Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Мышиной модели группы B Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54708
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics, Division of Host-Microbe Systems & Therapeutics, University of California San Diego School of Medicine, 2Department of Biology and Center for Microbial Sciences, San Diego State University

Summary

Целью этого протокола является подражать человеческой группы B стрептококк (СГБ) вагинальный колонизацию в мышиной модели. Этот метод может быть использован для исследования иммунного ответа и бактериальные факторы, способствующие GBS вагинального настойчивость, а также для тестирования терапевтических стратегий.

Abstract

Streptococcus agalactiae (стрептококки группы В, ГБС), представляет собой грамположительные, бессимптомно колонизатор человеческого желудочно - кишечного тракта и вагинального тракта 10 - 30% взрослого населения. В ослабленным иммунитетом лиц, в том числе новорожденных, беременных женщин и пожилых людей, GBS может переключиться на инвазивный возбудителем сепсис, артрит, пневмония и менингит. Поскольку GBS является ведущим бактериальный возбудитель новорожденных, профилактика тока состоит из позднего скрининга гестации для GBS вагинальной колонизации и последующего перипартальной лечения антибиотиками GBS-инфицированных матерей. Тяжелые GBS вагинальные бремя является фактором риска как заболевания у новорожденных и колонизации. К сожалению, мало известно о хозяине и бактериальных факторов, которые способствуют или разрешают GBS вагинальные колонизации. Этот протокол описывает способ для установления стойких GBS вагинальный колонизацию с использованием одного бета-эстрадиол предварительную обработку и отбор суточных проб для определения бактериальной лоаd. Кроме того, он подробно методы администрирования дополнительных методов лечения или реагентов, представляющих интерес и для сбора промывание влагалища жидкости и тканей половых путей. Эта модель мыши будет способствовать пониманию GBS-хозяина взаимодействия в среде влагалища, что приведет к потенциальным терапевтических мишеней для контроля материнской колонизации во влагалище во время беременности и для профилактики передачи ВИЧ уязвимого новорожденного. Он также будет представлять интерес для улучшения нашего понимания общих взаимодействий бактериально-хозяевах в женском влагалище.

Introduction

Streptococcus agalactiae, стрептококки группы В (GBS), представляет собой инкапсулированный, грамположительные бактерии , которая часто выделяемыми из кишечника и мочеполового тракта здоровых взрослых. В 1970 - е годы, GBS появился в качестве ведущего агента инфекционного неонатальной смертности, с более чем 7000 случаев заболевания у новорожденных в год 1. Раннее начало болезни GBS (ОВБ) происходит в первые часы или дни жизни, возникает как пневмония или дыхательной недостаточности, и часто развивается в сепсисом, в то время как с поздним началом заболевания (LOD) наступает через несколько месяцев и подарки с бактериемией, которые часто переходит к менингиту 2. По состоянию на 2002, Центры по контролю и профилактике заболеваний рекомендует всеобщий скрининг для GBS вагинальной колонизации в конце беременности и в родах антибиотикопрофилактики (IAP) для GBS-положительных матерей 1. Несмотря на снижение заболеваемости раннего начала до приблизительно 1000 случаев в Соединенных Штатах ежегодно из-за IAP,GBS остается ведущей причиной раннего начала неонатального сепсиса, и появление с поздним началом остается неизменным 1. Будь внутриутробно, во время родов или даже в поздним началом случаях, неонатальный воздействие GBS требует выживания, поперечный с помощью ряда сред-хозяев и барьеров, иммунной уклонения, а также, в случае менингита, пересечения высоко регулируемой гематоэнцефалического гематоэнцефалический барьер 2. Вверх по течению этих сильнодействующих взаимодействий внутри новорожденному является начальным колонизация влагалища матери-кишечного тракта. Материнское GBS вагинальных колонизация колеблется от 8-18% в развитых и развивающихся странах, с предполагаемой средней ставке 12,7% 3,4. GBS колонизация вагинального тракта во время беременности может быть постоянным, прерывистым, или временный характер среди отдельных женщин 5. Интересно, что материнский возраст> 36 лет связана с постоянной колонизации 6. Многочисленные биологические и социально-экономические факторы риска для GBS вагинальной колонизациибыли идентифицированы. Биологические факторы включают желудочно - колонизацию GBS и отсутствие лактобактерий в кишечнике. Тем не менее, этническая принадлежность, ожирение, гигиена, и сексуальная активность также были связаны с GBS вагинального перевозки 7.

Хотя пресловутая за причинение неонатальных инфекций, GBS также вызывает множество материнских инфекций как послеродовых и после родов. ГБС каретка увеличивается в женщин с вагинитом 8 и, в некоторых случаях, может быть даже сущности болезни 9. Кроме того, GBS вознесение репродуктивного тракта во время беременности может привести к интраамниальной инфекции или хориоамнионита 10. Кроме того, в до 3,5% беременностей, GBS распространяет в мочевой пузырь , чтобы вызвать инфекцию мочевых путей или бессимптомной бактериурии 11. GBS бактериурии во время беременности связано с повышенным риском интранатального лихорадки, хориоамнионита, преждевременных родов и prematurе разрыв плодных оболочек 12. Взятые вместе, присутствие GBS в вагинального тракта связана с инфекциями нескольких тканей хозяина, а также возможность устранить GBS из этой ниши крайне важно как для здоровья матерей и новорожденных.

До недавнего времени большая часть работы следственным GBS взаимодействия с шеечно -кишечного тракта было ограничено в пробирке клеточных моделей 13-15. Эти эксперименты в пробирке показали бактериальные факторы , которые являются важными для присоединения, в том числе поверхностных белков , таких а и серин пили богатые повторы 17,18, а также двухкомпонентные системы регулирования 15,19 и глобальная реакция транскрипционной вагинального эпителия GBS 19. Вместе с тем, чтобы в полной мере выяснить хост-микробных взаимодействий внутри влагалищного тракта, надежная модель животного необходимо. Ранние работы показали , что ГБС может быть извлечена из вагинального тракта засеянных мышей и крыс 20,21 <SUP> 22 в обоих беременных и небеременных условиях. В 2005 году краткосрочные GBS вагинальные колонизация была смоделирована на мышах , чтобы изучить эффективность фага литического фермента для лечения вагинального GBS в течение 24 ч 23. Несколько лет спустя, долгосрочный GBS вагинальные колонизация мышиная модель была разработана с целью изучения хозяина и бактериальные факторы, определяющие GBS настойчивость. Эта модель выявила многочисленные факторы , способствующие GBS колонизации, в том числе поверхностных придатков 17,18 и GBS двухкомпонентных систем 19,24. Эта модель способствовала выявлению механизмов 19,25 ответа хозяина и был использован для тестирования несколько терапевтических стратегий, в том числе иммуномодулирующих пептидов 26 и пробиотиков 27. Этот протокол дает необходимые указания привить GBS в мыши вагинального тракта и впоследствии отслеживать колонизацию и собирать образцы для дальнейших анализов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все для животных работа была одобрена Управлением Лабораторный уходу за животными в Сан-Диего государственного университета и проводится в соответствии с принятыми стандартами ветеринарные. Самок мышей, возраст 8 - 16 недель, были использованы для разработки этого метода.

1. Подготовка и внутрибрюшинного введения бета-эстрадиола

  1. Отмерьте бета-эстрадиола (0,5 мг / мышь) на вес бумаги во время ношения соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ). ВНИМАНИЕ: β-эстрадиола может всасываться через кожу и слизистые поверхности.
  2. Передача бета-эстрадиола в 15 мл коническую пробирку и вихря, пока все комки не будут удалены, а β-эстрадиол в виде тонкого порошка. Оформи кунжутное масло (100 мкл / мышь) в 10-мл шприца. Шприц-фильтр кунжутного масла в 15 мл коническую пробирку, содержащую бета-эстрадиол, используя фильтр с размером пор 0,45 мкм. Воронка 15-мл коническую трубку до тех пор, β-эстрадиол не является гомогенной суспензии в кунжутном масле.
  3. Составим бета-эсtradiol подвеска в новый 10-мл шприца. С 18 G, 1-в. игла, аликвоту 100 мкл суспензии в 1-мл туберкулина шприцы. Подготовьте один шприц для каждой мыши. Поместите новый, стерильный 26 G, ½ дюйма. иглы на каждом туберкулина шприца.
  4. Администрируйте 0,5 мг бета-эстрадиола суспендируют в 100 мкл кунжутного масла (5 мг / мл) в каждую мышь 24 ч до бактериальной прививки. Вводят каждой мыши в брюшную полость, в нижней части брюшной квадранта, только справа или слева от средней линии, как описано выше 28.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет очистки или отсечение месте инъекции не требуется.

2. Вагинальные Прививка с GBS

  1. За один день до прививки, растут в 5 мл ночной жидкой культуры штамма GBS интереса, таких, как A909 (серотип Ia), в Тодд Хьюитт бульоне (THB) при 37 ° С.
  2. Субкультуры ночной культуры GBS в объеме 1:10 в свежей ТЛ и инкубировать при температуре 37 ° C. растутбактерии в фазе середины логарифмической (OD 600 = 0,4-0,5). Примечание: Это обычно занимает 2 - 3 ч, в зависимости от штамма GBS.
  3. Перенести субкультуры в стерильную 15-мл коническую трубку и гранул бактерий при 3000 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют бактериальных гранул в 200 мкл стерильного фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
  4. Используя ресуспендировали осадок, приносят 3 - 5 мл PBS (1 мл на 10 мышей) точно OD 600 = 0,4 в новом 5-мл культуральной трубки. Это будет концентрация ~ 1 × 10 8 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл. Переход на новую 15-мл коническую трубку и повторно осадить бактерии при 3000 × г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант.
  5. Ресуспендируют осадок в PBS в 1/10 первоначального объема. Например, если 3 мл OD 600 = 0,4 гранулировали, а затем вновь суспендируют его в 300 мкл PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: Это последняя бактериальной суспензии (~ 1 × 10 9 КОЕ / мл) используется для животных прививки.
  6. рeserve 50 мкл этой суспензии для серийного разведения и посева на ТЛ агар для определения точного посевного материала.
  7. Инокулируйте каждую мышь с 10 мкл окончательной бактериальной суспензии таким образом , что 1 × 10 7 КОЕ вводят каждой мыши.
    1. Для того, чтобы прививать, задержите мышь вручную, обеспечивая свободную кожу в загривок между большим хендлера и указательным пальцами , а затем иммобилизации хвост, как описано выше 28.
    2. Оформи 10 мкл ОГТ, полученного на стадии 2.6 в 200 мкл геля загрузки пипетки. Вставьте наконечник от 5 до 10 мм в вагинальную полость и дозировать 10 мкл посевного материала.
      Примечание: Гель Советы по загрузке являются предпочтительными по сравнению со стандартными 200-мкл наконечниками, чтобы свести к минимуму риск травмы органов или травмы, в частности, в более молодых или более мелких мышей.
    3. Сразу после инокуляции, освободить шиворот и поднять задний конец мыши, поднимая мышь за хвост и шalking передние лапы на твердую поверхность в течение ~ 1 мин.
    4. Осмотреть влагалищное отверстие для любого обратного потока инокулята. Если наблюдается обратный поток, свежий наконечник пипетки может быть использован для манипулирования или увеличить влагалищное отверстие, что облегчает поглощение обратного потока в просвет. Кроме того, обратный поток может быть отсасывают с помощью пипетки и повторно привиты.
      Примечание: Если введение актуальных агентов, пробиотические организмы, или белки, представляющие интерес, объем до 20 мкл в физиологическом буфере может быть дано в вагинального тракта.

3. моечные Вагинальные Lumen к Количественно GBS нагрузки

  1. Подготовьте 1,5 мл микро-центрифужную пробирку на мышь путем добавления 100 мкл PBS. Непосредственно перед моечные, предварительно смочить тампон в PBS.
  2. Сдерживайте мышь, как описано в шаге 2.7.1 и вставьте тампон 10 мм в вагинальную полость. Осторожно вращайте тампон в 4 раза по часовой стрелке и в 4 раза против часовой стрелки, слегка надавив на стенки влагалища.
  3. Перенесите тампон в пробирку микроцентрифужных 1,5 мл с 100 мкл PBS. Перед металлизированный вихревые микроцентрифужных трубка для ~ 15 секунд, чтобы освободить бактерии от тампона. Серийно разбавить каждый образец в PBS и пластины 20 мкл разведений 1:10 до 1: 10000 на дифференциальных средних чашек с агаром, приготовленных в соответствии с инструкциями изготовителя. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 24 ч. GBS колонии будут появляться либо ярко-розовый или лиловый в цвете. Другие эндогенные флора будет тормозиться, или будет отображаться в виде синих, белых или серых колоний.

4. Сбор Вагинальный лаваже

  1. Сдерживайте мышь, как описано в шаге 2.7.1. С помощью 200-мкл гель загрузки пипетки, пипетки 20 мкл PBS в вагинальную полость. Аккуратно пипеткой весь объем вверх и вниз 4 раза в просвет, а затем вывести весь объем в том же кончика пипетки. ПРИМЕЧАНИЕ: Если промывную жидкость густой слизистый, стандартный 200 мкл наконечник пипеткимогут быть использованы для сбора окончательной промывной жидкости.
  2. Если экономия промывной жидкости для анализа цитокина или КОЕ количественной оценки, разлить в микроцентрифужных пробирку 0,7 мл. При определении стадии эструса, обойтись по крайней мере, 5 мкл лаваже на предметное стекло и наблюдать клетки под 100х на световой микроскоп. Примечание: Примеры эстрального этапов см Рисунок 1.

5. Ткань Вскрытие и усреднении

  1. Для каждой мыши, подготовить три 2-мл пробирки с завинчивающейся пробкой (по одному для каждой ткани: влагалища, шейки матки и матки). Заполните каждую трубу с достаточным количеством (0,4 - 0,5 г), 1,0 мм оксида циркония для покрытия конической формы нижней части трубки.
  2. Автоклав подготовленные пробирки до сбора ткани в течение 30 мин при температуре 121 ° С, особенно если количественной оценки бактериальной нагрузки. Добавьте 500 мкл стерильной PBS в каждую пробирку. Взвесить каждую пробирку после автоклавирования и записи для дальнейшего использования для расчета восстановленную веса ткани.
    3. 2 удушья и цервикальной дислокации. Спрей вниз вентральной части живота с 70% этанола. Стерильными ножницами, откройте abdominopelvic полость, поднимите заднюю кожу и мышцы живота, а также сместить кишечник, так что подвержена репродуктивный тракт.
  3. Стерилизовать ножницы с 70% этанола, протирать при необходимости, и сократить оба рога матки средней длины между телом матки и яичников. Используя ножницы и пинцет, отдельный висцерального жира, мембраны и мочевого пузыря от репродуктивного тракта, двигаясь каудально.
  4. Стерилизовать ножницы, как описано на стадии 5.4. Поперечно сократить влагалище как можно ближе к вульвы, как это возможно, чтобы отделить репродуктивного тракта от тела. Поднимите и снимите неповрежденную репродуктивного тракта и поместить его в стерильную чашку Петри.
  5. С помощью нового лезвия бритвы, отделить матку от шейки матки в одном поперечном разрезе. Стерилизовать лезвие бритвы с 70%Этанола, а затем отделяют шейку матки из влагалища в одном поперечном разрезе. ПРИМЕЧАНИЕ: Там будет минимальное количество ткани матки все еще прикреплена к шейке матки. Там будет минимальное количество вагинальной ткани все еще прикреплены к шейке матки.
  6. С помощью стерильного пинцета, передача каждого из ткани в их соответствующие 2-мл пробирки, содержащие PBS и гомогенизацию бусинки. Очистите щипцов с 70% этанола между обработки каждой ткани.
  7. Взвесить каждую 2-мл завинчивающейся крышкой трубки и вычесть первоначальный вес трубки для определения веса ткани. Веса ткани, как правило, варьируются между 20 - 100 мг. Плотно запечатать крышки трубы винт и гомогенизируют ткани в течение 1 мин при максимальной скорости в гомогенизаторе ткани.
  8. Для количественной оценки бактериальной нагрузки, серийно разбавленных 25 мкл гомогената ткани и пластин разведениях 1:10 до 1: 10000 на дифференциальных средних чашек с агаром. Инкубируйте пластин, как описано в шаге 3.3. Для хранения образцов для цитокина количественной оценки, замерзают гомогенатах ткани при -20 ° С.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

При разработке этой модели, многочисленные наблюдения были сделаны в отношении факторов, которые влияют на продолжительность GBS вагинальной колонизации. Для того, чтобы определить, каким образом эстрального этап при инокуляции воздействий GBS бактериальной персистенции, мыши были поставлены в день прививки через промывание влагалища жидкости. На рисунке 1 показаны четыре этапа мыши эстрального цикла, как определено путем мокрого монтажа промывания влагалища жидкость, хорошо изученного метод 29. Мыши были разделены на группы, основанные на этой начальной стадии, и ГБС живучесть контролировали в течение долгого времени с помощью вагинального свабирования. Мышей , привитых на стадии проэстронного были колонизирована с GBS больше , чем любой другой стадии эструса, особенно те , в диэструсе в момент инокуляции (рисунок 2). На основании этих результатов, в текущей модели, мышей обрабатывают бета-эстрадиола за один день до GBS прививки, чтобы синхронизировать их в стадию проэстронного. Другие мышиные модели инфекций репродуктивного тракта продемонстрировали повышенную способность патогенного организма упорствовать , когда мыши выдержаны в стадии эструса через лечение экзогенного эстрадиола 30,31. Для того, чтобы определить, является ли это явление также произошло во время вагинального колонизации с GBS, контролировали GBS настойчивость при повторном бета-эстрадиол лечения. Устойчивые течка способствовало GBS A909 (American Type Culture Collection, ATCC # ВАА-1138) сохранение у мышей CD-1, с 90% колонизации 2 недели после инокуляции (Фиг.3А). В типичном эксперименте с одной дозой бета-эстрадиола перед посевом, только 40-50% мышей были колонизированы одну неделю после инокуляции (рисунок 4). Среднее ГБС КОЕ , полученных от этих мышей , подражает процент колонизации (фигура 3В). Хотя эти результаты были получены из независимых экспериментов, эти данные демоновTrate, что поддержание непрерывного течки способствует GBS вагинальный настойчивости в большинстве мышей CD-1.

При проведении экспериментов с использованием колонизацию различных человеческих GBS изолятов, было отмечено, что штаммы варьировалась в их способности сохраняться в CD-1 мышей, начиная от нескольких дней до за месяц. Тестируемых штаммов, НКТЦ 10/84 была самой короткой продолжительности, A909 и COH1 сохранялась в течение одной-двух недель, в то время как штамм CJB111 сохранялся у большинства мышей в течение двух недель (Рисунок 4) и даже за месяц (данные не показаны) , На сегодняшний день не было наблюдаемая корреляция серотипа и способностью сохраняться в мыши вагинального тракта; Однако существуют значительные различия между отдельными штаммами GBS было зарегистрировано 25. Способность GBS колонизировать нескольких инбредных и беспородных мышей линий также исследовали. GBS штамма A909 сохраняется в вагинальном тракте в течение приблизительно одной недели в беспородных CD-1мышей и мышей инбредных FVB (рисунок 5). В качестве альтернативы, большинство инбредной линии BALB / C и C57BL / 6 были колонизирована в течение одной недели (рисунок 5) и оставалась колонизирована в течение месяца или за ее пределами (данные не показаны).

Используя этот протокол, GBS вагинальные колонизации в естественных условиях визуализировали путем инокуляции мышей с плазмиды GFP-экспрессирующих GBS штамма и сбора ткани для флуоресцентной микроскопии. GFP-GBS был обнаружен как придерживаясь мышиным вагинальный эпителий (рис 6A) и в непосредственной близости от других местных флоры влагалища (рис 6б). Нет сигнала GFP, не был обнаружен у мышей, которые очистили GFP-GBS в момент сбора ткани (данные не показаны).

Рисунок 1
Рисунок 1: Определение стадии течки от Безупречный Мышиные Вагинальный лаваже. (А) Проэструс: обильные ядросодержащие плоскоклеточный эпителиальные клетки (черные стрелки). (B) Эструс: обильные ороговевших клеток плоского эпителия (синие стрелки). (С) Metestrus: смесь ядросодержащих и ороговевших клеток плоского эпителия и преимущественно лейкоциты (серые стрелки). (D) диэструса: обильные лейкоциты. Увеличение = 100X, масштаб бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: эстральным Стадия Воздействие Вагинальный Постоянство GBS. Процент CD-1 мышей колонизировали с 1 × 10 7 КОЕ GBS A909 с течением времени. Мыши были сгруппированы (п = 7 - 11 / группа), основанный на эстрозного стадии во время GBS прививки, как определено вагинального лаважа жидкость. Один независимый эксперимент показан. Эта цифра была изменена из ранее опубликованных работ и перепечатано с разрешения 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Продолжение лечения с бета-эстрадиол способствует GBS Вагинальные настойчивостью. Процент колонизировали (А) или выздоровел КОЕ (В) CD-1 мышей (n = 10) , привитых с 1 × 10 7 КОЕ GBS A909 и поддерживается на бета-эстрадиол лечения. Мышам вводили бета-эстрадиола за один день до GBS прививки и в дни 1, 3 и 5 после инокуляции. Один независимый эксперимент показан. Линия (B) представляет собой означает выздоровел КОЕ. 708fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: GBS Штаммы различаются по своей способности упорствовать в вагинального тракта. Беспородная CD-1 мышей (n = 10 / группа) вводили разовую дозу бета-эстрадиола один день до начала GBS инокуляции с 1 × 10 7 КОЕ данных штаммов GBS. Эксперименты с каждого штамма были проведены независимо друг от друга и были повторены по крайней мере, в три раза; один представитель результат показан. Эта цифра была изменена из ранее опубликованных работ и перепечатано с разрешения 25. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

pload / 54708 / 54708fig5.jpg "/>
Рисунок 5: Mouse Штаммы различаются по своей способности к колонизироваться с GBS в вагинального тракта. Мыши из указанных фоновых штаммов вводили одну дозу бета-эстрадиола в один прекрасный день перед посевом с 1 × 10 7 КОЕ GBS A909. Эксперименты с каждого штамма были проведены независимо друг от друга и были повторены по крайней мере в два раза; один представитель результат показан. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Флуоресцентные Визуализация GBS в мыши вагинального тракта. Визуализация GFP- выражения GBS (зеленый) вдоль вагинального эпителия при увеличении = 630X, масштаб бар = 50 мкм (А), а также в непосредственной близости от endogenouы вагинальные микробы при увеличении = 1,000X, масштаб бар = 20 мкм (B). Синевы = DAPI. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1
Таблица 1: Составление GBS Штаммы и мышь линий , используемых для вагинального колонизацию исследований. GBS фоновые штаммы, линии мыши и дозировка бета-эстрадиола указаны. Исследования с использованием модели, описанной в данной работе выделены серым цветом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В целях дальнейшего улучшения положения понимания GBS взаимодействия с хоста и других микробов в контексте хоста, требуется модель животного. Эта работа описывает технические аспекты создания GBS вагинальный колонизации у мышей. Этот протокол достигает> 90% колонизацию мышей без применения анестезирующих средств для инокуляции бактерий или для сбора образцов тампона иммуноопосредованные огнезащиты, чтобы включить колонизацию, вагинальный предварительной промывки, или добавки для загущения прививочный материал. Кроме того, эта модель демонстрирует надежную воспроизводимость, со скромными между экспериментальной изменчивости как длины GBS настойчивости и бактериальной нагрузки. Представительные результаты показали в этом исследовании, составление независимых экспериментов и должны быть ориентиром для будущего эксперимента; Однако прямые сравнения между штаммами GBS и мышей линий должны быть сделаны с осторожностью.

Эта модель имитирует человеческие colonizatiна слизистой оболочке в этом вагинального GBS колонизации мышей, как представляется, ограничивается репродуктивного тракта. Хотя вознесение в шейку матки и матки наблюдается с множественной GBS штаммы 25, у мышей не обнаруживают признаков заболеваемости и смертности, даже после нескольких месяцев колонизации. Кроме того, в зависимости от GBS и штаммы мыши изучали, мыши обнаруживают постоянное или кратковременное вагинальный колонизации, которая полезна для изучения бактериальных факторов и иммунных ответов, соответственно. В этой модели, некоторые мыши обнаруживают прерывистое колонизацию; настоящее время неизвестно, станет ли мышей повторно заселены в более поздние моменты времени или если колонизация падает ниже предела обнаружения, как правило, от 50 до 100 КОЕ в определенные моменты времени. Следует отметить, что передача данных между мышей не наблюдалось, когда колонизировали и не-колонизировали мышей размещены вместе в течение нескольких недель (данные не показаны).

Этот метод использует коммерчески доступный избирательный и дифференциальная средадля GBS количественно мыши бактериальные нагрузки. GBS растет как ярко-розовые или лиловые колонии, которые легко видны после 24 ч инкубации. Это средства массовой информации , как было показано, имеют более высокую чувствительность для обнаружения GBS по сравнению с другими средствами массовой информации, в том числе и кровяной агар и среду Гранада 32, и был использован в сочетании с латексный шарик агглютинации для подтверждения ГБС клинические изоляты 18. В этом исследовании, ярко-розовые или лиловые колонии из не-GBS колонизировали мышей никогда не были восстановлены. Некоторые эндогенной флоры, как правило, виды Enterococcus, будут расти в виде синих колоний, и некоторые колонии будут появляться белый, серый или очень бледно-розовый. Важно отметить, что плиты должны быть подсчитаны после 18 до 24 часов инкубации, так как не-GBS колонии могут включать розовый пигмент, если оставить в инкубаторе или по крышке в течение более длительных периодов времени. Мы наблюдали, как сообщалось ранее 32, что некоторые S. Пирролидонилпептидаза изолятов образует розовые колонии на CHROMagar StrepB, но эти Colonies, как правило, меньше, чем GBS колоний. С. Пирролидонилпептидаза не был выделен из эндогенных вагинальной флоры мышей в этих исследованиях, но это наблюдение следует учитывать в будущей работе.

Большинство результатов были получены из беспородных CD-1 мыши линии, которая демонстрирует устойчивые врожденные иммунные реакции в течение первых нескольких дней после инокуляции, с последующим бактериальным зазором в большинстве мышей 19. Другие также тестировали дополнительные штаммы GBS и наблюдали более длительный упорства раз 33,34. Так как развитие этой модели, другие группы начали разрабатывать аналогичные модели мыши GBS вагинальной колонизации для изучения влияния принимающих иммунных реакций 33,35, профилакториев терапии 36,37 и передачи для плода в утробе матери 34,38. Эти различия могут быть объяснены различными факторами, в том числе генетические детерминанты, которые влияют на иммунные реакции и тон состав родной флоры влагалища. Мы составили список из штаммов GBS и соответствующих линий мышей , которые были изучены на сегодняшний день в GBS исследованиях вагинальные колонизации (таблица 1). Число последних исследований с моделями животных подчеркивает интерес и необходимость этих типов моделей в области исследований патогенеза GBS.

В вагинального тракта, иммунитет слизистых оболочек жестко регулируется стероидными гормонами 44 и даже одной дозы бета-эстрадиолом, как описано в этой модели, возмущает иммунный ответ хозяина. Тем не менее , существуют устойчивые врожденные иммунные реакции в течение первых нескольких дней GBS колонизации 19,25, предполагая , что затронутые иммунные реакции в значительной степени нетронутыми. Модели , которые включают повторные бета-эстрадиол инъекции может продлить GBS вагинальный настойчивость, как показано в этом исследовании (рисунок 3) и другими 33. Тем не менее, иммунные реакции и physi репродуктивного трактагия может быть более смущен, что делает результаты трудно интерпретировать. Важно отметить, что различия, описанные по различным GBS изолятов и штаммов мыши в этом исследовании, могут быть изменены в ходе моделей устойчивого течки и должны быть исследованы в будущей работе. Следует отметить, что ни течки стадии , ни GBS серотип влияние вагинальной колонизации в модели 22 крыс. Кроме того, человек кислой вагинальный рН от 3,6 до 4,5 45 резко отличается от более нейтральной мышиного вагинального рН 6,5 46, которые могут повлиять на экспрессию гена GBS и последующие факторы , способствующие колонизации. И, наконец, родной флора влагалища отличается от человека к человеку и мышиной модели коллегами и будущей работы следует изучить GBS колонизацию гнотобионтных мышей, несущих вагинальной флоры человека.

Таким образом, эти исследования попытались изучить хозяина и бактериальные факторы, которые регулируют GBS вагинальный колонизации. В первую очередь, надежная, инновационная животная модель GBS вагинального седловинеonization разработаны в данной работе , можно использовать для описания сложных хост-микробных взаимодействий в качестве вагинальной среды в естественных условиях. Информация, полученная от этой модели уже значительно повысило знания иммунных компонентов хоста и специфических генов, которые контролируют GBS GBS вагинальный настойчивость. Кроме того, эти результаты вызвали дополнительные вопросы и будут полезны для дальнейшего развития новых терапевтических средств для ограничения материнской GBS вагинальный колонизации и последующего воздействия на новорожденного.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sesame oil  Sigma Aldrich S3547-250ML
β-Estradiol  Sigma Aldrich E8875-1G CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. 
200 μl gel loading pipette tips  USA Scientific 1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs Puritan 25-801 A 50
CHROMagar StrepB DRG International SB282
Todd Hewitt Broth Hardy Diagnostics 7161C
18 G, 1.5 inch needles BD 305199
26 G, 0.5 inch needles BD 305111
10 ml syringes BD 309604
1 ml syringes BD 309659
0.45 μm PVDF syringe filters Whatman 6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning 21-031-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
  2. Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence. Expert Rev. Mol. Med. 10, e27 (2008).
  3. Regan, J. A., Klebanoff, M. A., Nugent, R. P. The epidemiology of group B streptococcal colonization in pregnancy. Vaginal Infections and Prematurity Study Group. Obstet. Gynecol. 77 (4), 604-610 (1991).
  4. Stoll, B. J., Schuchat, A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 17 (6), 499-503 (1998).
  5. Brzychczy-Wloch, M., et al. Dynamics of colonization with group B streptococci in relation to normal flora in women during subsequent trimesters of pregnancy. New Microbiol. 37 (3), 307-319 (2014).
  6. Manning, S. D., Lewis, M. A., Springman, A. C., Lehotzky, E., Whittam, T. S., Davies, H. D. Genotypic diversity and serotype distribution of group B streptococcus isolated from women before and after delivery. Clin. Infect. Dis. 46 (12), 1829-1837 (2008).
  7. Le Doare, K., Heath, P. T. An overview of global GBS epidemiology. Vaccine. 31 (Suppl 4), D7-D12 (2013).
  8. Jensen, N. E., Andersen, B. L. The prevalence of group B streptococci in human urogenital secretions. Scand. J. Infect. Dis. 11 (3), 199-202 (1979).
  9. Honig, E., Mouton, J. W., van der Meijden, W. I. Can group B streptococci cause symptomatic vaginitis? Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7 (4), 206-209 (1999).
  10. Muller, A. E., Oostvogel, P. M., Steegers, E. A., Dorr, P. J. Morbidity related to maternal group B streptococcal infections. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 85 (9), 1027-1037 (2006).
  11. Ulett, K. B., et al. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults. J. Clin. Microbiol. 47 (7), 2055-2060 (2009).
  12. Kessous, R., et al. Bacteruria with group-B streptococcus: is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes? J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 25 (10), 1983-1986 (2012).
  13. Jelìnková, J., Grabovskaya, K. B., Rýc, M., Bulgakova, T. N., Totolian, A. A. Adherence of vaginal and pharyngeal strains of group B streptococci to human vaginal and pharyngeal epithelial cells. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 262 (4), 492-499 (1986).
  14. Zarate, G., Nader-Macias, M. E. Influence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (2), 174-180 (2006).
  15. Johri, A. K., et al. Transcriptional and proteomic profiles of group B Streptococcus type V reveal potential adherence proteins associated with high-level invasion. Infect. Immun. 75 (3), 1473-1483 (2007).
  16. Park, S. E., Jiang, S., Wessels, M. R. CsrRS and environmental pH regulate group B streptococcus adherence to human epithelial cells and extracellular matrix. Infect. Immun. 80 (11), 3975-3984 (2012).
  17. Sheen, T. R., Jimenez, A., Wang, N. Y., Banerjee, A., van Sorge, N. M., Doran, K. S. Serine-rich repeat proteins and pili promote Streptococcus agalactiae colonization of the vaginal tract. J. Bacteriol. 193 (24), 6834-6842 (2011).
  18. Wang, N. Y., et al. Group B streptococcal serine-rich repeat proteins promote interaction with fibrinogen and vaginal colonization. J. Infect. Dis. 210 (6), 982-991 (2014).
  19. Patras, K. A., et al. Group B Streptococcus CovR regulation modulates host immune signalling pathways to promote vaginal colonization. Cell. Microbiol. 15 (7), 1154-1167 (2013).
  20. Furtado, D. Experimental group B streptococcal infections in mice: hematogenous virulence and mucosal colonization. Infect. Immun. 13 (5), 1315-1320 (1976).
  21. Cox, F. Prevention of group B streptococcal colonization with topically applied lipoteichoic acid in a maternal-newborn mouse model. Pediatr. Res. 16 (10), 816-819 (1982).
  22. Ancona, R. J., Ferrieri, P. Experimental vaginal colonization and mother-infant transmission of group B streptococci in rats. Infect. Immun. 26 (2), 599-603 (1979).
  23. Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, S., Fischetti, V. A. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (1), 111-117 (2005).
  24. Faralla, C., et al. Analysis of two-component systems in group B Streptococcus shows that RgfAC and the novel FspSR modulate virulence and bacterial fitness. mBio. 5 (3), e00870-e00814 (2014).
  25. Patras, K. A., Rösler, B., Thoman, M. L., Doran, K. S. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by. Group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 8 (6), 1339-1348 (2015).
  26. Cavaco, C. K., et al. A novel C5a-derived immunobiotic peptide reduces Streptococcus agalactiae colonization through targeted bacterial killing. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (11), 5492-5499 (2013).
  27. Patras, K. A., Wescombe, P. A., Rösler, B., Hale, J. D., Tagg, J. R., Doran, K. S. Streptococcus salivarius K12 limits group B Streptococcus vaginal colonization. Infect. Immun. 83 (9), 3438-3444 (2015).
  28. Shimizu, S. Routes of administration. The Laboratory Mouse. Chapter. 32, Elsevier Press. Amsterdam, Netherlands. 534-535 (2004).
  29. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. 48, A.4I.1-A.4I.8 (2009).
  30. Furr, P. M., Hetherington, C. M., Taylor-Robinson, D. The susceptibility of germ-free, oestradiol-treated, mice to Mycoplasma hominis. J. Med. Microbiol. 30 (3), 233-236 (1989).
  31. Mosci, P., et al. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia. 175 (1-2), 1-11 (2013).
  32. Poisson, D. M., Chandemerle, M., Guinard, J., Evrard, M. L., Naydenova, D., Mesnard, L. Evaluation of CHROMagar StrepB: a new chromogenic agar medium for aerobic detection of Group B Streptococci in perinatal samples. J. Microbiol. Methods. 82 (3), 238-242 (2010).
  33. Carey, A. J., et al. Infection and cellular defense dynamics in a novel 17beta-estradiol murine model of chronic human group B streptococcus genital tract colonization reveal a role for hemolysin in persistence and neutrophil accumulation. J. Immunol. 192 (4), 1718-1731 (2014).
  34. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J. Infect. Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
  35. Gendrin, C., et al. Mast cell degranulation by a hemolytic lipid toxin decreases GBS colonization and infection. Sci Adv. 1 (6), e1400225 (2015).
  36. Santillan, D. A., Rai, K. K., Santillan, M. K., Krishnamachari, Y., Salem, A. K., Hunter, S. K. Efficacy of polymeric encapsulated C5a peptidase-based group B streptococcus vaccines in a murine model. Am. J. Obstet. Gynecol. 205 (3), e1-e8 (2011).
  37. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Nader-Macìas, M. E. Immunomodulation of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus Vaginal Colonization in a Murine Experimental Model. Am. J. Reprod. Immunol. 75 (1), 23-35 (2016).
  38. Whidbey, C., et al. A streptococcal lipid toxin induces membrane permeabilization and pyroptosis leading to fetal injury. EMBO Mol. Med. 7 (4), 488-505 (2015).
  39. Santillan, D. A., Andracki, M. E., Hunter, S. K. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (1), e1-e6 (2008).
  40. Cheng, Q., Fischetti, V. A. Mutagenesis of a bacteriophage lytic enzyme PlyGBS significantly increases its antibacterial activity against group B streptococci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 (6), 1284-1291 (2007).
  41. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. In vitro and in vivo effects of beneficial vaginal lactobacilli on pathogens responsible for urogenital tract infections. J. Med. Microbiol. 63 (Pt 5), 685-696 (2014).
  42. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. Preventive effect of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J. Appl. Microbiol. 118 (4), 1034-1047 (2015).
  43. Carey, A. J., et al. Interleukin-17A Contributes to the Control of Streptococcus pyogenes Colonization and Inflammation of the Female Genital Tract. Sci. Rep. 31 (6), 26836 (2016).
  44. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88 (2), 185-194 (2011).
  45. Boskey, E. R., Telsch, K. M., Whaley, K. J., Moench, T. R., Cone, R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. Infect. Immun. 67 (10), 5170-5175 (1999).
  46. Meysick, K. C., Garber, G. E. Interactions between Trichomonas vaginalis and vaginal flora in a mouse model. J. Parasitol. 78 (1), 157-160 (1992).

Tags

Инфекция выпуск 117 Группа B GBS, Вагинальный модель колонизация мышиной модели бактериально-хост взаимодействие
Мышиной модели группы B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Вагинальный Колонизация
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine … More

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization. J. Vis. Exp. (117), e54708, doi:10.3791/54708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter