Introduction
Dictyostelium discoideum هم الانفرادي الاميبات المعيشة التربة التي تتغذى على البكتيريا والكائنات الدقيقة الأخرى، والتي يتم تناولها عن طريق البلعمة. لها دورة حياة فريدة ورائعة التي كانت مجالا رئيسيا للبحث منذ اكتشافه 1. الفائدة الأولى في التنمية متعددة الخلايا 2 و الأساس الجزيئي الكيميائي 3 استكمل قريبا من الدراسات التي تركز على الحركة الخلية القطبية خلية، مناعة فطرية. وبالإضافة إلى ذلك، D. وقدم discoideum كنظام نموذج ل4،5 البحوث الطبية الحيوية.
في الآونة الأخيرة، أنشأنا د. discoideum كنظام جديد لدراسة نظام مراقبة الجودة 6،7 بروتين (PQC). وأثرى بروتيوم في مثل بريون البروتينات المعرضة للتجميع، الأمر الذي يشكل تحديا للبروتين مراقبة الجودة 8. للتحقيق في ما إذا كان د. وقد وضعت discoideum الآليات الجزيئية خاصة للسيطرة على درجة عالية AGالمعرضة للgregation بروتيوم، درسنا سلوك البروتينات علامة المعرضة للتجميع على حد سواء في ظل ظروف النمو الطبيعي وأثناء الإجهاد. ظروف الإجهاد، مثل الإجهاد الحراري، ويمكن استخدامها لزيادة نسبة البروتين misfolding 9. ولذلك، فإننا سعى نظام حيث أننا يمكن أن تحفز التغيرات في درجات الحرارة في وقت واحد اتباع سلوك البروتينات علامة. لهذا الغرض، ونحن الجمع بين التصوير الخلية الحية مع التدفئة تسيطر بلتيير-استخدام (غرفة التبريد) مرحلة الحراري إدراج. يسمح هذا الأسلوب لنا للحفاظ على درجة حرارة ثابتة وموحدة، وكذلك للحث على التغير في درجة الحرارة السريع، وبعد دقيقة و.
يستخدم التصوير الخلية الحية لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية في د. discoideum. ومع ذلك، يواجه هذا النهج اثنين من القيود الرئيسية. أولا، تعرض الخلايا لحركية عالية وتميل إلى الهجرة خارج مجال الرؤية، وبالتالي تتبع الخلايا الفردية غالبا ما يتطلب التصوير في منطقة واسعة. تنقل الخلية يمكنيمكن خفضها من خلال تراكب آجار 10، ولكن هذه الظروف ليست مناسبة للتصوير على المدى الطويل بسبب انخفاض في قدرتها على البقاء. ثانيا، D. تظهر خلايا discoideum حساسية عالية بشكل خاص للصور سمية، مما يؤدي إلى التقريب الخلية واعتقال الإنقسامية 11. وتناولت البروتوكولات السابقة هذه المشكلة عن طريق إضافة أسكوربات على القضاء على الجذور والحد من التعرض مرة 12. هذا الأخير يمكن أن يكون حاسما إذا ما أعرب عن البروتين من الفائدة عند مستويات منخفضة ويظهر إشارة مضان ضعيفة. ويشير الكتاب أيضا إلى توفير درجة حرارة ثابتة من 21 درجة مئوية إما عن طريق التصوير في غرفة مكيفة الهواء أو باستخدام صناديق حضانة التحكم في درجة حرارته، والتي تغطي الهدف والمجهر المرحلة 12.
هنا، نحن تصف طريقة مع تحسين التحكم في درجة الحرارة باستخدام غرفة التبريد وضعت في 23 درجة مئوية. أثناء التصوير لدينا مجموعة المتابعة تعزز بشكل كبير من المقاومة إلى الصورة سمية. هذايسمح استخدام التعرض مرات أعلى وأعلى كثافة الضوء الإثارة. هذا الأمر أهمية خاصة خلال الوقت الفاصل بين التصوير، كما تحتاج إلى فترات زمنية لتكون متوازنة بعناية ضد عدد من مواقع تصوير ووقت التعرض المستخدمة. إمكانية زيادة أعداد مواقف تصوير أيضا يسمح للتغطية منطقة التصوير أوسع ويسهل تتبع الخلايا الفردية على مدى فترة أطول من الزمن.
Protocol
1. خلية التحضير
- نمو الخلايا
- تنمو د. خلايا discoideum في المتوسط AX في 23 درجة مئوية تحت الضوء في لوحات زراعة الأنسجة. تجنب الاحتفاظ الخلايا بكثافات عالية فوق 75٪ confluency.
ملاحظة: للحصول على استجابة المثلى للإجهاد الحراري، والخلايا يجب أن تكون في مرحلة النمو الأسي وألا يكون قد بلغ مرحلة ثابتة. - في اليوم قبل التصوير، والخلايا تنقسم إلى متوسطة مضان منخفضة (LFM) إلى 1 × 10 4 خلية / مل.
ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية للحد من مضان الخلفية التي تسببها على المدى المتوسط AX. ويمكن تخفيض فترة حضانة لمدة لا تقل عن 2 ساعة. ومع ذلك، يمكن الحويصلات تناولها في المتوسط AX لا تزال تولد بعض الإشارات الخلفية بعد 2 ساعة.
- تنمو د. خلايا discoideum في المتوسط AX في 23 درجة مئوية تحت الضوء في لوحات زراعة الأنسجة. تجنب الاحتفاظ الخلايا بكثافات عالية فوق 75٪ confluency.
- إعداد الخلايا للفحص المجهري
- قبل التصوير، وخلايا الحصاد من لوحة الأنسجة في LFM ونقل عدد كاف من الخلايا في أطباق زجاجية أسفل.
ملاحظة: عادة،1 × 10 5 خلية / مل غير كاف. ومع ذلك، إذا كان الإعداد التجريبية يتطلب فترات التصوير الطويلة (أطول من 8 ساعات)، تحتاج أعداد الخلايا إلى تعديل بعناية، ود. وخلايا discoideum الانتقال إلى دورة التنموية والبدء في تيار ومجموع المباراتين إذا أعداد الخلايا مرتفعة بينما المواد الغذائية منخفضة. - السماح للخلايا ليستقر لمدة 20 دقيقة. إزالة الخلايا غير مسددة عن طريق استبدال بعناية الوسيلة المستخدمة مع المتوسط الطازجة.
- قبل التصوير، وخلايا الحصاد من لوحة الأنسجة في LFM ونقل عدد كاف من الخلايا في أطباق زجاجية أسفل.
2. التصوير
ملاحظة: بروتوكول يمكن استخدامها في أنظمة واسعة المجال وكذلك في الاجهزة المجهر مبائر. استخدام مربع حضانة التحكم في درجة حرارته تغطي الأهداف والمسرح المجهر مفيد، ولكن ليس من الضروري التحكم في درجة حرارة. يتم تعيين درجة حرارة مربع الحضانة إلى أعلى درجة حرارة المستخدمة في التجربة، على سبيل المثال، إلى 40 درجة مئوية إذا يتم تنفيذ الإجهاد الحراري. وإلا، يتم ضبط درجة الحرارة إلى 256؛ C. وينبغي بذل التغيرات في درجات الحرارة في وقت مبكر يسمح النظام للتكيف، والتغيرات في درجات الحرارة أثناء التصوير يمكن أن تؤثر على التركيز.
ملاحظة: أثناء التصوير، ويتم التحكم في درجة الحرارة باستخدام غرفة التبريد. درجة الحرارة الافتراضية لتصوير الخلايا غير المجهدة هي 23 درجة مئوية. لظروف الإجهاد الحراري، وزيادة درجة الحرارة وفقا لذلك إلى المستوى المطلوب. العنصر بيزو في غرفة التبريد يمكن أن تستجيب بسرعة جدا من التحول درجة الحرارة. ومع ذلك، فإن التركيز على الصور تتغير قليلا (يمكن أن تحيد لتصل إلى 20 ميكرون تبعا لتغير درجة الحرارة). وبالتالي مطلوب إعادة التركيز اليدوي في الدقائق الأولى من الحصول على الصور، إلا إذا تم تجهيز الاداة المستخدمة مع التركيز التلقائي الأجهزة.
- الحصول على الصور في ظل ظروف غير وشدد
- خلايا صورة في ظل ظروف غير أكدت في 23 درجة مئوية، والحصول على ما لا يقل عن 6 مجالات عرض (FOVs).
ملاحظة: حالة عدم الإجهاد يمكن أن يكون visualizإد إما عن طريق تسجيل قصيرة الوقت الفاصل بين (5-30 دقيقة) أو الحصول على اللقطات التمثيلية. لكل حالة أو خلية خط امتلاك حد أدنى من 6 مجالات عرض (FOVs).
ملاحظة: في حالة الخلايا الفردية هي من مصلحة أو مركز الخلايا منها في منتصف مجال الرؤية وتسجيل سلسلة بلاط 3 × 3 مع فوف التي تحتوي على خلايا الفائدة في منتصف د. خلايا discoideum هي متحركة وقد تهاجر من فوف. ومع ذلك، فإن سلسلة بلاط 3 × 3 يزيد من مساحة يحتمل أن تستكشف من قبل خلية من الاهتمام وأنها لا تزال يمكن عزوها لفترات زمنية الفاصل بين ~ 6 ساعات. - الحصول على مداخن Z من أقصى 7 ميكرون في 1-،25 ميكرون خطوات للقبض على وحدة التخزين بالكامل من الخلية.
- الحصول على صورة مرجع حقل مشرق لتقييم العدد الكلي للخلايا.
- خلايا صورة في ظل ظروف غير أكدت في 23 درجة مئوية، والحصول على ما لا يقل عن 6 مجالات عرض (FOVs).
- الحصول على الصور عن الإجهاد الحراري
- ضبط درجة حرارة غرفة التبريد إلى 30 درجة مئوية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </ لى>
- بعد عرض درجة الحرارة وصلت القيمة المطلوبة، إعادة تركيز يدويا في قناة الحقل مشرق وتحقق من كل FOVs سجلت قبل البدء في الوقت الفاصل.
- بدء الوقت الفاصل عن 4 ساعات من الإجهاد الحراري مع فاصل زمني من 5-10 دقيقة بين نقاط الوقت. تحقق من التركيز الصحيح خلال الاستحواذ على النقطتين الأولى الساعة.
- الحصول على الصور أثناء الانتعاش
- بعد الإجهاد الحراري، والحد من درجة الحرارة إلى 23 درجة مئوية، والانتظار لعرض درجة الحرارة لضبط وإعادة التركيز يدويا.
- سجل الوقت الفاصل بين الأفلام في مرحلة الانتعاش لمدة 8-10 ساعة في 10-20 فترات زمنية دقيقة. تحقق من التركيز الصحيح خلال الاستحواذ على نقطة لأول مرة.
تحليل 3. صورة
ملاحظة: لتحديد عدد الخلايا إيواء بؤر عصاري خلوي، تقييم العدد الكلي للخلايا وعدد من الخلايا التي تحتوي على بؤر عصاري خلوي في كل مرةهيكل. ويرجع ذلك إلى صعوبة تقسيم الخلايا من الصور الحقل مشرق، يحتاج الكمي الذي يتعين القيام به يدويا. في ما يلي، يتم وصف وتحليل البيانات لحزمة معالجة الصور مجانية ((http://fiji.sc/Fiji). ويتطلب البرنامج المساعد "خلية مكافحة" (http://fiji.sc/Cell_Counter).
- تقييم العدد الكلي للخلايا
- تحميل مشرق صورة حقل كومة (XYT) بالنقر على "ملف" و "فتح".
- فتح "خلية مكافحة" المساعد ( "الإضافات" - "خلية مكافحة"). تحميل كومة الصورة عن طريق النقر على "تهيئة".
- اختيار النوع المناسب من العدادات وذلك بوضع علامة في الخانة المناسبة.
ملاحظة: استخدام نوع (1)، مضادة للعدد الكلي للخلايا والنوع 2 كما مضادة للخلايا مع بؤر عصاري خلوي. عدد جميع الخلايا. - حفظ علامات بالنقر على "حفظ علامات".
- تقييم عدد من الخلايا التي تحتوي على بؤر عصاري خلوي
- <لى> تحميل hyperstack صورة مضان (XZYT) ( "ملف" - "فتح")، وجعل الحد الأقصى لإسقاط كثافة استخدام "Z-العارض" (صورة / الأكوام).
- فتح "خلية مكافحة" المساعد. تحميل الصورة الناتجة كومة (XYT) بالنقر على "تهيئة".
- تحميل علامات بالنقر على "علامات الحمل".
تحذير: أسماء ملف الصورة المرجعية وكومة مضان يجب أن تكون متطابقة. إذا لزم الأمر، إعادة تسمية وفقا لذلك قبل تهيئة كومة الصورة. - اختر نوع علامة المناسب (انظر 3.1.3) وعدد الخلايا مع بؤر عصاري خلوي. علامات القائمة يمكن أن تستخدم كدليل إرشادي لمنصب الخلايا الفردية.
- استرداد عدد من التهم لكل شريحة من خلال النقر على "نتائج" وحفظ التهم في أماكن أخرى لمزيد من العمليات الحسابية.
Representative Results
بروتوكول التصوير وصفه يمكن استخدامها لتحليل سلوك البروتينات مثل بريون المعرضة للتجميع في الاميبا د. يظهر discoideum أثناء الإجهاد الحراري. الشكل 1 توزيع GFP الموسومة polyglutamine البروتين Q103 في الخلايا تحت ظروف النمو الطبيعية (الشكل 1A)، 2 بعد ساعات من الإجهاد الحراري في 30 درجة مئوية (الشكل 1B) وبعد 6 ساعات من الانتعاش التوتر و النمو في ظروف النمو الطبيعية (الشكل 1C). على ارتفاع درجة الحرارة من 23 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية، وعلامة-Q103 GFP coalesces من توزيع منتشر إلى منقط الهياكل. بعد الإفراج الإجهاد والنمو في درجة الحرارة العادية، وهذه الهياكل تذوب. إعادة توزيع Q103-GFP وتشكيل الحرارة التي يسببها الإجهاد عصاري خلوي بؤر يمكن كميا باستخدام تحليل الصور. ويبين الشكل 2A تحليل FOVs الفردية باستخدام فيجي والمساعد "Cالذراع مكافحة ". ويبين الشكل 2B الكمي لاستجابة الإجهاد الحراري، وهذا يدل على أن عصاري خلوي Q103-GFP زيادة بؤر في عدد مع استمرار الإجهاد الحراري. وخلال الإجهاد الحراري، ومراقبة الجودة البروتين (PQC) النظام هو طغت، وبالتالي aggregation- البروتينات عرضة مثل البروتين Q103 مثل بريون لا يمكن الحفاظ في دولة قابلة للذوبان وعلى نحو متزايد مجموع المباراتين في بؤر عصاري خلوي. الخلايا تظهر أيضا التقريب مميزة، كما هو مبين في الشكل 1B، والحد من بؤر عصاري خلوي بعد إزالة التوتر تشير إلى أن مجمعة تذاب البروتينات.
جودة التصوير حساسة لكثافة الخلايا الأولية. ويبين الشكل 3 مثال على الخلايا بعد التعافي من الإجهاد، مقارنة الكثافة المناسبة الأولية الخلية (الشكل 3A) وعالية الكثافة الخلية الأولية (الشكل 3B). إذا كانت كثافة الخلية الأولية مرتفعة جدا، نجم خلاياتيد لتشكيل تيارات كما هو مبين في الشكل 3B. وقد انتقل هذا الذي يفرض صعوبات على القياس الكمي لاحق كما هو الخلايا من البؤري.
ويمكن استخدام الطريقة الموصوفة لرصد التغيرات التي يسببها درجة الحرارة كما هو موضح أعلاه. ويمكن أن تستخدم أيضا للحد من صور سمية عند التصوير في درجة حرارة النمو الفسيولوجية الشكل 4 يوضح مقارنة بين الخلايا المصورة في 23 درجة مئوية في تبريد الغرفة (الشكل 4A) والخلايا المصورة دون التحكم في درجة الحرارة في غرفة مكيفة الهواء، تعيين إلى 25 درجة مئوية (الشكل 4B). عند التعرض المستمر للضوء الإثارة، وخلايا تعتقل عندما لا تصويرها تحت ظروف التحكم في درجة حرارته. هذا التغيير في شكل الخلية تشير إلى الإجهاد.
شكل 1:
الصفحة = "1"> 
الشكل 2: الكمي لتشكيل بؤر عصاري خلوي الناجم عن الحرارة (أ) تحليل الخلايا باستخدام حزمة لمعالجة الصور المجانية فيجي والمساعد "خلية مكافحة". يتم تحديد المبلغ الكلي للخلايا (نوع 1، علامات مكافحة الزرقاء) في صورة حقل مشرق. يتم تحميل علامات في قناة GFP وعدد من الخلايا التي تحتوي على بؤر عصاري خلوي (نوع 2، علامات مكافحة الحمراء) يتم تحديد. (ب) الكمي بؤر بعد 3 ساعات من الإجهاد الحراري في 30 درجة مئوية و 3 ساعات من الانتعاش الإجهاد في 23 ° C (ن = 4 حقول للعرض، خطأ بار = SD). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
.jpg و"/>
الشكل 4: تأثير التحكم في درجة الحرارة على التأثيرات الضوئية (A) خلايا تصويرها لمدة 10 دقيقة مع التحكم في درجة الحرارة عند 23 درجة مئوية: 6 حقول نظر، ض المكدس (المباعدة بين 0.5 ميكرومتر، عينة سماكة 8 ميكرومتر)، والفاصل الزمني (المجموع الوقت 10 دقيقة، انقضاء 1 دقيقة)، قناة GFP (0.07 مللي ثانية وقت التعرض، وكثافة الليزر 10٪)، قناة طلب تقديم العروض (0.1 مللي ثانية وقت التعرض، وكثافة الليزر 10٪). تظهر خلايا أي علامات التغيرات المورفولوجية المميزة المرتبطة بالإجهاد الضوئي السمي. (ب) خلايا تصويرها لمدة 10 دقيقة دون التحكم في درجة الحرارة (نفس الظروف كما هو الحال في A). خلايا يحمل علامات سمية ضيائية الناجم عن التقريب، مشيرا إلى الإجهاد. شريط النطاق = 10 ميكرون. تم تصوير الخلايا على نظام يقوم على المجهر مع الهدف 100X / 1.4 الفتحة العددية (NA). وقد تم جمع الصور مع كاميرا CCD كما 1024 س 1024 بكسل الملفات باستخدام 1 × 1 binning.4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لدراسة سلوك بروتين معين من الفائدة استجابة للإجهاد الناجم عن الحرارة. تم الإبلاغ عن زيادة درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية لتحريك استجابة الإجهاد الحراري وفي ظل هذه الظروف جدوى د. يتم تقليل discoideum بشكل ملحوظ.
التعديلات
بروتوكول يمكن تعديلها لمقارنة سلوك البروتينات المختلفة تحت ظروف الإجهاد نفسها. لهذا، يتم نقل الخلايا معربا عن بروتينات مختلفة مع نفس العلامة الفلورسنت في أطباق متعددة أيضا، مثل أربعة أطباق غرفة (القسم 1.3.1). ويمكن أيضا أن تطبق البروتوكول على خلايا المشترك، معربا عن البروتينات مع علامات مختلفة، مثل GFP أو طلب تقديم العروض. هذا يمكن أن يكون على سبيل المثال تستخدم لمراقبة سلوك مختلف مكونات نظام لمراقبة الجودة من البروتين (PQC). الخلايا معربا عن GFP الموسومة علامة التجميع ومختلف مكونات PCQ الموسومة طلب تقديم العروض ويمكن ملاحظة استخدام متعددة جيدازعته للتصوير. وهذا يضمن ظروف الإجهاد نفس (سرعة ارتفاع درجة الحرارة / نقصان، مدة درجة الحرارة زيادة / نقصان) ويسمح للدراسات المقارنة.
وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول يمكن استخدامها لدراسة تأثير النظام PQC على استجابة الإجهاد الحراري. نشاط المكونات يمكن التضمين عن طريق تغيير مستويات التعبير باستخدام أدوات الوراثية مثل الضربة القاضية، أو overexpression أو باستخدام مثبطات معينة المتاحة تجاريا 6. وproteasome ويمكن تثبيط بإضافة MG132 (100 ميكرومتر) أو lactacystin (10 ميكرومتر) إلى وسط النمو. كوصي Hsp90 يمكن تحول دون استخدام geldanamycin (6 ميكرومتر) أو radicicol (10 ميكرومتر). كوصي HSP70 يمكن تثبيط مع VER-155088، على الرغم من أننا لا يمكن تأكيد فعالية تثبيط في إعدادات التجريبية لدينا حتى الآن. يجب إضافة مثبطات يوم واحد قبل التصوير ويتم تحضين الخلايا لمدة 14 ساعة.
Criti خطوات كال في إطار بروتوكول
في خطوة حاسمة لتقييم الاضطراب الناجم عن الحرارة وحالة الخلايا السابقة للتجربة التصوير. وأظهرت دراسات في الخميرة أن الخلايا تكتسب مقاومة لمجموعة متنوعة من الضغوط البيئية خلال مرحلة ثابتة 13. نحن أيضا لاحظ الحد الأدنى من القدرة على الاستجابة للإجهاد الحراري المطبق إذا د. قد خلايا discoideum بلغت مرحلة ثابتة قبل التصوير. لذلك، والحفاظ على عدد الخلايا المستمر <5 × 10 5 خلية / مل أمر بالغ الأهمية.
وعلاوة على ذلك، يمكن أن أعداد الخلايا عالية لحث على الانتقال من دورة الخضري من د. discoideum لدورة التنموية، مما اثار مسارات الموت جوعا، والتي قد تؤدي إلى استجابة مختلفة للإجهاد الحراري. إذا تم التوصل إلى أرقام الهواتف المحمولة عالية في مرحلة الانتعاش بعد الإجهاد الحراري، تدفق وخلايا تجميع يمكن أن تتداخل مع تحليل البيانات وتتحرك الخلايا من التركيز (انظر الشكل 4).
محتوى "> الحد من تقنيةفقدان التركيز هي عنق الزجاجة للبروتوكول. خلال التغيرات في درجات الحرارة، ويمكن للطائرة الوصل تحول جذري، الأمر الذي يتطلب إعادة تركيز اليدوي في فترة زمنية فورا بعد تغيير درجة الحرارة. القفزة في التركيز يمكن أن يكون أحيانا شديد جدا بحيث لا يمكن التغلب عليها عن طريق ضبط تلقائي للصورة البرنامج، وخاصة إذا كان الوقت بين نقاط الوقت مرتفع. ومع ذلك، إذا تم تجهيز المجهر استخدامها مع ضبط تلقائي للصورة الأجهزة، وهذا الاختناق يمكن التحايل عليها.
أهمية تقنية فيما يتعلق بأساليب الحالية
بالمقارنة مع الاجهزة الموجودة مثل استخدام غرف مكيفة الهواء، وصناديق حضانة التحكم في درجة حرارته تغطي الأهداف والمسرح المجهر أو التحكم في درجة حرارته مراحل والياقات موضوعية، واستخدام غرفة التبريد يوفر تحكم أكثر دقة من المحيط درجة الحرارة. وبلتيير عنصر في غرفة التبريد يمكن الحفاظ على تيم ثابت وموحدperature في جميع أنحاء الإعداد التجريبية. في الاجهزة الكلاسيكية، قد تؤدي الاختلافات في درجة الحرارة المحلية إلى نتائج المراقبة المختلفة. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن تستجيب بسرعة وبسرعة مع التغيرات التي يسببها في درجة الحرارة، في حين التكيف مع الاجهزة الكلاسيكية ببطء شديد لتغيرات درجة الحرارة التي يسببها، وخصوصا خفض درجة الحرارة. وبلتيير عنصر في غرفة التبريد يمكن أن تشمل أيضا مجموعة واسعة درجة حرارة (15-40 درجة مئوية) من الاجهزة الكلاسيكية، والتي تصل درجات الحرارة مثل 15 درجة مئوية أو 40 درجة مئوية أمر صعب للغاية.
Dictyostelium discoideum حساسة بشكل خاص للصور سمية. الدراسات السابقة استخدمت أسكوربات كما زبال للحد من صور سمية. ومع ذلك، وفترات التصوير الطويلة تتطلب مكملات إضافية. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام أسكوربات يقتصر على الدراسات التي آلية الفائدة لا يتأثر الملحق المضادة للأكسدة. نقترح أن التصوير التي تسيطر عليها درجة الحرارة يمكن أن تستخدم بمثابة appr البديلoach للحد من صور سمية، ويمكن دمجه مع إضافة أسكوربات إلى مزيد من الانخفاض سمية.
التأثيرات الضوئية يمكن التقليل من خلال توفير درجة حرارة ثابتة وموحدة من 23 درجة مئوية باستخدام غرفة التبريد. خلايا تصويرها باستخدام التحكم في درجة الحرارة تظهر علامات أقل من الصور سمية، هذا التقريب الخلية، لفترة زمنية أطول. هذا كما يسمح التصوير مع كثافة أعلى، فترات زمنية أصغر أو أكثر من حقول نظر (FOVs).
التطبيق العام
وقد تبين الإجهاد الحراري في ارتفاع درجات الحرارة ان تثير رد فعل الإجهاد الحراري المختلفة (14). لذلك، وزيادة درجة الحرارة إلى 34 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية قد تحفز استجابة مختلفة. بالإضافة إلى الإجهاد الحراري المطبق، ومدة حالة الإجهاد معين يمكن تعديلها لدراسة الاستجابة الفورية أو التكيف على المدى الطويل للإجهاد الحراري.
بشكل عام، لا يمكن للبروتوكول وصفها يكونوسعت إلى مجموعة واسعة من التطبيقات. لأن التحكم في درجة الحرارة دقيقة يقلل إلى حد كبير الآثار الصورة السامة، وبروتوكول يمكن استخدامها في الأماكن التي تتطلب الأوقات عالية التعرض و / أو ارتفاع شدة الضوء الإثارة، على سبيل المثال، لتصور البروتينات مع مستوى التعبير منخفضة، أو بالاشتراك مع فترات زمنية قصيرة بين التصوير، على سبيل المثال، خلال الوقت الفاصل بين التصوير. كما يمكن أن يكون مفيدا لتصوير الأجسام التي تغطي الخلية بأكملها، على سبيل المثال، الأنابيب الدقيقة، كما تتطلب هذه الإعدادات على عدد كبير من البصرية ض أقسام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartment glass-bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
References
- Bonner, J. T. Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).
- Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium. Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).
- Williams, J. G. Dictyostelium finds new roles to model. Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).
- Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine. European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).
- Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).
- Malinovska, L., Alberti, S. Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem. Prion. 9 (5), 339-346 (2015).
- Schneider, K., Bertolotti, A. Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms. Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).
- Dobson, C. M.
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).
- Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium. Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).
- Herman, P. K.
- Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S.
