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА], и хранят при комнатной температуре.
  3. Линеаризуем 300 нг сверхскрученной pSupFG1 ДНК плазмиды полностью используя 1 мкл коровьей топоизомеразы I (5-15 ед / мкл) с 1xсуперспирализация буфер в 10 мкл реакционной смеси. Выдержите смесь при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
  4. Растаяйте HeLa клеток экстракта 24 на льду. Для того, чтобы полностью релаксированному плазмид, добавьте 25 мкл HeLa клеток экстракта и репарации ДНК буфера синтеза. Хорошо перемешать. Добавление дополнительных 1 мкл коровьей топоизомеразы I к соединению, и инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С.
  5. Прекратить реакции путем добавления додецилсульфата натрия (SDS) (конечная концентрация 1%) и протеиназы К (0,25 мг / мл конечной концентрации). Инкубируют при 65 ° С в течение 2 часов.
  6. Литой гель 1% -ном агарозном с 1x Трис Борат ЭДТА (КЭ) буфера. Добавить краситель загрузки ДНК и загружать реакции непосредственно на гель по меньшей мере, 4 полосы друг от друга. Выполнить гель в течение 8-10 ч при 2 В / см в 1X TBE (размер 1) при комнатной температуре, чтобы решить топоизомерам.
    Примечание: Подготовка исходного раствора 5x КЭ в 1 л дН 2 O добавлением 54 г Трис основания. 27,5 г борной кислоты и 20 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).
  7. Приготовьте 2 л 1xКЭ с 3 мкг / мл хлорохина-фосфата. Замочите геля в 200 мл этого раствора в течение 20 мин. Накройте лоток геля с алюминиевой фольгой.
  8. Для electrophorese геля во втором измерении, поверните геля на 90 ° по часовой стрелке и запустить его в течение 4-6 ч при 2 В / см в хлорохин, содержащей 1x КЭ разрешить положительные и отрицательные супервитки.
  9. Пятно гель с EtBr в течение 1 часа на коромысле. Destain гель с дН 2 O в течение 15 мин , а затем визуализировать тепловое распределение топоизомеров с использованием тепловизора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Формирование ТФО-направленного ICL является критическим для плазмиды на основе анализов, которые используются для опрашивать роли архитектурных белков в обработке ICL в клетках человека. Денатурирующий электрофореза в агарозном геле является поверхностным способом определения эффективности ФБПС-направленного формирования ICL. Плазмиды , несущие ФБПС-направленные ICLS мигрируют с меньшей подвижности через матрицу агарозном геле (рис 1А, дорожка 3) по сравнению с не-сшитых контрольных плазмид (рис 1А, дорожка 2). Денситометрический Количественное полос на дорожках 2 и 3 (Фигура 1А) показывает приблизительно 70% плазмидной популяции мигрирует через гель с замедленной подвижностью (идентифицированного черной стрелкой), что указывает на ТФО направленное образование ICL на этих плазмид.

Анализы иммунопреципитации хроматина, проведенные на экстрактах из клеток человеческой U2OS трansfected либо с контрольной плазмидой (Р) или плазмидами , содержащими ТФО направленный ICLS (Р-ICL) показывают обогащение HMGB1 на P-ICL области по сравнению с контрольной (р) области, когда иммунопреципитации с использованием анти-HMGB1 антителом (рис 2 , верхняя панель, дорожки 2 и 3). Эти результаты указывают на то, что HMGB1 ассоциируется с ICL, в клетках человека. Когда HMGB1 истощалась из клеток путем обработки миРНК, Р-ICL-Специфическое обогащение уменьшалась (рис 2, верхняя панель, дорожки 4 и 5), как и ожидалось. Когда те же самые образцы подвергали иммунопреципитации с использованием антитела анти-IgG в качестве контроля специфичности антител, не обнаружено ПЦР - амплификации, как и ожидалось (рисунок 2, верхняя панель, дорожки 6-10). Дорожки 10-14 (верхняя панель) на рисунке 2 были входные выборки , используемые для нормализации. На верхней панели показаны ПЦР-амплификации с помощью праймеров вблизи ТФО-направленного сайт ICL и нижней панели показана ПЦР-амплификации, когда праймеры дистальнее TFO-направленныйбыли использованы ICL сайт.

HMGB1 представляет собой архитектурный белок, который связывается с искаженной ДНК с более высоким сродством, чем он связывает неповрежденную ДНК. ДНК суперспирализацию анализы решены путем двухмерного электрофореза в агарозном геле демонстрируют архитектурный модификацию ФБПС-направленных ICL-содержащих плазмид (P-ICL) по сравнению с контрольными плазмид (Р) HMGB1 в экстрактах HeLa клеток (рисунок 3). Архитектурная модификация, индуцированный HMGB1 предпочтительно на С-ICL-содержащих субстратов определяется как увеличение отрицательного сверхспирализаиии. Суперспиральная плазмид мигрируют быстрее через агарозных гелей относительно расслабленном или линейных плазмид. Распределение топоизомерам указывает на более суперспирализацию Р-ICL , по сравнению с P в присутствии HMBG1 (рисунок 3). Отрицательно суперспирализована ДНК работает как левой рукой дугу во втором измерении в присутствии хлорохина. Сверхспирализация, индуцированный HMGB1 на P-ICLкажется, состоит в основном из топоизомеров, которые образуют левую дугу (~ 14 топоизомеры были определены на ФБПС-направленного ICL, содержащие плазмиды по сравнению с ~ 7 топоизомеров из контрольной плазмиды), что указывает на формирование негативных супервитков. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что плазмиды с ТФО направленными ICL, может быть использован в качестве инструмента для изучения высоким сродством объединение архитектурного белка HMGB1 с поражением ДНК в клетках человека путем иммунопреципитации хроматина анализов. Кроме того, специфические архитектурные модификации P-ICL субстратов HMGB1 также могут быть исследованы с помощью суперспирализацию анализов и двумерных агарозном геле.

Рисунок 1
Рисунок 1: Щелочная анализ электрофореза в агарозном геле для количественной оценки ФБПС-направленного ICL эффективности образования на плазмиды pSupFG1 (A) Lane 1, 1 кб ДНК лестницы;. дорожка 2, плasmid pSupFG1 (P), использовали в качестве контроля; и дорожка 3, ТФО направленный ICL-содержащий pSupFG1 (P-ICL). Плазмиды, несущие ICLS мигрируют медленнее в геле, как показано на дорожке 3 (обозначенный черной стрелкой на правой стороне геля). (Б) Денситометрический Количественное полос в полосе 2 и полосе 3 , показывают , что примерно 70% из плазмид сшивают. Эта цифра была изменена из ссылки 16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: ЧИП Обогащение анализ Показательная HMGB1 на ТФО-направленного ICL-содержащей области сшитой плазмиды (А). ПЦР-амплификации фрагментов иммунопреципитированных были гesolved на агарозном геле 1% с использованием набора проксимальных праймеров вблизи ТФО-направленного сайт ICL (B; P1 и P2, верхняя панель) и второй набор праймеров , используемых в качестве контроля специфичности , которые были дополнительно (примерно 2000 п.о.) , из сайт-направленный МКО (В, Р3 и Р4, нижняя панель). Дорожки 2 и 3 указывают на обогащение HMGB1 вблизи ФБПС-направленного ICL (дорожка 3) по сравнению с неповрежденной ДНК (дорожка 2). Дорожки 4 и 5 представляют собой антитела контроля специфичности с использованием антитела IgG. Дорожки 6 и 7 являются входные выборки. Дорожка 8 представляет собой отрицательный контроль для ПЦР-реакции и не содержит ДНК-матрицы. P плазмиду pSupFG1. P-ICL, ТФО-направленного ICL-содержащего плазмиду pSupFG1. Эта цифра была изменена из ссылки 16. (B) Принципиальная схема плазмиды pSupFG1 показаны участки праймера для P1 и P2, а также P3 и P4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное версион этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: 2D электрофорез в агарозном геле , показывающий образование отрицательных супервитков в ТФО-направленных ICL-содержащих плазмид, чему способствует HMGB1 агарозный гель 1x КЭ показывает тепловое распределение топоизомерам , генерируемых в одиночку (P) , плазмиды или псорален-сшитыми. плазмиду (P-ICL). Подвижность суперспиральных видов быстрее по сравнению с расслабленные плазмид. Каждая группа представляет собой topoisomer, которая отличается от полосы ниже или выше на один меньше или больше сверхвитков очередь, соответственно. Левша дуга представляет отрицательно суперспирализована (-ve) видов и правые дуги представляет собой положительно суперспирализована (+ ве) видов. Псорален ICL-содержащий плазмиду населения (P-ICL) содержит больше видов, чем суперспирализована плазмид контроля (P). R, расслабленные плазмид; S, суперспиральной плазмид; 1D,первое измерение гель-электрофореза; 2D, второе измерение гель-электрофореза. Эта цифра была изменена с 16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эффективное формирование ТФО-направленных ICL , зависит от двух важных факторов: во- первых, собственно буферные компоненты (например, MgCl 2) и время инкубации TFO с его субстратом ДНК - мишени (зависит от аффинности связывания TFO к цели дуплекс, а используемые концентрации); и во-вторых, правильная доза UVA (365 нм) облучение эффективно формировать псорален сшивок. Оптимальное формирование триплекс может быть достигнуто с помощью ВЭЖХ или гель-очистке TFOs. Примеси загрязняя TFO может привести к нежелательным сшитых продуктов, которые могут еще больше осложнить экспериментальный результат. Для повышения стабильности TFOs ковалентно присоединен к 5'-псорален ГМТ, то TFOs следует хранить в виде аликвот при -80 & deg; С, так как многократный сублимационной оттепели TFOs может привести к деградации олигонуклеотидов. После образования триплекса для целевой псорален на определенный сайт (например, 5'-ТА-3 'и 5'-АТ-3' являются заранеепривилегированную псорален сшивающих сайтов), псорален ICL образование требуется облучение с UVA. Доза 1,8 Дж / см 2 UVA достаточна для оптимального формирования ICL , на плазмидах в пробирке. Время экспозиции должно быть определено с помощью фотометра. В зависимости от источника лампы UVA, в дополнение к излучающей УФ при длине волны 365 нм, лампа может также излучать более короткие длины волн, которые могут привести к образованию непреднамеренного повреждения ДНК по всей цепи ДНК. Поскольку ФБПС-направленные ICL-содержащие плазмиды будут использованы для исследований, связанных с ремонтом ДНК с ICL на конкретном участке, такие непреднамеренные фотопродуктов могут посрамить исход репарации ДНК исследований. Поэтому майларовую фильтр должен быть использован для предотвращения воздействия образцов в сторону более коротких длин волн. Успешное формирование ICL также зависит от стабильности структуры триплекса в процессе облучения УФА. Время УФ-облучения требуется зависит от мощности источника UVA. В нашем случае, через 20-30 мин требуется для генерации юе желаемую дозу УФА. В это время тепло, выделяемое лампой может привести к испарительным потери воды из образцов. Такая потеря воды может привести к изменению концентрации буфера и может привести к дестабилизации триплекс структур. Размещение реакции на льду во время облучения УФА поможет предотвратить испарение образцов.

Для определения эффективности псоралена сшивок формации на плазмиде подложках, образцы разрешены в 1% агарозном геле , щелочными (рисунок 1). Большинство протоколов для электрофореза щелочной гель предлагают 2x щелочной гель загрузки красителе, хотя некоторые протоколы предполагают, что щелочной красителем не является необходимым, так как условие денатурированного буфера геля достаточно для денатурации образцов. В то время как 2x краситель хорошо работает с образцами концентрированных ДНК, этот протокол требует загрузки большого объема образца. Поэтому использовать 6х щелочной гель загрузки красителя. Для обеспечения правильной денатурации псорален сшитой плasmid субстраты, инкубировать образцов в буфере загрузки в течение 10 мин при комнатной температуре. Кроме того, Mg 2+ могут образовывать Mg (OH) 2 в щелочных условиях, который улавливает ДНК и может привести к его осадить. Триплекс-образующих реакционный буфер содержит Mg 2+, и поэтому важно , чтобы инкубировать образцов с ЭДТА , чтобы гарантировать , что Mg 2+ хелатные перед добавлением щелочной красителем в образцах. После электрофореза, важно, чтобы нейтрализовать гель, а EtBr не интеркаляции с ДНК в щелочных условиях.

Альтернативный подход к оценке эффективности ТФО-направленного сшивок формирования является использование денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле, но этот метод является более трудоемким, и требует рестриктазами плазмид с последующим радиоактивным изотопом мечения фрагментов. Этот ток подход демонстрирует относительно простой, но эффективный метод дetermine эффективность ТФО-направленного формирования ICL на плазмидных подложках. Тем не менее, этот метод может быть применен для оценки формирования ICL, другими сшивающий агенты, образующие, а также.

Успешный результат анализа плазмидной ChIP зависит от целого ряда факторов. Критические шаги в рамках предложений протокола и устранения неполадок обсуждаются здесь. Критические шаги, участвующие в этом анализе, включают сшивающие формальдегид, микрококковую нуклеазой, обработка ультразвуком, образцы промывок и списанием сшивок ДНК-белок формальдегида в пробах. Для эффективного сшиванию белок-ДНК, важно использовать свежий формальдегид. Сток бутылки 37% формальдегида не следует использовать в течение более шести месяцев после открытия, так как под действием света и кислорода деградирует формальдегида. Таким образом, это также полезно для выполнения сшивание формальдегида без света в капот культуре клеток. Другим важным шагом является микрококковая нуклеазы (MNase) digestioп образцов. MNase пищеварение не только расщепляет геномной ДНК на более мелкие фрагменты, но и удаляет любые активные плазмиды, которые не были доставлены в клетки во время метода трансфекции, который может значительно уменьшить фон. Время инкубации MNase пищеварения должны быть определены эмпирически. Более длинные пищеварение может привести к потере образцов, в то время как более короткие периоды инкубации может привести к неэффективному удалению нежелательных ДНК. Отличные результаты можно увидеть после 10 мин инкубации при комнатной температуре с периодическим перемешиванием реакций путем переворачивания пробирки. Для эффективной иммунопреципитации ДНК должна быть раздроблена до размеров между 800-1200 пар оснований. Такая фрагментация ДНК может быть достигнута путем тщательной обработки ультразвуком образцов. Эффективная обработка ультразвуком образцов может быть достигнуто путем ресуспендирования гранул в тонкостенных труб ПЦР и последующего размещения их на водяной бане ультразвуковом. Звуковые импульсы являются более эффективными по сравнению с непрерывным ультразвуком. В Additиона, важно, чтобы поместить образцы на льду между импульсами, чтобы предотвратить деградацию белков, а также важно, чтобы дополнить буфер 1x фишке с ингибиторами протеазы, а стабильные белки необходимы для распознавания антител и последующих стадий осаждения. Тем не менее, в процессе иммунопреципитации, вследствие гидрофобной природы магнитных шариков, неспецифический ДНК разломятся. Для уменьшения сигналов от таких неспецифических шаблонов, строгое мытье является абсолютно необходимым. И, наконец, собственно реверсирование белок-ДНК сшивок образцов необходима для ПЦР-амплификации иммунопреципитации шаблонов. Для достижения оптимальных результатов, образцы должны быть инкубировали в течение по крайней мере 12 ч с SDS и протеиназы К. Есть преимущества использования плазмиды на основе анализа ChIP над геномных ChIP анализов. Например, целевое повреждение ДНК может быть легко достигнуто с использованием субстрата ДНК плазмиды и TFO, по сравнению с ТФО-целевого формирования поражения в геномного локуса.крепление подложки также можно регулировать, чтобы модулировать интенсивность сигналов при использовании ТФО целенаправленную поврежденную плазмиды. Кроме того, такие подложки могут быть использованы в любой клеточной линии выбора и тестируют на ассоциации с различными белками-кандидатов, таким образом, расширить сферу исследований по обработке и ремонту МКСТ.

Анализ суперспирализация основан на различии в форме между линейными и суперспирального плазмидной ДНК. Суперспиральная ДНК-плазмиды являются более компактными и мигрируют быстрее через матрицу геля по сравнению с расслабленными плазмид. Критические шаги в рамках предложений протокола и устранения неполадок обсуждаются здесь. Поскольку архитектурные белки облегчают топологические модификации на поврежденных субстратов ДНК, измеренных с помощью индукции сверхспирализаиии расслабленного плазмид, очень важно, чтобы полностью расслабиться плазмид с топоизомеразы I. Необходимо изучить степень релаксации ДНК, вызванное топоизомеразы I через агарозном геле электрофорез.MgCl 2 в буфере суперспирализации может осаждаться в течение долгого времени, а также наличие MgCl 2 влияет на тепловое распределение положительных и отрицательных супервитков путем содействия формированию положительных супервитков. Таким образом, полезно добавить MgCl 2 отдельно в смесь или приготовить свежего буфера каждый раз. Чтобы отделить топоизомерам населенностей плазмиды, важно выполнить гель-электрофорез на очень низком напряжении (~ 2 В / см) так, что миграция ДНК преимущественно основаны на структуре / формы молекул. Если релаксация плазмид под действием топоизомеразы I не является полным, то время инкубации и / или количество фермента, используемого должно быть увеличено. Полное расслабление должно быть обеспечено, прежде чем перейти к следующей стадии ДНК суперспирализации, потому что использование анализа суперспирализации с неполностью расслабленных плазмид может привести к неправильной интерпретации данных и результаты могут быть трудно воспроизвести. После того, как комплете релаксации было достигнуто, анализ сверхспирализация относительно легко выполнить. Одним из важных компонентов этого анализа является использование буфера для синтеза репарации ДНК. Креатинфосфата и креатинфосфокиназы должны быть добавлены к соединению каждый раз, когда для генерации АТФ. После стадии суперспирализации, важно, чтобы удалить белки из ДНК плазмиды путем инкубирования с SDS и протеиназы К. SDS помогает в диссоциацию белки из ДНК и протеиназы К приводит к деградации белка, который оставляет ДНК нетронутыми с различными уровнями суперспирализации , Если белок не удаляется полностью, тепловое распределение топоизомеров не будет четко виден. ДНК не может быть очищен с помощью фенол: хлороформ: изоамиловый спирт осаждают и этанол, так как этот метод (и другие) могут зарубка ДНК, что приводит к потере суперспирализации. Другим важным шагом является добавление хлорохин в буфер. Хлорохин интеркалирующий агент и разматывает ДНК. наинтеркаляции, он расслабляет отрицательно суперспирализована ДНК и вносит положительный суперспирализацию релактированных ДНК, которая способствует разделению топоизомерам, содержащих высокую плотность суперспирализации. Таким образом, положительные и отрицательные сверхвитков можно дифференцировать. Это, как правило, легкий эксперимент и хорошо воспроизводим, когда все точки выше рассматриваются.

Тем не менее, если не суперспирализация не очевидна, то необходимо, чтобы определить активность белка, представляющего интерес. Анализ 2D сверхспирализация был использован для изучения топологических модификаций облегченные архитектурных белков 27. Этот анализ используется здесь в контексте ДНК обработки повреждением ФБПС-направленных ICL, в клетках человека. HMGB1 связывается с ТФО направленными ICL , с высоким сродством и специфичностью, как показано ранее с помощью гель - ин витро электрофоретической подвижности-анализах сдвига 20 и в клетках человека с помощью анализа плазмидной ChIP , описанной в 16. Здесь Uпеть суперспирализацию анализа 2D это было показано , что при связывании с ФБПС направленными МКСТ в HeLa бесклеточных экстрактов, HMGB1 помогает в формировании отрицательного сверхспирализаиии на подложках (рисунок 3), что может быть важным шагом в ремонте поражение , потому что отрицательное суперспирализация известно , чтобы облегчить удаление повреждения ДНК через ЧО пути 25. Есть много архитектурных белков, которые участвуют в обработке повреждений ДНК, которые могут быть исследованы с помощью этого теста. Этот подход ограничивается исследованиями в пробирке, тем не менее, это простой и полезный анализ допросить структурно-функциональные отношения архитектурных белков в контексте репарации повреждений ДНК. Однако протокол ЧИП может быть легко модифицирован для изучения ДНК-белковых взаимодействий в контексте генома, в то время как оценки воздействия на суперспирализации ДНК с помощью таких взаимодействий может оказаться весьма затруднительным. Мы и другие группы имеют действительно рerformed триплекс на основе исследования 1) путем стабильной трансфекции плазмидной ДНК в геном 28-30 2) путем ориентации геномного локуса 31-33 и 3) путем включения псорален-модифицированного TFO (и UVA облучения) в клетки после того, как плазмиды трансфекции 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить членов Васкес лаборатории за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения / Национального института рака [CA097175, CA093279 к КМВ]; и профилактики рака и Научно-исследовательский институт Техаса [RP101501]. Финансирование для открытого доступа бесплатно: Национальные институты здоровья / Национальный институт рака [CA093279 на КМВ].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'HMT Psoralen-AG30 Midland Certified Reagent Co., Midland, TX Custom order HPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit Cell signaling Inc. 9003 Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq Green Promega M7122 PCR master mix
HMGB1 antibody Abcam Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit Promega A9281
Chloroquine-diphosphate salt Sigma C6628-50G For two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRI New England BioLabs R0101S
GenePORTER transfection reagent Genlantis T201015
Vaccinia Topoisomerase I Invitrogen 38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lamp Upland, CA B 100 AP UVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 Epigentek EQC-1100 Water bath sonicator
Mylar filter GE Healthcare Life Sciences 80112939
Agarose Sigma-Aldrich A6111
BIO-RAD Chemidoc BIO-RAD XRS+ system DNA imaging system
Glycine Fisher Scientific BP381-500
37% Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775-25ML Used for crosslinking 
Proteinase K New England Biolabs P8107S
DMEM ThermoFisher 11965092 Cell culture media
PBS ThermoFisher 70013073 Cell culture
Trypsin-EDTA ThermoFisher 25200056 Cell culture
Bromocresol green Sigma-Aldrich 114-359 DNA loading dye
Siliconized tubes Fisher Scientific  02-681-320 Low retention microfuge tube
Tris base Fisher Scientific BP152-1
Boric Acid Fisher Scientific A74-1
EDTA Fisher Scientific BP24731
Photometer InternationalLight Technologies ILT1400-A UVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcoma ATCC ATCC HTB-96 Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLa ATCC ATCC-CCL-2 Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer 5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
  2. Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
  3. Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
  4. Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
  5. Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
  6. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
  7. Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
  8. Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
  9. Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
  10. Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
  11. Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
  12. Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
  13. Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
  14. Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
  15. Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
  16. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
  17. Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
  18. Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
  19. Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
  20. Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
  21. Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
  22. Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
  23. Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
  24. Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
  25. Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
  26. Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
  27. Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
  28. Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
  29. Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
  30. Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
  31. Puri, N., et al. Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
  32. Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
  33. Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).

Tags

Генетика выпуск 117 триплекс-образующих олигонуклеотидов репарации ДНК ДНК interstrand сшивок плазмиду ЧИП анализа 2D сверхспирализация анализа HMGB1
Инструменты для изучения роли архитектурного белка HMGB1 в обработке Helix искажающие, Сайт-специфическая ДНК Interstrand сшивок
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools… More

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks. J. Vis. Exp. (117), e54678, doi:10.3791/54678 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter