Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Ved hjelp av RNA-sekvensering for å oppdage Novel Splice Varianter Relatert til Drug Resistance in Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54714
Automatic Translation
1,2,3, 1, 4, 3, 5, 6, 1,7, *1, *3,8,9
1Department of Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 2Department of Hematology, VU University Medical Center, 3Department of Medical Oncology, VU University Medical Center, 4Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 5Division of General and Transplant Surgery, Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, Universita’ di Pisa, 6Amsterdam Immunology and Rheumatology Center, VU University Medical Center, 7Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 8Cancer Pharmacology Lab, AIRC Start-Up Unit, University of Pisa, 9Institute of Nanoscience and Nanotechnology, CNR-Nano
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å undersøke virkningen av avvikende spleising på legemiddelresistens i solide svulster og hematologisk malignitet. Til dette målet, analyserte vi transcriptomic profiler av foreldre og resistente in vitro modeller gjennom RNA-seq og etablert en QRT-PCR basert metode for å validere kandidat gener.

Abstract

Legemiddelresistens er fortsatt et stort problem i behandling av kreft både for hematologiske ondartede sykdommer og faste tumorer. Egenverdi eller ervervet resistens kan være forårsaket av en rekke mekanismer, blant annet økt narkotika eliminasjon, redusert medikamentopptak, narkotika inaktivering og endringer av narkotika mål. Nyere data viser at andre enn kjente genetiske (mutasjon, forsterkning) og epigenetisk (DNA hypermethylation, histon post-translasjonell modifikasjon) modifikasjoner, narkotika resistensmekanismer kan også være regulert av spleise avvik. Dette er et raskt voksende felt av etterforskningen som fortjener fremtiden oppmerksomhet for å planlegge mer effektive terapeutiske tilnærminger. Protokollen er beskrevet i denne artikkelen er rettet mot å undersøke virkningen av avvikende spleising på legemiddelresistens i solide svulster og hematologisk malignitet. Til dette målet, analyserte vi transcriptomic profiler av flere in vitro modeller gjennom RNA-seq og etablereed en QRT-PCR basert metode for å validere kandidat gener. Spesielt vurderte vi differensial skjøting av DDX5 og PKM transkripsjoner. Den avvikende spleising oppdaget av beregningsverktøyet MATS ble validert i leukemiceller, som viser at ulike DDX5 spleisevarianter er uttrykt i foreldre vs resistente celler. I disse cellene, vi også observert en høyere PKM2 / PKM1 ratio, som ikke ble oppdaget i Panc-en gemcitabin-resistente motstykke i forhold til foreldre Panc-1 celler, noe som tyder på en annen mekanisme av resistens indusert av gemcitabin eksponering.

Introduction

Til tross for betydelige fremskritt i cancer behandling, motstand av maligne celler til kjemoterapi, enten iboende eller ervervet etter forlenget medikamenteksponering, er den viktigste årsaken til behandlingssvikt hos et bredt spekter av leukemi og faste tumorer 1.

For å avgrense de mekanismer som ligger til grunn for medikamentresistens in vitro, cellelinje-modeller er utviklet ved trinnvis utvalg av kreftceller som er resistente mot kjemoterapeutiske midler. Denne prosedyren etterligner regimene som brukes i kliniske settinger og derfor gjør grundig undersøkelse av relevante resistensmekanismer. Resistente celler som overlever behandlingen blir deretter skilles fra foreldre sensitive celler ved hjelp av celle levedyktighet / cytotoksisitetsassayer 2. In vitro-medikamentresistensprofiler av primærceller har vist seg å være signifikant relatert til klinisk respons på kjemoterapi 3.

Høy gjennomstrømming cytotoxicity assayer utgjør en praktisk metode for å bestemme medikamentsensitivitet in vitro. Heri blir levedyktigheten av celler bedømt ved for eksempel 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl tetrazoliumbromid - MTT målings 4, som er basert på metabolsk omdannelse av visse substrater (dvs. tetrazoliumsalter) inn fargede produkter, og derved reflekterer den mitokondrielle aktivitet celler. Alternativt kan den cellulære proteininnhold kvantifiseres ved å bruke sulforhodamin B (SRB) analyse 5. Her er antallet av levedyktige celler som er proporsjonalt med den optiske tetthet (OD) målt ved en passende bølgelengde i et spektrofotometer, uten behov for omfattende og tidkrevende celletellingsfremgangsmåter. Veksten inhibering indusert ved en viss kjemoterapeutisk medikament kan beregnes på grunnlag av den ytre diameter av brønnene hvori cellene ble behandlet med en testmidlet og sammenlignes med OD for ubehandlede kontrollceller. En dose-responskurve er obtastilt ved plotting av medikamentkonsentrasjoner sammenlignet med prosentandelen av levende celler i forhold til kontrollceller. Endelig kan medikamentsensitivitet rapporteres som konsentrasjonen som resulterer i 50% av celleveksthemming sammenlignet med ubehandlede celler (IC 50).

Mekanismene bak legemiddelresistens omfatter mange ulike avvik, for eksempel endringer som påvirker genekspresjon av determinanter for narkotika aktivitet og cellenes stoffskifte. Disse molekylære lesjoner, inkludert mutasjoner, avvik på en transkripsjonen og post-transkripsjonsnivået samt forstyrret epigenetisk regulering ofte påvirke gener involvert enten i legemiddelmetabolismen eller apoptose 6.

Alternative pre-mRNA spleising og dens intrikate regulering har nylig fått stor oppmerksomhet som en roman enhet som kan diktere narkotika motstand av kreftceller 7. Opp til 95% av humane gener er alternativt spleiset i normale celler ved hjelp av dennetett regulert prosess som produserer mange forskjellige protein isoformer fra det samme genet. Alternativ spleising er ofte deregulert i kreft og flere svulster er preget av endrede spleising av et økende antall gener som er involvert i legemiddelmetabolisme (dvs. deoksycytidinkinase, folylpolyglutamate syntetase, eller multiresistens proteiner) 6,8. Imidlertid er omfattende analyse av spleise profiler av medikamentresistente celler smertelig mangler. Derfor er det viktig å utvikle høy gjennomstrømning metoder for alternativ spleising analyse. Dette kan bidra til å utvikle mer effektive terapeutiske tilnærminger.

I løpet av det siste tiåret, har den raske utviklingen av neste generasjons sekvense (NGS) teknologier beriket biomedisinsk forskning med ny innsikt i de molekylære mekanismene som styrer reguleringen av genomet uttrykk og deres rolle i ulike biologiske prosesser 9. RNA-sekvensering (RNA-seq) er en kraftig sub-søknadav NGS innen transcriptomics. Den tillater en genom-bred profilering (både kvalitativt og kvantitativt) av uttrykket mønstre av tusener av gener samtidig og er godt egnet for karakterisering av nye kodende mRNA, samt lang ikke-kodende RNA, miRNA, siRNA og andre små RNA klasser (f.eks snRNA og Pirna) 10,11.

RNA-Seq har mange fordeler i forhold til tidligere teknologier for transkriptomet karakterisering (f.eks Sanger-sekvensering og ekspresjon mikromatriser). Det er ikke basert på eksisterende annotasjon av genomer, har det en enkelt-nukleotid nivået for oppløsning og den har et bredere dynamisk område for uttrykk nivå estimering. Kort fortalt, den grunnleggende eksperimentelle arbeidsflyten av RNA-seq eksperimenter består av polyadenylert transkripsjon (mRNA) utvalg og fragmentering, etterfulgt av konvertering til cDNA, bibliotek konstruksjon og til slutt, massivt parallell dypt sekvense 12,13. På grunn av rask dråpe sequencing kostnader over de siste årene, RNA-seq gradvis erstatte andre teknologier og betydelig innsats blir gjort for å forbedre biblioteket forberedelse protokoller. For eksempel er det nå mulig å holde strengen informasjonen av mRNA-transkripter ved å merke den andre tråd cDNA med deoxyuridin trifosfat (dUTP) og, forut for PCR-amplifikasjon, bearbeider den merkede tråden med uracil-DNA-glycosilase (UDG). Denne prosessen forbedrer nøyaktigheten av genet merknader og estimering av uttrykket nivåer 14,15.

Analyse og tolkning av RNA-seq data krever komplekse og kraftige beregningsprogramvarepakker og behandling innen bioinformatikk rørledninger 16,17. Først leser den rå gjennomgå kvalitetskontroll ved å fjerne tekniske og biologiske gjenstander og deponering (trimming) sekvensene som ikke kommer strenge kvalitetskrav. Deretter leser for hver prøve er tilordnet til en referanse genom og indeksertinn i gen-nivå, ekson-nivå, eller transkript-nivå, for å bestemme den mengde av hver kategori. Avhengig av programmet, blir raffinert data så beregnet ved statistiske modeller for identifikasjon av allel-spesifikk uttrykk, alternativ spleising, Genfusjonene og enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) 12. Endelig kan differensialanalyse av det valgte nivå (dvs. genekspresjon eller alternativ spleising) brukes til å sammenligne prøvene oppnådd under forskjellige betingelser.

Differensial skjøting analyse beskriver forskjellene i spleisesete bruken mellom to prøver. Stadig flere programvarepakker viet til dette formålet er tilgjengelige basert på ulike statistiske modeller, forestillinger og brukergrensesnitt 18. Blant disse, MATS (multivariat analyse av transkripsjon skjøting) fremstår som en fritt tilgjengelig og presis beregningsverktøy basert på en bayesiansk statistisk rammeverk og designet for å oppdage differential spleise hendelser fra enten én eller sammenkoblede slutt RNA-seq data. Starter fra de flukt (.bam) filer, kan MATS oppdage alle store typer alternativ spleising hendelser (exon hoppe, alternativ 3 'spleisesete, alternativ 5' spleisesete, gjensidig utelukkende eksoner og intron oppbevaring - se også figur 1).

Først leser programvare identifiserer hvilke støtter en viss skjøt hendelse, for eksempel exon hopper over, og klassifiserer dem inn i to typer. "Inkludering leser" (for den kanoniske skjøten hendelse) kartlegge innenfor det undersøkte ekson og spenner overgangene mellom det spesifikke exon og de to oppstrøms og nedstrøms flanker eksoner. "Hoppe leser" (for det alternative spleise hendelse) spenner krysset mellom de to flanker eksoner. Deretter returnerer MATS normalisert inkludering nivå for begge de kanoniske og alternative arrangementer og sammenligner verdiene mellom prøver eller forhold. Til syvende og sist, beregner det P-verdi ennd falsk funnrate (FDR) forutsatt at forskjellen i varianten forholdet av et gen mellom to tilstander overskrider en gitt brukerdefinert terskel for hver skjøting arrangementet 19,34.

Etter differensial skjøting analyse i forbindelse med RNA-seq, er en omfattende eksperimentell validering garantert for å identifisere sanne positive genet kandidater 18. Kvantitativ revers transkribert-polymerase chain reaction (QRT-PCR) er den mest brukte og optimale metoden i validering av kandidater hentet fra RNA-Seq analyse 20. Hensikten med denne artikkelen er å tilveiebringe en robust metode for å undersøke medikamentresistens relaterte skjøting profiler i faste tumorer og hematologiske maligniteter. Vår tilnærming benytter RNA-seq basert transkriptomet profilering av utvalgte cellelinje modeller av medikamentresistente kreftformer i kombinasjon med en etablert QRT-PCR-metode for validering av kandidatgener er implisert i medikamentresistens.

21,22 og metotreksat (MTX) motstandsdyktig underlinjen CEM / R30dm 23. Selv om dagens behandlingsformer basert på GCer og MTX etablere klinisk nytte i ca 90% av tilfellene, fremveksten av GC-resistens utgjør fortsatt et uløst problem med en uklar molekylære mekanismen. For å isolere GC-resistente kloner sub-, CEM-WT-celler ble dyrket i 1 uM deksametason (Dex) i 2 til 3 uker. MTX-resistente underlinjen CEM / R30dm ble utviklet gjennom gjentatte korttids (24 timer) eksponering av CEM-WT celler til 30 mikrometer MTX som en etterligner av kliniske protokoller. Interessant, denne cellelinjen viste også kryssresistens til Dex (upubliserte resultater) for hvilken mekanisme ikke er fullt ut forstått.

Den faste tumeller modell undersøkt i denne studien er pancreatic ductal adenokarsinom, beryktet for sin ekstraordinære Ingen respons på kjemoterapi. For å oppnå dette, har vi valgt Panc-1-cellelinje og dens gemcitabin-resistente sub-klon Panc-1R erholdt ved kontinuerlig inkubasjon med 1 uM av stoffet 24. Her beskriver vi en tilnærming til å oppdage nye mekanismene bak in vitro legemiddelresistens ved å kombinere tre protokoller: kolorimetriske cytotoksisitetsassayer å vurdere stoffet følsomhet i leukemiske celler og kreftceller fra solide tumorer RNA-seq basert rørledning til å identifisere nye spleisevarianter knyttet til medikamentsensitivitet / motstand og RT-PCR og QRT-PCR-analyse for å bekrefte potensielle kandidater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Karakterisering av resistens profiler gjennom cytotoksisitetsassayer

  1. Leukemicellelinje Culture
    1. Opprettholde den paren T-celle-ALL cellelinje CCRF-CEM (CEM-WT) så vel som dets medikament-resistente underlinjer, inkludert CEM / R30dm, CEM-R5 og CEM-C3, i 25 cm 2 i 10 ml RPMI-1640 medium innehold 2,3 uM folsyre supplert med 10% føtalt kalveserum og 100 enheter / ml penicillin G og 100 ug / ml streptomycin.
    2. Kultur ble cellene i en fuktig atmosfære ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
    3. Tillat cellevekst til konsentrasjoner mellom 2 - 3 x 10 6 celle / ml.
    4. Splitte cellene to ganger i uken med en initialkonsentrasjon på 0,3 x 10 6 celler / ml (for eksempel, hvis cellekonsentrasjonen er 3 x 10 6 celler / ml, overføre 1 ml cellesuspensjon i en ny kolbe som inneholdt 9 ml friskt medium). Kast kultur etter 20 sammenhengende passasjer.
    Bukspyttkjertelen carcinoma cellelinje Culture
    MERK: opprettholde den humane pankreas karsinom cellelinje Panc-1 i 75 cm 2 kulturflasker i 10 ml DMEM-medium med høy glukose og L-glutamin tilsatt 10% føtalt bovint serum og 100 enheter / ml penicillin G og 100 ug / ml streptomycin . Den resistente variant, Panc-1R, er dyrket i det samme kulturmedium som inneholdt 1 pM gemcitabin oppløst i sterilt vann. Ytterligere detaljer er gitt i 24.
    1. Kultur av cellene ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
    2. Splitte cellene hver 2 - 3 dager i et forhold på 1: 5 når cellene når konfluens på omkring 90%.
    3. Å splitte cellene, vaskes to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS), tilsett 1 ml trypsin / EDTA pr 75 cm2 kolbe kultur og inkuberes ved 37 ° C i 3 minutter.
    4. Legg til 9 ml medium og høste frittliggende cellene i en 15 ml tube. Seed 2 ml cellesuspensjon i en ny kolbe containing 8 ml medium. Kast kultur etter 20 sammenhengende passasjer.
  2. MTT-analyse for leukemiceller
    1. Fremstille på forhånd MTT-løsning: Løs opp 500 mg MTT-formazan i 10 ml PBS og rør (beskyttet fra lys) med en magnetisk rører i ca. 1 time. Steriliser oppløsningen med et 0,22 um filter. MERK: Oppløsningen kan oppbevares i 10 ml alikvoter ved -20 ° C. Beskytt mot direkte lys etter tining.
    2. Forbered på forhånd syrnet isopropanol: tilsett 50 ml 2 M HCl til 2,5 liter isopropanol. MERK: Oppbevar løsningen i minst én måned ved romtemperatur før bruk. Hvis isopropanol ikke er syrnet riktig, kan det danne utfellinger med mediet og kompromittere spektrofotometrisk avlesning.
    3. Utarbeide en egen 96-brønns flatbunnet "Day 0" (kontroll) plate for å sikre mer nøyaktig estimering av veksthemming: vie tre til seks brønner per cellelinje, tilsett 30 mL av vekstmedium og 120 ul av cellesuspensjonen (8000 celler) per hver brønn og 150 ul vekstmedium til brønner som tilsvarer emnene (ingen celler). Fortsett fra trinn 1.3.9 til trinn 1.3.13 av dette avsnittet for å måle optisk tetthet (OD). MERK: Ytterligere detaljer er gitt i fire.
    4. Fremstille en 96-brønns flatbunnet eksperimentelle plate: vie 30 brønner til legemiddelkonsentrasjoner (10 konsentrasjoner, hver i triplikat), 10 brønner for å kontrollere celler og 10 brønner for å styre medium uten celler (blanks) og fremstille et medikament-fortynning spekter av deksametason ( dex) under anvendelse av dimetylsulfoksyd som oppløsningsmiddel.
      MERK: For CEM-WT celler Dex fortynning serien er mellom 2 mikrometer og 0,97 nM. For CEM / R30dm, CEM-R5 og CEM-C3 celler Dex fortynning serien er mellom 640 mikrometer og 0,33 nM.
    5. Tilsett 30 ul fra hver Dex fortynning i en passende brønn av 96-brønns plate. Sørg for å inkludere hver konsentrasjon i et tre eksemplarer.
    6. Tilsett 30 ul vekstmedium til vels svarende til styre-celler og 150 ul vekstmedium til brønner som tilsvarer emnene.
    7. Høste eksponentielt voksende celler og resuspender på deres optimal seeding konsentrasjon.
      NB: For å bestemme optimale startcellekonsentrasjoner, er det anbefalt å vurdere vekstprofil av hver cellelinje cellelinje i en 96-brønns plate ved såing av cellene ved flere konsentrasjoner og måle det daglig i minst 4 dager. Velge en seeding konsentrasjon som hindrer overvekst av celler etter 72 timer, da dette vil påvirke eksperiment ved å mette OD-verdier. For CEM-WT, CEM-C5 og CEM-R5 optimal seeding konsentrasjonen er 8000 celler / brønn, mens for CEM / R30dm det er 5000 celler / brønn.
    8. Legg 120 ul cellesuspensjon til hver brønn inneholdende enten medikamentløsningen eller det vekstmediet (brønner svarende til kontrollceller). Fylle de tomme ytre brønnene på platen med 150 ul PBS for å sikre god fuktighet i platen og inkuber the plater i 72 timer ved 37 ° C med 5% CO2 i en cellekulturinkubator.
    9. Tilsett 15 ul av MTT-løsning til hver brønn, og rist platen i 5 minutter med en platerister opp til et maksimum på 900 rister / min.
    10. Plasserer platene tilbake ved 37 ° C med 5% CO2 i en cellekulturinkubator og inkuberes i en annen 4. - 6. time.
    11. Tilsett 150 ul av den surgjorte isopropanol til hver brønn og bland godt med en multikanal pipette å grundig resuspendere alle formazankrystaller. Start med de tomme brønnene og sørg for å skylle tipsene godt før du går videre til en annen rad av platen.
    12. Platen inkuberes ved romtemperatur (RT) i 10 minutter.
    13. Ved hjelp av en mikroplateavleser, bestemme OD ved 540 og 720 nm for å sikre en nøyaktig måling ved å korrigere for bakgrunns OD. Deretter lagre data i et regneark og analysere det fire.
  3. SRB-analyse for Bukspyttkjertelen carcinoma celler
    1. Oppløs SRB reagens i 1% eddiksyre ved sluttkonsentrasjon på 0,4% (w / v).
    2. Oppløs trikloreddiksyre (TCA) i ultrarent vann ved sluttkonsentrasjon på 50% (vekt / volum).
    3. Oppløs Tris (hydroksymetyl) -aminometan i ultrarent vann ved sluttkonsentrasjon på 10 mM.
    4. Utarbeide en egen 96-brønns flatbunnet "Dag 0" styreplate for å sikre en mer nøyaktig vurdering av veksthemming: frø 6 brønner med celler som vokser i eksponensiell fase i 100 mL medium på riktig seeding konsentrasjon og tilsett 100 mL medium bare til brønner som tilsvarer blanks. Inkuber over natten ved 37 ° C med 5% CO2 for å sikre god adhesjon av cellene til platen. Deretter legger 100 mL medium til alle brønnene og gå videre til trinn 1.4.8 - 1.4.16 av dette avsnittet.
    5. Fremstille en 96-brønns flatbunnet plate eksperimentelt: frø cellene vokser i eksponensiell fase i triplikat i 96-brønner flatbunnede plater ved en passende tetthet i 100 ul megdium ved hjelp av en flerkanals pipette.
      NB: For å bestemme optimale startcellekonsentrasjoner, er det anbefalt å vurdere vekstprofil av hver cellelinje cellelinje i en 96-brønns plate ved såing av cellene ved flere konsentrasjoner og måle det daglig i minst 4 dager. Velge en seeding konsentrasjon som hindrer overvekst av celler etter 72 timer, da dette vil påvirke eksperiment ved å mette OD-verdier. For PANC-1 og Panc-1R-celler, er den optimale konsentrasjon seeding 8000 celler / brønn.
    6. Tilsett 100 ul medium og mellom kun brønnene og inkuber over natten ved 37 ° C med 5% CO2 for å sikre god adhesjon av cellene til platen.
    7. Forbered en legemiddelfortynning spekter av gemcitabin mellom 1 mikrometer og 10 nM for Panc-1 og 1 mm og 100 nM for Panc-1R-celler. Tilsett 100 ul fra hver fortynning inn i en passende brønn av 96-brønns plate ved hjelp av en multikanal pipette. Sørg for å ha hver konsentrasjon i tre eksemplarer. I tillegg,Tilsett 100 ul medium til de mellom bare brønner og kontrollcellene. Inkuber ved 37 ° C med 5% CO2 i 72 timer.
    8. Legg 25 ul kald TCA-løsning til brønnene ved anvendelse av en multikanal pipette og inkuberes platene i minst 60 min ved 4 ° C for å utfelle og løse proteinene i bunnen av brønnene.
    9. Tøm plate ved å fjerne kort medium og tørt på en vev.
    10. Vask 5 ganger med vann fra springen, så tømme platen og la tørke i romtemperatur.
    11. Tilsett 50 ul SRB-løsning per brønn ved hjelp av en gjentakelse-pipette og beis i 15 minutter ved romtemperatur.
    12. Tøm plate ved å fjerne SRB flekken.
    13. Vask 4 ganger med 1% eddiksyre, deretter tømme plate og la det tørke i romtemperatur.
    14. Tilsett 150 ul Tris-løsning per brønn ved hjelp av en multikanal pipette og bland i 3 minutter på en platerister opp til et maksimum på 900 rister / min.
    15. Les den optiske tetthet ved 540 nm (eller 492 nm hvis than OD-verdiene er for høye).
    16. Analysere dataene.
  4. Data Analysis for MTT og SRB Analyser
    1. Beregn OD verdiene av celler på "Dag 0" ved hjelp av følgende formel: OD Dag 0 = OD kontrollceller - Gjennomsnittlig OD tomme brønner
    2. Beregn prosentandelen av overlevende celler for hver medikamentkonsentrasjon i henhold til følgende formel:% behandlede celler = Gjennomsnittlig [OD av behandlede celler - gjennomsnittlig OD tomme brønner - OD Dag 0] / [OD kontrollceller - gjennomsnittlig OD tomme brønner - OD Day0] * 100
    3. Plotte dose-responskurve (medikamentkonsentrasjon vs. veksthemning i%).
    4. Beregne konsentrasjonen av medikamentet som hemmer veksten av cellene med 50% (IC50) ved hjelp av dose-responskurve.

2. RNA Isolation and Library Forberedelse for RNA-sekvensering

  1. Eksempel Collection og RNA Isolation
    1. For CEM-celler: høste 10 6 celler direkte fra kulturmediet.
    2. For Panc-1 og Panc-1R: fjerne medium, vaskes cellene to ganger med PBS og løsne ved tilsetning av trypsin-EDTA og inkubering ved 37 ° C i 3 minutter. Legg kulturmedium og høste 10 6 celler.
    3. Spinne ned prøver ved 300 x g i 3 minutter, fjern supernatanten og ekstrahere total mRNA ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige silika-membran-spinnkolonner, ved å følge den produsenten `protokollen.
    4. Bestem konsentrasjonen og renheten av total RNA ved hjelp av et UV-Vis-spektrofotometer.
      MERK: RNA regnes med høy renhet hvis det 260 nm / 280 nm absorbans-forhold er over 1,8. Prøvene kan oppbevares ved - 80 ° C.
    5. Vurdere total RNA integritet ved elektroforese av 200 ng av prøven på 1% agarosegel farget med etidiumbromid.
      MERK: Påvisning av to intakte band som tilsvarer pattedyr 28S og 18S rRNAs ved ca.2 kb og 1 kb i størrelse er en indikasjon på god total RNA integritet.
  2. Sekvensering Bibliotek Forberedelse
    1. Bruk to mikrogram av total mRNA per hver prøve. Følg mRNA biblioteket forberedelse protokollen i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. Bestemme kvalitet og konsentrasjon av hvert bibliotek ved hjelp av et Bioanalyzer system. Pool bibliotekene i en enkelt prøve opp til en endelig konsentrasjon på 10 nmol / L og måle den med Bioanalyzer.
    3. Bruk high-throughput sekvenseringssystem med Single Les 100 bp-modus.
      MERK: Les lengde> 80 bp er nødvendig for å identifisere transkripsjons isoformer.

3. Påvisning av forskjellig spleising fra Sekvensering Leser

  1. Justering av Leser til Referanse Genome og kontroll
    1. Kompilere et gen annotering (.gtf fil) fra NCBI refGene tabellen ved hjelp UCSC tabell nettleser (25,963 gener).
    2. Utføremerknad-aware gapped justering av sekvensering leser til referanse genomet (GRCh37) ved hjelp av STAR.
    3. Sorter og indeksere de resulterende justerings filer med Picard verktøy.
    4. Utfør post-kartlegging kvalitetskontroll ved hjelp RSeQC og samtools.
  2. Differensial skjøting Detection mellom utvalgsgrupper
    1. Installer Python og tilsvarende versjoner av NumPy og SciPy. Last ned og installer samtools. Last ned og installer bowtie og tophat,
    2. Tilsett Python, Bowtie, Tophat og samtools kataloger til $ PATH miljøvariabelen. Last ned pre-bygget Bowtie indekser (hg19). Last ned rMATS versjon 3.0.9.
      MERK: Ytterligere detaljer om rMATS er gitt i 19 og 34.
    3. Oppdage alternativ spleising hendelser ved å sammenligne hver Dex-resistente cellelinje til CEM-WT og Panc-en til Panc-1R i eget MATS løper i henhold til figur 5A.
    4. For å oppdage forskjellig spleising hendelser fra previously justert sekvense leser (.bam filer), kjøre MATS ved hjelp av kommandoer fra figur 5B for CEM-WT vs. CEM- C3, CEM-WT vs. CEM-R5, CEM-WT vs. CEM / R30dm og Panc1 til Panc- 1R sammenligninger.
      MERK: MATS vil skape en output mappe med to .txt filer med resultater per type spleising hendelse analysert (SE - ekson hoppe, A5SS - alternativ 5 'spleisesete, A3SS - alternativ 3' spleisesete, MEX - gjensidig utelukkende eksoner og RI - intron oppbevaring): en fil som inneholder resultater basert på koblings teller bare og andre fil med resultater basert på fordelingstall og leser på målet. Videre er en ekstra .txt-fil med et resultat oversikt generert i samme mappe.
    5. For SE, A5SS, A3SS og RI import til regneark de .txt filer basert på koblings teller og leser på målet. For MEX importerer .txt filer basert på koblings teller bare.
      MERK: MATS utdatafilen er sortert etter stigende P-verdier og inneholder flere parametere: genet ID, genet symbol, Kromosom og strand posisjon, genomiske koordinatene til de alternativt spleisede fragmenter, teller samt lengden på inkludering og hoppe skjemaer for både analyserte prøver, lengden på inkludering og hoppe form som brukes for normalisering, p-verdi, falske funnrate (FDR ), inkludering nivå for hver prøve basert på normtall og differensial inkludering score (gjennomsnitt (IncLevel1) - gjennomsnitt (IncLevel2)).
    6. Velg statistisk signifikante kandidat gener med en FDR <10% for videre validering (f.eks DDX5 og PKM2).
    7. Visualiser alternativ spleising hendelser med Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), som rapportert i figur 5.

4. Validering av resultatene ved RT-PCR og QRT-PCR-analyser

  1. primer design
    MERK: For å gi en pålitelig validering av resultater oppnådd ved bruk av bioinformatiske rørledning, mRNA transcripts som følge av alternative spleisehendelser blir forsterket ved hjelp av RT-PCR og visualisert ved hjelp av agarose-gelelektroforese av PCR-produktene. Cyanin grønt fargestoff slik som SYBR grønn QRT-PCR-analyse er brukt for å kvantifisere spesifikke spleisevarianter i forhold til et husholdningsgenet. Figur 7 viser strategien anvendt for å visualisere exon 12 hopper tilfelle av DDX5 genet og for å kvantifisere den gjensidig utelukkende exon 9 og exon 10 av PKM-genet.
    1. For RT-PCR-analyse, design primerpar som gløding til konstituerende eksoner (ekson 10 og ekson 13) ligger oppstrøms og nedstrøms de alternative spleiseseter (figur 7a).
      MERK: fragment størrelse bør omfatte mellom 100 og 800 bp, for å sikre en klar separering av de forutsagte PCR-produktene på agarosegel. Glødetemperaturen av primerne bør være mellom 55 og 65 ° C, og GC-innholdet må ikke overstige 60%.
    2. Cyanine grønn analysen (figur 7B). Kontroller sekvenshomologi av de to gjensidig utelukkende eksoner og utforming to primerpar som hver spesielt og utelukkende detekterer bare en av de to spleisevarianter.
      MERK: For PKM, hybridiserer revers primer til ekson 11 felles for begge variantene, mens termin primere variant-spesifikke og gløding til ekson 9 (PKM1) eller ekson 10 (PKM2).
    3. For å påvise DDX5 full-lengde gen, bindes den reverse primeren innenfor et utelatt ekson (exon 12).
      MERK: For spesifikk påvisning av DDX5 ΔEx12 variant, spenner revers primer den exon11 / exon13 grensen. Bruk samme forover primer som hybridiserer til konstituerende ekson 10 for begge reaksjoner.
      MERK: amplicon størrelse bør være mellom 80 og 200 bp.
  • Første tråd cDNA syntese
    1. Sett opp revers transkripsjon av 1 ug av den isolerte RNA til cDNA ved bruk av 200 U / ul av Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) reverse transkriptase i sin reaksjonsbuffer fortynnet 1: 5 med sterilt vann. Legg DTT 1 uM, 0,05 ug av tilfeldige heksamerer, deoksynukleotid-mix (dNTP) 1 mM og 40 U / ul av ribonuklease inhibitor.
    2. Vortex kort og inkubere reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 2 timer.
    3. Inkuber i reaksjonsblandingen ved 70 ° C i 5 min for å inaktivere revers transkriptase, overføre blandingen på is og spinne ned ved hjelp av en mikrosentrifuge. Prøvene kan brukes umiddelbart eller oppbevares ved - 20 ° C.
  • RT-PCR-reaksjonen og agarosegel
    1. Sett opp PCR-reaksjon i et PCR-rør for hver prøve ved å blande 12,5 ul av 2 x konsentrert PCR Mastermix, 1,25 ul 10 uM forover primer og det samme beløp for den reverse primer opp til et sluttvolum på 25 pl med sterilt vann.
    2. Tilsett 1 mL av cDNA til mix og plassere rørene i thermocycler. Kjøre programmet som følger: initial denaturering: 95 ° C i 2 min.Gjenta følgende trinn for 35 sykluser: denaturering ved 95 ° C i 25 sekunder; annealing ved 52 ° C i 35 sekunder; forlengelse ved 72 ° C i 1 min. Satt endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter.
    3. Fremstille 1% agarose-gel ved å oppløse 1 g agarose i 100 ml 1 x TBE-buffer. Legg 2,5 mL av etidiumbromid til oppløsningen. FORSIKTIG: etidiumbromid er kreftfremkallende, behandles med forsiktighet ved hjelp av en kjemisk avtrekkshette.
    4. Last prøvene og drives av gelen i 1 x TBE-buffer ved 100 V i ca. 30 minutter i en elektroforese-system.
    5. Avslør gel med et digitalt UV-kamera og lagre bildet.
  • QRT-PCR og dataanalyse
    1. Sett opp cyanin grønn PCR-reaksjonen for hver prøve ved å blande 12,5 ul av 2x grønn PCR Mastermix, 2 ul av 5 uM forover primer og det samme beløp for den reverse primer opp til et sluttvolum på 15 ul med sterilt vann i et PCR-rør . Forbered en blanding for hver enkelt skjøtevariant som skal detekteres (PKM1, PKM2, DDX5 full lengde, DDX5 ΔEx12) og for husholdningsgenet (GUS).
    2. Laste Mastermix på en hvit 96-brønns plate og forberede duplikater pr hver prøve.
    3. Spe cDNA 10x i vann, tilsett 5 mL til hver blanding og plasser platen i termo. Kjøre programmet som følger: initial denaturering: 95 ° C i 5 min. Gjenta følgende trinn for 45 sykluser: denaturering ved 95 ° C i 10 sekunder; annealing ved 58 ° C (for DDX5 og DDX5 ΔEx12 blander) eller 60 ° C (for PKM1 og PKM2 mikser) i 20 sekunder. Satt endelig forlengelse ved 72 ° C i 20 sek. Satt smelter kurve ved å bruke en gradient 65-97 ° C.
    4. For å vurdere spesifisiteten av primer sett til sine mål, sjekk smeltekurver og kontrollere at en enkel topp dannes per hver primer sett.
    5. Beregn den andre deriverte verdier hos forsterker kurvene og eksportere syklus terskelverdiene (CT).
    6. Calculate de relative ekspresjonsnivåer (REL) av mRNA spleisevarianter i forhold til GUS housekeeping (referanse) genet i hver prøve ved å bruke "delta Ct (ΔCt)" metoden. Formelen er: REL = 2 - ΔCt, hvor ΔCt = Ct mål spleisevariant - Ct referanse genet
    7. For å kvantifisere den relative overflod av spleisevarianter, beregne REL forholdet ved å bruke formelen: Ratio REL ratio = REL spleisevariant 1 / REL spleisevariant 2.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    De cytotoksisitetsanalyser er beskrevet i protokollen tilveiebringe en pålitelig og robust fremgangsmåte for å vurdere motstanden av kreftceller overfor kjemoterapeutiske midler in vitro. Ved hjelp av MTT-analysen, ble sensitiviteten til Dex bestemt i fire T-ALL-cellelinjer, blant annet Dex-følsomme paren CEM-WT celler og tre Dex-resistente underlinjer: CEM / R30dm, CEM-R5 og CEM-C3. To forskjellige konsentrasjonsområder måtte brukes på grunn av den store forskjellen i følsomhet mellom CEM-WT (2 mikrometer - 0,97 nM) og Dex resistente cellelinjer (640 mikrometer - 0,33 nM). MTT-analysen viste klart Dex motstand i CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 uM), CEM-R5 (IC50> 640 uM) og CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98 uM) i forhold til CEM- WT celler (IC 50 = 0,028 ± 0,003 mm). Tilsvar SRB-analysen viste høy gemcitabin motstand i Panc-1R cellelinje (IC 50 = 3.16 ± 0.01 uM) sammenlignet med foreldre Panc-1-celler (IC50 = 0,077 ± 0,03 uM) som vist i figur 2.

    Etter bekreftelse av resistens i alle vurdert cellelinjer, vi neste satte å mRNA isolert, bibliotek forberedelse og RNA-sekvensering. Ekstraksjon av total mRNA ved hjelp av silica membranspinnkolonner er det foretrukne valg i forhold til andre metoder ettersom den unngår fenol og proteinurenheter, og gir høy renhet av prøven med 260 nm / 280 nm absorbans-forhold godt over 1,8. Dette er en avgjørende forutsetning for komplekse nedstrøms applikasjoner som dypt sekvensering. Den benyttes for å kontrollere integriteten av RNA prøver ved agarose 1% Fremgangsmåten er spesielt egnet for nylig isolerte celler (figur 3). Siden formålet med denne protokollen er å oppdage alternative spleisevarianter abnormt uttrykt i resistente cellelinjer, velger vi positive selection av polyadenylert mRNA for sekvense biblioteket forberedelse, ved hjelp strandet mRNA kit. Electropherograms av enkelt og sammenslåtte biblioteker er avbildet i figur 4, som viser en gjennomsnittlig fragmentstørrelse på omtrent 300 bp, i samsvar med sekvensering systemkrav. De utarbeidet bibliotekene ble deretter sekvensert ved hjelp av en chip med Single Les 100 bp-modus. Valget av sekvensering leser på 100 bp er nødvendig for å oppdage alternativ spleising gjennom nedstrøms bioinformatiske rørledninger.

    Etter innledende behandlingstrinn og kvalitetskontroll, leser den rene justert til humane genom (hg19) ble underkastet differensiell spleising analyse ved hjelp av MATS. I denne analysen har vi gjort sammenligninger mellom den legemiddelfølsomme foreldrecellelinje og hver av dens medikament-resistente underlinjer separat (dvs. CEM WT vs. CEM / R30dm, CEM WT vs. CEM-C3, etc.). MATS er avhengig av en fleksibel og nøyaktig statistisk modellanvendes for å detektere forskjellig spleising mellom prøver. Ved å bruke standard analysemuligheter og en FDR verdi <10% som en cut-off (avbildet i figur 5B), var vi i stand til å identifisere 38 ± 12 signifikante forskjellig spleisede gener kandidater per sammenligning bestilt av type alternativ spleising hendelse, med flest treff klassifisert som exon hoppe. Figur 6 illustrerer en typisk analyse utgang for sammenlignings Panc-1 vs Panc-1R.

    Vi videre fokusert vår studie på to vanligste typene av alternativ spleising hendelser: ekson Hoppetau og gjensidig utelukkende ekson hendelser med en representant kandidat per kategori beskrevet nedenfor. DDX5 (DEAD-box heli 5) har blitt oppdaget av MATS analyse som statistisk signifikant i forhold CEM-WT vs. CEM-C3 og CEM-R5, men ikke signifikant i forhold CEM-WT vs. CEM / R30dm. Gitt sin antatte rolle i leukemi 25,26, vivelger denne kandidaten for ytterligere validering. Det er sterkt anbefalt å visualisere RNA-seq data i et genom nettleser-lignende verktøy. IGV tilveiebringer en allsidig og brukervennlig grensesnitt for dette formål, som vist i figur 7 for genet kandidat DDX5. PKM (pyruvat kinase muskel isozym) er en statistisk signifikant gjensidig utelukkende exon arrangement i forhold CEM-WT vs. alt Dex-resistente underlinjer, men ikke i forhold Panc-1 vs Panc-1R. Gitt relevansen av dette enzymet i solid svulst metabolisme 27,28 og den nye rollen av cellen metabolisme i glukokortikoid motstand i T-ALL 29, velger vi denne kandidaten for ytterligere godkjenning ved RT-PCR.

    Primer utforming må utføres med ekstrem forsiktighet for å forsterke den riktige fragment, spesielt når primere annealer til ekson-ekson grenser (i tilfelle av revers primer påvise DDX5 ΔEx12 variant) eller når thei gløding til gjensidig utelukkende eksoner med høy sekvens homologi (ekson 9 og ekson 10 av PKM). Figur 8 viser primerutforming strategi, mens figur 9 viser resultatene av et RT-PCR for DDX5 gen kandidat. DDX5 ΔEx12 er oppdaget i prøven CEM-WT og CEM / R30dm men ikke i CEM-C3 og CEM-R5, noe som bekrefter MATS data i en kvalitativ måte. Cyanin grønn QRT-PCR-assay nøyaktig kvantifiserer mRNA-ekspresjonsnivåene av DDX5 og PKM spleisevarianter, som vist i figur 10 og figur 11, henholdsvis.

    Figur 1
    Figur 1: Skjematisk fremstilling av alternativ spleising Events. Skjematisk fremstilling av de mulige mønstre av alternativ spleising av et gen. Bokser er diskrete eksoner som kan være uavhengig inkluderes eller ekskluderes fra mRNA transkripsjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 2
    Figur 2: Resultater fra cytotoksisitetsassayer. (A) MTT-analysen for leukemiske cellelinjer som viser høye nivåer av deksametason motstand i CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98), CEM-R5 (IC 50> 640 uM) og CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 pM ) i forhold til foreldre CEM-WT (IC 50 = 0,028 ± 0,003 mm). (B) SRB-analyser for pankreatisk karsinom-cellelinjer som viser høye nivåer av gemcitabin motstand i Panc-1R (IC 50 = 3,16 ± 0,01 uM) som sammenlignet med foreldre Panc-1 (IC 50 = 77,22 ± 2,76 nM). Grafene rapporterer gjennomsnittlig cellevekst% ± SEM av tre independent eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3: RNA Quality Assessment anvendelse av en agarosegel. To hundre ng av total mRNA ble kjørt på 1% agarosegel farget med etidiumbromid. Tilstedeværelsen av intakte bånd tilsvarende ribosomal RNA (rRNA) arter 18S og 28S og fravær av utstryk ved lavere molekylvekter er tegn på god kvalitet RNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4: <strong> Bioanalyzer Spor av Sekvense biblioteker. (A) Electropherograms av sekvensbiblioteker viser topper ved omtrent 300 bp, som indikerer god kvalitet. Eksempel 1-6 = CEM-WT, CEM-C3, CEM-R5, CEM / R30dm, Panc-1 og Panc-1R. (B) elektroferogrammet av samleprøver (FU, Fluorescens Units).

    Figur 5
    Figur 5: Påvisning av forskjellig spleising med MATS. (A) Gruppe sammenligninger og (B) skript brukes til å kjøre MATS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 6
    Figur 6: MATS Output List. Figuren viser en typisk produksjon av MATS analyse i en programvare med regneark: her blir rapportert forskjellig spleisede kandidater i sammenligning Panc-1 vs Panc-1R for ekson hoppe hendelser (FDR <10%). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 7
    Figur 7: Visualisering av forskjellig spleising av DDX5 Kandidat Gene gjennom IGV Genome Browser. Filer med Justert leser (.bam) tilsvarende leukemiceller har blitt lastet opp på IGV genom nettleser og visualisert ved hjelp Sashimi plott (minimum koblings teller verdi = 10 for å visualisere betydelige spleise hendelser). Spleise tellinger er representert ved forbindelseslinjer oget tall som svarer til den RNA-seq leser spenner eksonene. CEM-WT og CEM / R30dm vise hoppe teller spenner ekson 11 til ekson 13 i forhold til CEM-C3 og CEM-R5 som ikke viser noen exon 12 hopper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 8
    Figur 8: Primer Design for RT-PCR og cyanine Grønn QRT-PCR. (A) RT-PCR: primerpar detektere forskjellig spleising av DDX5 glødning til konstitutive eksoner (exon 10 og ekson 13) befinner seg oppstrøms og nedstrøms fra alternativt spleisede eksonene. (B) QRT-PCR-analyse: for relativ kvantifisering av vitnemål som følge av ekson hoppe hendelser i forhold til de kanoniske transkripsjoner, revers primer hybridiserer enten innenfor hoppet ekson (alternativ variant) ellertil exon11 / exon13 grensen (kanonisk variant) av DDX5 genet. For kvantifisering av gjensidig utelukkende eksoner, hybridiserer den reverse primeren til ekson 11 felles for begge isoformer, mens den fremre primer glødning enten til ekson 9 (PKM1) eller exon 10 (PKM2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 9
    Figur 9: RT-PCR Validering av DDX5 forskjellig spleising. 1% agarosegel viser forskjellig spleising av DDX5 genet i leukemiceller. Fragmentet tilsvarer DDX5 full lengde fragment (650 bp) forsterkes i alle prøvene mens DDX5 ΔEx12 (430 bp) variant forsterkes i CEM-WT og CEM / R30dm prøver og størrelsen tilsvarer Exon 12 hopper. Dette er ikke påvist i CEM-C3 og CEM-R5 celler, som avskrekkeminelagt av MATS analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 10
    Figur 10: mRNA uttrykk nivåer av DDX5 Splice Varianter i CEM-celler. (A) QRT-PCR-analyse. Midlere relative ekspresjonsnivåer og standard feil av gjennomsnittet (REL ± SEM) fra to uavhengige eksperimenter. (B) Forhold mellom REL (± SEM) av spleisevarianter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 11
    Figur 11: mRNA uttrykk nivås av PKM spleisevarianter i CEM og Panc-1 celler. (A) QRT-PCR-analyse. Midlere relative ekspresjonsnivåer og standard feil av gjennomsnittet (REL ± SEM) fra to uavhengige eksperimenter og forholdet mellom REL av spleisevarianter for CEM-celler. (B) QRT-PCR-analyse. Midlere REL ± SEM av to uavhengige eksperimenter og forholdet mellom REL (± SEM) av spleisevarianter for Panc-1 celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Her beskriver vi en ny tilnærming som kombinerer veletablerte cytotoksisitetstester screening teknikker og kraftig NGS-baserte transcriptomic analyser for å identifisere differensialspleise hendelser i forhold til legemiddelresistens. Spektrofotometriske analyser er praktiske og robuste høy gjennomstrømming metoder for å vurdere stoffet følsomhet i in vitro kreft modeller og representerer det første valget for mange laboratorier som utfører cytotoksisitetstester screenings. Feilsøking samt mulige varianter for denne metoden ble grundig beskrevet andre steder 4,5.

    High-throughput genomisk analyser for tiden brukes for å utforske medikamentresistensmekanismer baserer seg hovedsakelig på SNP'er deteksjon og differensielt uttrykk estimering av gener assosiert med en viss resistent fenotype. I denne studien beskriver vi bruk av RNA-sekvenseringsmetoder, sammen med robuste bioinformatikk rørledninger for presis annotering av mRNA transkripter og påvisning av difdifferensial spleising. Et særlig viktig trekk ved den beskrevne protokoll er evnen til å identifisere nye spleisevarianter mellom to prøvegrupper med forskjellige medikamentsensitivitetsprofiler. En av de avgjørende skritt for en nøyaktig og objektiv analyse er isolering av RNA, som må være av høy renhet og integritet.

    MATS er programvaren vi velge blant en rekke lignende bioinformatiske verktøy tilgjengelig (f.eks Cuffdiff 2, DEXseq, DiffSplice og skjøting Compass) for påvisning av alternativ spleising 18. De viktigste nøkkelfunksjoner som gjør det til det foretrukne alternativet er dens overlegne presisjon og nøyaktighet, samt muligheten til å identifisere nye hendelser. MATS genererer to typer utgang inneholder forskjellig spleising analyse: den første er kun basert på ekson koblings teller og den andre er basert på fordelings teller samt leser på målet. Mens den sistnevnte er å foretrekke for å detektere exon hopper over hendelser, er det anbefalt åbruke det første alternativet for analyse av gjensidig eksklusive eksoner som denne tilnærmingen reduserer antallet falske positive kandidater for denne typen spleising endring.

    Videre, for analyser med fokus på intron oppbevaring, alternative 3 'og 5' spleisesete hendelser, bør en .gtf fil med kommenterte introner. Til syvende og sist, for å redusere biologisk og teknisk variasjon innenfor utvalgsgrupper og sikre høye sanne positiver, det anbefales sterkt å sekvens minst tre gjentak 34. Utvelgelsen av differensielt spleisede genet kandidater basert på MATS utgangs ble kombinert med en valideringstrinnet ved hjelp av RT-PCR. Dette er kritisk viktig for valg av sanne positive varianter blant en stor liste over statistisk signifikante kandidater. Nøkkelfaktoren for en korrekt validerings er utformingen av oligonukleotider og optimalisering av PCR-reaksjonene i henhold til molekylærbiologiske standarder. spesiell forsiktighetbør tas ved utforming av primere som spenner exon-ekson veikryss og ekstra valideringstrinn, for eksempel sekvensering av amplikonene av Sanger-metoden, er garantert for å bekrefte deres spesifisitet.

    Differensial spleising av DDX5 og PKM transkripsjoner oppdages av MATS representerer to eksempler på en avvikende spleising knyttet til resistens. DDX5 ΔEx12 ble ikke uttrykt i GC-resistente cellelinjer (CEM-C3 og R5), som har blitt valgt etter langvarig eksponering Dex. DDX5 ΔEx12 ble uttrykt i den parentale cellelinje, men også i den subklon CEM / R30dm, som ble valgt for resistens til det kjemoterapeutiske middel MTX snarere enn Dex. I kreftceller, ble PKM2 sterkt uttrykt i forhold til dens spleisevariant PKM1, men forholdet PKM2 / PKM1 var høyere i Dex-resistente celler, som foreslått av NGS resultater. Dette ble ikke observert for Panc-en prøve i forhold til sin gemcitabin-resistente motstykke og faktisk dette kandidat-gen var ikke blandtde statistisk signifikante hendelser i MATS analyse. Dette kan gjenspeile de forskjellige celletype og mekanismen av resistens indusert av gemcitabin eksponering.

    Som konklusjon, utgjør denne protokollen en passende tilnærming for oppdagelsen av spleisevarianter som kan ligger til grunn for legemiddelresistens og kan anvendes til enten leukemiceller 30 eller faste tumorceller 31. En klar begrensning er at tumorcellelinjer fange opp bare en liten del av kreft heterogenitet. Dessuten har de fleste cellelinjer blitt opprettholdt i mange år i monolag i vekstfremmende media. Disse forhold påvirker den cellulære egenskaper, noe som resulterer i valg av subpopulasjoner som avviker dramatisk fra cellene av de primære tumorer hvorfra de stammer. Men mange av de gener som er involvert i legemiddelresistens er også involvert i andre sentrale celle funksjoner som cellevekst og apoptose som kan bli påvirket av langsiktig culturin g i plast. Derfor, for å forbedre studiet av medikamentresistens, mer innsats bør være rettet mot utvikling av nye prekliniske modeller, for eksempel primære kulturer og xenografter, som nærmere etterligner in vivo-kreft mikromiljøet slik at man unngår relevante endringer i cellulære egenskaper forårsaket av lengre perioder med cellekultur og dyrkningsbetingelser. 32 Bemerkelsesverdig, kan vår protokoll brukes også til primærceller, ved hjelp av cytotoksisitetsanalyser for å bestemme ex vivo IC50-verdier. En annen begrensning er at siden mange resistensmekanismer eksisterer for hvert anticancer medikament, kunne like eller forskjellige mekanismer for resistens utvikles i celler eksponert for identiske men uavhengige behandlinger. Derfor bør en komparativ utvalg strategi innebærer parallelle valg og analyser, inkludert genetiske analyser på spleisevarianter, av samme foreldre celler behandlet med kjemoterapi agent.

    jove_content "> Andre metoder for funksjonell validering bør være rettet mot overekspresjon skjøte varianten av interesse i cellelinjer eller spesielt downregulate deres uttrykk ved hjelp av RNA interferens eller skjøte-svitsjing oligonukleotider 33.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sulforhodamine B Sigma-Aldrich 230162
    Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 251399
    CCRF-CEM ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CCL-119
    Panc-1 ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CRL-1469
    DMEM high glucose Lonza, Basel, Switzerland 12-604F
    RPMI-1640  Gibco, Carlsbad, CA, USA 11875093
    Fetal bovine and calf serum Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 758093
    penicillin G streptomycin sulphate Gibco, Carlsbad, CA, USA 15140122
    Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Sigma Aldrich 252859
    MTT formazan Sigma Aldrich M2003
    Anthos-Elisa-reader 2001 Labtec, Heerhugowaard, Netherlands UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
    Greiner CELLSTAR 96 well plates Greiner/Sigma M0812-100EA
    Trypsin/EDTA Solution 100 ml Lonza, Basel, Switzerland CC-5012
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82051-074
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82050-856
    Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) B.Braun Melsungen AG, Germany 362 3140

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
    2. McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
    3. Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
    4. van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
    5. Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
    6. Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
    7. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
    8. Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
    9. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
    10. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
    11. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
    12. Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
    13. Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
    14. Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
    15. Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
    16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
    17. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
    18. Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
    19. Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
    20. Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
    21. Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
    22. Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
    23. McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
    24. Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
    25. Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
    26. Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
    27. Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
    28. Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
    29. Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
    30. Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
    31. Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
    32. Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
    33. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
    34. Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).

    Tags

    Cancer Research kjemoterapi motstand cytotoksisitet alternativ spleising RNA-seq transcriptomics
    Ved hjelp av RNA-sekvensering for å oppdage Novel Splice Varianter Relatert til Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Kreft Modeller
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A.,… More

    Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A., Kooi, I. E., Gómez, V. E., Boggi, U., Jansen, G., Kaspers, G. J., Cloos, J., Giovannetti, E. Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models. J. Vis. Exp. (118), e54714, doi:10.3791/54714 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter