Summary
kan undersökas rollen av sortiment (rumslig segregation) i evolutionära scenarier med enkla mikrobiella system i laboratoriet som tillåter kontrollerad justering av rumsliga fördelning. Genom att modifiera grundare celldensitet, kan olika sortiment nivåer visualiseras med hjälp av fluorescerande bakteriestammar i kolonin biofilmer av Bacillus subtilis.
Introduction
Under de senaste decennierna har mikrober erkänts som sociala samhällen som är förknippade med olika ekosystem på jorden 1,2. I motsats till plankton kulturer används i allmänhet laboratoriesed, mikrober i miljön visar ett varierat utbud av rumsliga samhällsstrukturer beroende på den ekologiska inställningen. Enkla mikrobiella system kan användas för att förstå konsekvensen av rumsliga strukturer på utvecklingen av sociala interaktioner 3,4. Publikationer under de senaste 2-3 åren med hjälp av både eukaryota och prokaryota modellsystem betonade effekterna av rumsliga strukturer på stabiliteten av samarbetet inom mikrobiella populationer 5-8. Dessutom förpliktar interaktioner mellan mikrober, t.ex. metabolisk tvärmatning kan också ändra den geografiska fördelningen av samverkande partner 9-11. Inverkan av rumslig struktur i dessa studier är oftast undersöktes med användning av ytan fäst fastsittande celler som lever i såsom brukar kallas biofilmer eller i kolonier som växer på ytan av ett agarsubstrat. Genetisk drift resulterar i hög rumslig sortiment kan observeras i mikrobiella kolonier där närings utarmning vid kanten av en celldelning medieexpansionsresulterar i serie av genetiska flaskhalsar som orsakar hög lokal fixering sannolikheten för vissa klonala linages 12. Genetisk drift kan därför användas för att undersöka betydelsen av rumslig segregation i mikrobiella kolonier.
I miljön, biofilmer är flerarts samhällen omgivna av egenproducerade polymermatris 13. Biofilm struktur, funktion och stabilitet är beroende av ett komplext nätverk av sociala interaktioner där bakterier utbyta signaler, matriskomponenter och resurser, eller tävla om utrymmet och näringsämnen med hjälp av gifter och antibiotika. Bacillus subtilis är en jordlevande och rot-koloniserande bakterie som utvecklar mycket organiserade biofilm samhällen 14. I analogi med socialinsekter, B. subtilis-celler använder en arbetsfördelning strategi, utveckling av subpopulationer av extracellulära matrix producenter och kannibaler, rörliga celler, vilande sporer och andra celltyper 15,16. Differentieringsprocessen är dynamisk och kan förändras genom miljöförhållanden 17,18.
Strategier för ytan kolonisering av bakterier lätt kan manipuleras under laboratorieförhållanden genom att ändra agar koncentrationen i tillväxtmediet. Vid låga agar nivåer (0,2-0,3%), bakterier som härbärgerar aktiv flag kan simma, medan halvfast agar (0,7-1% agar) underlättar flagellum driven samhälle sprider sig, kallas vimlar 19-21. I avsaknad av flagellum, vissa bakteriestammar kan röra sig över halvfast medium via skjutdörrar, dvs tillväxt beroende befolknings expansionen underlättas av exopolysackarid matris och andra utsöndrade hydrofobin föreningar 22-24. Slutligen bakterier som är capable av biofilm utveckling bildar arkitektoniskt komplexa kolonier på hårt agarmedium (1,2-2%) 14,17,25. Medan dessa egenskaper undersöks i laboratoriet genom att finjustera villkoren i naturliga livsmiljöer dessa utanpå sprida strategier kanske transitering gradvis från en till en annan beroende på miljöförhållanden 26. Även enstaka cellbaserad motilitet är kritisk under initiering av biofilm utveckling vid luft-vätske-gränssnitt i både grampositiva och -negativa bakterier 27 komplexa koloni biofilmer B. subtilis påverkas inte av strykningen av flagellar rörlighet 28. Men fysisk planering under utvecklingen av B. subtilis koloni biofilmer beror på tätheten av bakterie inokulum användes för att initiera biofilm 8.
Här använder vi B. subtilis för att visa att rumslig segregation under ytan kolonisering beror på mekanismen för befolkningsnivå motility (dvs. svärma eller glidande), och koloni biofilm utveckling är beroende av grundaren celltätheten. Vi presenterar ett fluorescerande mikroskopi verktyg som kan användas för att kontinuerligt övervaka mikrobiell biofilm tillväxt, yta kolonisering och sortiment på makroskala. Vidare är en kvantifiering metod som presenteras för att bestämma den relativa påfrestningen överflöd i befolkningen.
Protocol
1. Beredning av odlingsmedier, halvfast agar och Biofilm plattor, Pre-kulturer
- Medium Förberedelser för Svärma och Sliding
- Lös upp 2 g av Lenox Broth (LB) och 0,7 g agar-agar i 100 ml jonbytt vatten och autoklav under 20 minuter vid 120 ° C. Använd små volymer (50-200 ml) för att förbättra reproducerbarhet mellan experiment.
- Omedelbart efter sterilisering, stäng locket av mediet flaskan för att minska avdunstningen och placera i ett 55 ° C inkubator i åtminstone 2 timmar.
- Efter det att mediumtemperaturen har härdat till 55 ° C, häll 20 ml agar LB-medium i en 90 mm polystyren diameter Petri-skål under ett laboratorie steril huva. För tidsförlopp experiment, häll 5 ml agar LB-medium per 35 mm polystyren diameter petriskål.
- Stäng petriskål omedelbart efter gjutning, stapla inte mer än 4 plattor ovanpå varandra och låt agarmediet stelna under minst en timme.
- 2xSG Medium Persätta Colony Biofilmer
- Lös upp 1,6 g näringsbuljong, 0,2 g KCl, 0,05 g MgSO 4 7H 2 O, och 1,5 g Agar-agar i 100 ml jonbytt vatten och autoklav under 20 minuter vid 120 ° C. Använd små volymer (50-200 ml) för att förbättra reproducerbarhet mellan experiment.
- Omedelbart efter sterilisering, stäng locket av mediet flaskan för att minska avdunstningen och placera flaskan i ett 55 ° C inkubator i åtminstone 2 timmar.
- Efter det att mediumtemperaturen har själv justerades till 55 ° C, tillsätt 0,1 ml filtersteriliserad 1 M Ca (NO3) 2-lösning, steriliseras 0,1 ml filtret 100 mM MnCl2-lösning, 0,1 ml filtersteriliserad 1 mM FeSO 4-lösning och 0,5 ml steril 20% glukoslösning.
- I ett laboratorium steril huva, häll 20 ml agar 2x SG-medium per 90 mm polystyren diameter petriskål. För tidsförlopp experiment, häll 5 ml agar LB-medium per 35 mm polystyren diameter petriskål.
- close petriskålen omedelbart efter gjutning, stapla plattan ovanpå varandra, men inte mer än 4 plattor, och låt agarmedium stelna i minst en timme.
- Framställning av startkulturer
OBS: B. subtilis 168, NCIB 3610 derivat stammar som används i de metoder som beskrivs nedan konstitutivt producera växthus eller röd-fluorescensproteiner och beskrevs innan 8,27. Stammar lagras rutinmässigt i -80 ° C frys.- Inokulera startkulturer från -80 ° C lager i 3 ml LB-medium och inkubera över natten (16-18 h) vid 37 ° C med horisontell skakning (225 rpm). Inte inkubera kulturen längre än 18 timmar som vilda isolat av B. subtilis är mestadels benägna att aggregera och bilda en biofilm i provröret.
2. Samtidig ympning av fluorescens märkt bakteriestammar för Ytspridning
- Torkning av Halvfasta agarplattor för svärma ochGlidning av B. subtilis.
- Torra agarplattor för svärmande och glidande under 20 minuter före inokulering. Torka plattorna utan lock i en huv med laminärt flöde (se figur 1).
OBS: Bakteriell svärmning och glidande beror på torrhet i halvfast agarmedium. Otillräcklig torkning tillåter vatten samlas på agarmediet resulterar i flagellum-medierad simning. Förlängda torktid resulterar i brist på svärmning.
- Torra agarplattor för svärmande och glidande under 20 minuter före inokulering. Torka plattorna utan lock i en huv med laminärt flöde (se figur 1).
Figur 1:.. Experimentell arbetsflöde Det enhetliga förfarandet avbildas i figuren, inklusive beredning av odlingsmediet, torkning av plattan, ympning och fluorescensmikroskopi detektering (från vänster till höger) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Co-ympningav bakteriekulturer för Svärma och Sliding
- Bestämma de optiska densiteterna hos natten startkulturer vid 600 nm och blanda densitet normaliserade grön- och röd-fluorescerande protein producerande stammar av B. subtilis NCIB 3610 eller dess Δ hag-derivatet i ett 1,5 ml reaktionsrör. Till exempel mixa 100 | il av stam 1 med (100 * [OD 600 av övernattskultur av stam 1] / [OD 600 av övernattskultur av stam 2]) il av stam 2. Milt vortex (3 sek vid max hastighet) för homogen fördelning.
OBS: B. subtilis NCIB 3610 stammar ympas att observera myllrande, medan deras Δ hag derivat används för att skjuta. - Spot 2 | il av blandad kultur på mitten av en förtorkad plattan (se figur 1) och ytterligare torka plattan under 10 min efter ympning.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C upprätt för att tillåta fukt att kondensera på locket och inte på agarytan. <br /> OBS: Inkubationstiden för B. subtilis svärmning är typiskt mellan 8-16 timmar. I allmänhet, i kanten av svärmen når den sida av 90 mm petriskål i 8 tim. Glidning är en långsammare process och kräver åtminstone 16-42 h av inkubation. Efter 36 h, den glidande front når den sida av 90 mm petriskål.
- För tidsförlopp experiment, placera 35 mm diameter petriskålar i en förvärmd skede inkubation kammare inställd på 37 ° C. Säkerställa att locket petriskålens förblir avlägsnas under hela experimentet. Ställ locket på scenen inkubatorn till 40 ° C för att kringgå fuktbildning på toppen av inkubatorn.
- Bestämma de optiska densiteterna hos natten startkulturer vid 600 nm och blanda densitet normaliserade grön- och röd-fluorescerande protein producerande stammar av B. subtilis NCIB 3610 eller dess Δ hag-derivatet i ett 1,5 ml reaktionsrör. Till exempel mixa 100 | il av stam 1 med (100 * [OD 600 av övernattskultur av stam 1] / [OD 600 av övernattskultur av stam 2]) il av stam 2. Milt vortex (3 sek vid max hastighet) för homogen fördelning.
3. Samtidig ympning av fluorescens Märkta Bakteriestammar med olika initiala celldensiteter
- Torkning agarplattor om Colony Biofilm Bildning av B. subtilis.
- Torka plattorna under koloni biofilm utveckling utan lock i ett laminärt flödehuv under 15 minuter före inokulering.
OBS: Otillräcklig torkning resulterar i ökad fuktighet och simning eller myllrande kan vara möjligt 29. Torkning alltför långa resultat i små biofilm kolonier.
- Torka plattorna under koloni biofilm utveckling utan lock i ett laminärt flödehuv under 15 minuter före inokulering.
- Framställning av 10-faldiga utspädda startkulturer för Colony Biofilms
- Blanda 100 pl av växthus och röda fluorescerande protein som producerar över natten startkulturer av B. subtilis 168 i en 1,5 ml reaktionsrör och milt virvel för homogen fördelning. Förbered 10-faldig spädningsserie i LB-medium.
- Spot 2 pl av icke-utspädd eller 10 1, 10 2, 10 3, 10 4 utspädda blandade kulturer på plattan innehållande biofilm-inducerande medium.
OBS: 6 till 9 biofilm kolonier kan initieras på ett enda 90 mm petriskål med beaktande av att kolonierna är åtskilda på samma avstånd från varandra. - Inkubera plattorna vid 30 ° C upprätt för att tillåta fukt att kondensera på locket ochinte på agarytan.
OBS: Inkubationstiden för B. subtilis biofilm är mellan 1-3 dagar. Generellt kolonin biofilm av B. subtilis når sin genomsnittliga storleken och komplex struktur i 2 dagar. - För tidsförlopp experiment, placera en enda inokulum i mitten av en 35 mm diameter petriskål och placera skålen i en förvärmd skede inkubation kammare inställd på 30 ° C. Säkerställa att den övre delen av Petri-skålen förblir avlägsnas under hela experimentet. Ställ locket på scenen inkubatorn till 35 ° C för att kringgå fuktbildning på toppen av inkubatorn.
4. Fluorescerande Mikroskopi Detektion av Labelled Stammar
- Utrustning Beskrivning för Imaging.
- För att upptäcka yta kolonisering och fluorescenssignalen, använder en motoriserad fluorescensstereozoommikroskop (se detaljerad lista i Material tabell) utrustad med en 0,5 x PlanApo mål, två LEDKall ljuskällor (en för fluorescensdetektion och en för synligt ljus), filteruppsättningar för GFP (excitering vid 470/40 nm och emission vid 525/50 nm) och mRFP (excitering vid 572/25 nm och emission vid 629 / 62 nm), och en hög upplösning monokrom kamera.
- Utför bildtagning och behandling med lämplig mjukvara för stereozoom mikroskop inklusive flerkanalig och time-lapse-moduler. För tidsförlopp experiment, använda en vanlig värmesteg inkubator monterad stereozoom-mikroskop med en adapter.
- Avbildning av svärmar och Sliding Expansion
- Använd lägsta förstoringen för att fånga den största möjliga yta av 90 mm platta. Ställ ursprung ympning (mitten av 90 mm petriskål) till hörnet av den synliga området för att övervaka radiell bakterie expansion och fluorescens.
- Justera optimal exponering tid beroende på styrkan av fluorescenssignalen.
OBS: För konstitutivt expressed fluorescens gener i B. subtilis, grön- och röd-fluorescens med 1,5 och 3 sek exponeringstider kan användas, respektive. Dessutom är 10 ms exponeringstid lämplig för synligt ljus.
- Använda förstoringen som möjliggör detektering av hela biofilm kolonin och justera kolonin i mitten av synfältet.
OBS: Som för svärmande och glidande expansioner, att de optimala exponeringstider detektera fluorescenssignaler i de biofilm kolonier beror på expressionsnivån av de fluorescerande proteinkodnings gener. För representativa resultat nedan, var grön- och röd-fluorescens detekteras med hjälp av 1 och 3 sek exponeringsintervaller, respektive. - För tidsförlopp imaging, få bilder vid vissa intervaller med hjälp av konstant exponeringstider.
- Spara fluorescens stereomikroskop inspelade bilder i ett filformat som erkänns av ImageJ programvara för kvantitativ analys av data.
5. Daten analys
- För att analysera det område som upptas av varje annorlunda märkt fluorescerande stam, öppna filen av intresse i ImageJ programvara utökats med en BioVoxxel plugin.
- När ett fönster som heter "Bio-Format importalternativ" visas där endast alternativen "Öppet serien" och "Autoscale" väljs, öppna filen genom att klicka på "OK".
OBS: Filerna visas som en stapel med tre bilder, en för varje kanal som används för att spela in en bild i mikroskop (grön-, röd-fluorescens och ljus-fält bilder). - Separera bunten i individuella kanal bilder genom att välja "Bild" - "buntar" - "stack till bilder" i ImageJ kontrollpanelen.
OBS: Bilderna visas och numreras som 1/3 (grön kanal), 2/3 (röd kanal) och 3/3 (ljusfält). Här är ljusfältsbild exkluderas från analysen.
- När ett fönster som heter "Bio-Format importalternativ" visas där endast alternativen "Öppet serien" och "Autoscale" väljs, öppna filen genom att klicka på "OK".
- För att analysera bilderna förvandla varje del i en 8-bitars bild genom att välja"Bild" - "Typ" - "8-bitars".
- För att bestämma det ockuperade området i pixel 2, återställa omfattningen av bilder med hjälp av "Analysera" - "Set Scale". När ett fönster dyker upp med olika skalalternativ återställa skala genom att välja "Klicka för att ta bort Scale". Markera alternativet "Global" för att ta bort skalan för alla öppna bilder.
- För att ta bort bakgrunden, rita en oval område (regionen av intresse, ROI) utanför det fluorescerande området med hjälp av "oval" verktyg i ImageJ kontrollpanel.
- För att säkerställa att storleken på bakgrunden oval är densamma för alla analyserade bilder, lägga till ROI manager via [t] karaktär av tangentbordet. Ett Manager-fönstret ROI kommer upp där bakgrunden oval ROI kan sparas via "Mer" - "Save" alternativ.
- Om bakgrunden oval ROI syns på bilden, mäta intensiteten av området genom att välja "Analyze" - "Åtgärd".
OBS: En resultatfönster visas där bland annat den genomsnittliga fluorescensintensiteten visas i kolumnen "Mean". - Subtrahera värdet av medelbakgrundsfluorescensintensiteten från bilden genom att välja bort bakgrunden ovala ROI, att klicka på "Process" - "Math" - "subtrahera" och infoga det uppmätta värdet.
- Tillämpar ett tröskelvärde på bilden via "Bild" - "Justera" - "Threshold" alternativet. Välj metod Otsu och svartvitt (B & W). Kontrollera "Mörk bakgrund" och anställa tröskeln genom att klicka på "Apply".
OBS: Bilden ändras till en binär bild där området ovanför tröskelvärdet visas i vitt och att under tröskelvärdet visas i svart. - Välj allt över tröskeln via "Analysera" - "Analysera Partiklar" alternativet. I fönstret med inställningarna håller standardalternativen och hålla "Visa resultat" och "Summarize "alternativ kontrolleras. Klicka på" OK "för att visa sammanfattningen i resultatfönstret och displayen ockuperade området i kolumnen" Total Area ".
Representative Results
Laboratoriesystem för bakteriepopulationer ger en tilltalande metod för att undersöka ekologiska eller evolutionära frågor. Här, tre yta kolonisering sätt B. subtilis användes för att undersöka förekomsten av befolkningen sortiment, dvs. segregering av genetiskt identiska, men fluorescent olika märkta stammar. Svärma, som är en flagellum beroende kollektiv yta rörelse B. subtilis, resulterar i en i hög grad blandad population. I dessa svärmar kolonier, de växthus och röd-fluorescerande bakterier koloniserade områden var överlappande (se Figur 2A). Den snabba yta kolonisering kan följas i tid (Video Figur 1). Under svärmar av B subtilis, ett tunt lager av celler expanderar från inokuleringen centrum efter några timmars inkubation (se Figur 2B).
4752 / 54752fig2.jpg "/>
Figur 2: Svärma expansion av B. . subtilis Den myllrande kolonin innehåller grön- och röd-fluorescerande stammar som blandades 1: 1 före ympning. (A) Efter 15 timmar, växthus och röda fluorescens (GFP och RFP, respektive) detekterades med lämpliga fluorescensfilter. (B) Bilder av tunt skikt av myllrande B. subtilis visas vid valda tidpunkter extraherade från video Figur 1. Skala bar = 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Emellertid, när B. subtilis-stammar, som saknar funktionella flag men har möjlighet att sprida sig med hjälp av producerad exopolysackarid, hydrofobin och surfaktin, sågs på halvfast agarmedium ades olika märkta stammar separeras i vissa defgranskat sektorer (se figur 3A). Utvecklingen av glid kolonin kan spelas in i tid (se figur 3B eller Video Figur 2).
Figur 3: Skjut koloni av B. . subtilis Kolonin innehåller grön- och röd-fluorescerande stammar som blandades 1: 1 före ympning. (A) Efter 24 timmar, växthus och röda fluorescens (GFP och RFP, respektive) detekterades med lämpliga fluorescensfilter. (B) Bilder på B. subtilis glidskivan visas vid valda tidpunkter extraherade från video Figur 2. Skala bar = 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Medan sortiment nivåer av svärmning och sliding expanderande kolonier kunde inte ändras, kan den rumsliga segregation av olika märkta fluorescerande stammar i kolonin biofilm påverkas av start celldensiteter. När en koloni biofilm av B. subtilis inleddes med hög celltäthet av blandade populationer, de växthus och röda fluorescerande stammar visade liten eller ingen fysisk sortiment (se Figur 4). Tvärtom när celldensiteten för att initiera biolfilm var låg, kunde tydliga grön- och röd-fluorescens sektorerna detekteras genom fluorescensmikroskopi. Sortimentet nivån var klart beroende av utspädningsnivån biofilmen initiera befolkningen. Video Figur 3 och 4 presenterar kolonin expansion för den lägsta och högsta utspädningen av de ympade stammarna.
Figur 4: Sortiment nivå i koloni biofilmer B. subtilis vid. diverse initiala celldensiteter Koloni biofilmer av växthus och röda fluorescens stammar visas efter 2 dagar som ympades med olika initiala celldensiteter (från ovan till nedan: icke-utspädda till 10 fem gånger utspädda initiera kulturer, respektive). Skalstreck = 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Förhållandet mellan grön- och röd-fluorescerande stammar kan kvantifieras ytterligare genom användning av ImageJ programvara som gör den kvantitativa karakteriseringen av befolkningsstrukturen och konkurrenskraft av de stammar som användes för experimenten.
Video Figur 1: Time lapse images av svärm B. subtilis inleds med en. 1 blandning av växthus och röda fluorescerande stammar (Högerklicka för att ladda ner.) Videon visar ett tidsförlopp för 10 timmar. Skalstreck = 7 mm.
Video Figur 2: time lapse bilder av skjutbara B. subtilis inleds med en. 1 blandning av växthus och röda fluorescerande stammar (Högerklicka för att ladda ner.) Videon visar ett tidsförlopp för 24 timmar. Skalstreck = 5 mm.
Video Figur 3: Time lapse bilder av B. subtilis koloni biofilmer inletts med 1: 1 blandning av grönt-. Och röd-fluorescerande stammar vid höga celldensiteter (höger klicka för att ladda ner.) Videon visar ett tidsförlopp för 48 timmar. Skalstreck = 5 mm.
Video Bild 4: time lapse bilder av B. subtilis koloni biofilmer inletts med 1: 1 blandning av växthus och röda fluorescerande stammar vid låga celldensiteter. (Rätt klicka för att ladda ner.) Videon visar ett tidsförlopp för 48 timmar. Skalstreck = 5 mm.
Discussion
Tillgängligheten av en fluorescerande verktygslåda för bakterier underlättar inte bara studiet av heterogena genuttryck 30,31 och proteinlokalisering 32, utan även den analys av rumsliga fördelningen av stammar inom en population 8. Fluorescerande markörer med tillräckligt olika excitations- och emissionsvåglängder gör det möjligt att tydligt lokalisera två stammar som annars inte kan skiljas från varandra när de blandas. Det beskrivna protokollet kan användas för att observera populationsdynamik i blandade kulturer, t.ex. konkurrensexperiment eller synergism mellan stammar eller arter. Förmågan att bestämma de relativa förekomsten av fluorescerande stammar i en blandad population är inte begränsad till ytan fäst myllrande, glidande, eller biofilm kolonier, men kan också användas för andra flercelliga biofilmsystem, inklusive nedsänkt, flödescell eller luftmedel gränssnitt Biofilms 27,33-35.
_content "> Medan den presenterade tekniken är ett kraftfullt verktyg för att upptäcka geografiska fördelningen av stammar och utformning konkurrensexperiment, gör det också följande genuttryck heterogenitet i expanderande kolonier. De odlingsbetingelser som beskrivs här gäller för B. subtilis och de exakta parametrar för expansion på agar media kan kräva optimering för andra arter eller stammar 20. Placera proverna i en inkubation kammare medan avbildning tillåter försöksledaren att följa populationsdynamik i tid, även om uppmärksamhet bör ägnas åt fuktnivån i kammaren under inkubation.De tekniker som beskrivs här kräver också genetisk modifiering av de undersökta bakteriestammarna så att stammarna uttrycker fluorescerande markörer som kan särskiljas från varandra. Dessutom, förutom att ha distinkt excitation och emissionsspektra, rekommenderas att de två valda fluorescerande markörer har liknande quantum avkastning (dvs. förhållandet mellan absorberade fotoner som avges) och uttrycks i en jämförbar nivå. Dessutom kan de relativa intensitetsförändringar i tiden mätas och normaliseras till en tidig tid-punkten för ett experiment. Den relativa ökningen eller minskningen kan sedan jämföras mellan olika fluoroforer med olika kvantverkningsgrader. För den presenterade experimentella system har olika grön- och röd-fluorescerande proteiner testas tidigare 36,37 för att välja de mest optimala fluorescerande par som kan detekteras i B. subtilis. Den optimala exponeringstiden bör bestämmas för varje fluorescerande protein och prov. Vissa densiteter cell eller flera lager av celler kan krävas för att detektera signalen effektivt inom befolkningen. Vissa fluorescerande proteiner kan ha låga intensiteter i bakteriecellerna på grund av ineffektiv uttryck och / eller translation av proteinet och därmed låg kvantutbyte. Sådana ineffektiva fluorescerande markörer kunde rHÄRLEDA känsligheten av systemet och förlänga den tid som krävs för att detektera bakteriestammarna eventuellt resulterar i cytotoxicitet av excitationsljuset. De fluorescerande intensiteter kan följaktligen modifieras genom att förändra promotorn används för att uttrycka fluorescerande reporter kodningsgenen. En uttrycksnivå som är för hög kan resultera i onödig överproduktion av det fluorescerande proteinet som leder till skadliga fitness kostnader för bakterien. När man utför konkurrensexperiment, bör en överväga kostnaden av en särskild fluorescerande proteinproduktionen i cellerna. Kontrollexperiment, där de fluorescerande markörerna swappas mellan tävlade stammar eller där två isogena stammar skiljer sig endast i deras fluorescerande markörer tävlade mot varandra, är alltid skyldiga att fastställa någon bias mot en markör. Livslängder av fluorescerande proteiner i cellerna kan också påverka den uppmätta intensitet. Dessutom autofluorescens av vissa bakterie arters kan kräva användningen av olika andra än vad som beskrivs här fluorescerande markörer.
För att exakt bestämma den rumsliga fördelningar och bestånd av de distinkta bakteriestammar bör bakgrundssignalen som härrör från den första fluorescerande proteinet när du använder fluorescensfilter för andra fluorescerande markör och vice versa individuellt testas på monokultur prover (innehållande bakterier som producerar endast en markör ). Detta medger att subtraktion av överlappande fluorescerande signalintensiteterna. Viktigare, eftersom stereomikroskopet registrerar fluorescenssignalen från ovan den expanderande koloni, är den presenterade protokollet bekvämt att bestämma det rumsliga arrangemanget i två dimensioner. Arkitekturen hos den expanderande bakteriepopulation skulle kunna resultera i varierande fluorescensnivåer (dvs. rynkor liknande strukturer kan innehålla fler celler som uppvisar högre lokala fluorescensintensiteter). Därför är den beskrivna analysen av bilderna determines den rumsliga fördelningen, men inte det överflöd av stammarna inom en viss plats. Föregående protokollen beskrev provberedning för svärma 20 eller fluorescens avbildning av populationsdynamik i bakteriekolonier 38, men våra protokoll kombinerar dessa tekniker. Andra mikroskopi tekniker som möjliggör observation av tredimensionella upplösning av befolkningsstrukturen (t.ex. konfokala laserskanning mikroskopi 39,40 eller strukturerad belysning mikroskopi 41) kan användas för prover med högre strukturella komplexitet. Dessa ytterligare tekniker stöder också enstaka cellbaserad detektering av stammar 31 som inte är tillgänglig med hjälp av stereomikroskop.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av bidrag KO4741 / 3-1 från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Vidare var laboratorium Á.TK stöds av ett Marie Skłodowska Curie karriär integrationsbidrag (PheHetBacBiofilm) och ge KO4741 / 2-1 från DFG. TH, AD, RG-M., Och EM stöddes av International Max Planck Research School, Alexander von Humboldt-stiftelsen, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología-tyska tjänsten för akademiskt utbyte (CONACYT-DAAD), och JSMC stipendier, respektive.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
| Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
| Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
| KCl | any | NA | |
| MgSO,4 7H2O | any | NA | |
| Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
| MnCl24H2O | any | NA | |
| FeSO4 | any | NA | |
| D-Glucose | any | NA | |
| Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
| AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
| Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
| Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
| Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
| System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
| Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
| Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
| Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
| Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
| Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114 mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164 mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
| Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10 kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
| Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
| Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
| CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
| Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d = 66 mm |
| Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1,000 mm |
| Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
| Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3 mm x 2,000 mm |
| Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63X |
| High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
| AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
| ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
| ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
| Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
| Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
| Softwares | |||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
| BioVoxxel plugin | BioVoxxel | http://www.biovoxxel.de/development/ |
References
- Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R.
- West, S. A., Griffin, A. S., Gardner, A., Diggle, S. P. Social evolution theory for microorganisms. Nat Rev Microbiol. 4 (8), 597-607 (2006).
- Kovács, ÁT. Impact of spatial distribution on the development of mutualism in microbes. Front Microbiol. 5, 649 (2014).
- Martin, M., Hölscher, T., Dragoš, A., Cooper, V. S., Kovács, ÁT. Laboratory evolution of microbial interactions in bacterial biofilms. J Bacteriol. , (2016).
- Drescher, K., Nadell, C. D., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Solutions to the public goods dilemma in bacterial biofilms. Curr Biol. 24 (1), 50-55 (2014).
- Momeni, B., Waite, A. J., Shou, W. Spatial self-organization favors heterotypic cooperation over cheating. Elife. 2, e00960 (2013).
- van Dyken, J. D., Müller, M. J., Mack, K. M., Desai, M. M. Spatial population expansion promotes the evolution of cooperation in an experimental Prisoner's Dilemma. Curr Biol. 23 (10), 919-923 (2013).
- van Gestel, J., Weissing, F. J., Kuipers, O. P., Kovács, ÁT. Density of founder cells affects spatial pattern formation and cooperation in Bacillus subtilis biofilms. ISME J. 8 (10), 2069-2079 (2014).
- Momeni, B., Brileya, K. A., Fields, M. W., Shou, W. Strong inter-population cooperation leads to partner intermixing in microbial communities. Elife. 2, e00230 (2013).
- Müller, M. J., Neugeboren, B. I., Nelson, D. R., Murray, A. W. Genetic drift opposes mutualism during spatial population expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (3), 1037-1042 (2014).
- Pande, S., et al. Privatization of cooperative benefits stabilizes mutualistic cross-feeding interactions in spatially structured environments. ISME J. 10, 1413-1423 (2016).
- Hallatschek, O., Hersen, P., Ramanathan, S., Nelson, D. R. Genetic drift at expanding frontiers promotes gene segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (50), 19926-19930 (2007).
- Flemming, H. C., Wingender, J.
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 157-168 (2013).
- Lopez, D., Kolter, R. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 34 (2), 134-149 (2010).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 152-163 (2009).
- Mhatre, E., Monterrosa, R. G., Kovács, ÁT. From environmental signals to regulators: Modulation of biofilm development in Gram-positive bacteria. J Basic Microbiol. , (2014).
- Zhang, W., et al. Nutrient depletion in Bacillus subtilis biofilms triggers matrix production. New J Physics. 16, 015028 (2014).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. J Vis Exp. (98), (2015).
- Angelini, T. E., Roper, M., Kolter, R., Weitz, D. A., Brenner, M. P. Bacillus subtilis spreads by surfing on waves of surfactant. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (43), 18109-18113 (2009).
- Grau, R. R., et al. A Duo of Potassium-Responsive Histidine Kinases Govern the Multicellular Destiny of Bacillus subtilis. MBio. 6 (4), e00581 (2015).
- Park, S. Y., Pontes, M. H., Groisman, E. A. Flagella-independent surface motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1850-1855 (2015).
- van Gestel, J., Vlamakis, H., Kolter, R. From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate. PLoS Biol. 13 (4), e1002141 (2015).
- Abee, T., Kovács, ÁT., Kuipers, O. P., van der Veen, S. Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria. Curr Opin Biotechnol. 22 (2), 172-179 (2011).
- Kovács, ÁT. Bacterial differentiation via gradual activation of global regulators. Curr Genet. 62 (1), 125-128 (2016).
- Hölscher, T., et al. Motility, chemotaxis and aerotaxis contribute to competitiveness during bacterial pellicle biofilm development. J Mol Biol. 427 (23), 3695-3708 (2015).
- Seminara, A., et al. Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1116-1121 (2012).
- Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis do not exhibit swarming motility. J Bacteriol. 191 (22), 7129-7133 (2009).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), e3145 (2011).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. (60), (2012).
- Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
- Barken, K. B., et al. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10 (9), 2331-2343 (2008).
- Oliveira, N. M., et al. Biofilm formation as a response to ecological competition. PLoS Biol. 13 (7), e1002191 (2015).
- Wang, X., et al. Probing phenotypic growth in expanding Bacillus subtilis biofilms. Appl Microbiol Biotechnol. 100, 4607-4615 (2016).
- Detert Oude Weme, R. G., et al. Single cell FRET analysis for the identification of optimal FRET-pairs in Bacillus subtilis using a prototype MEM-FLIM system. PLoS One. 10 (4), e0123239 (2015).
- Overkamp, W., et al. Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6481-6490 (2013).
- Stannek, L., Egelkamp, R., Gunka, K., Commichau, F. M. Monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains. J Vis Exp. (83), e51196 (2014).
- Bridier, A., Briandet, R. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).
- Khajotia, S. S., Smart, K. H., Pilula, M., Thompson, D. M. Concurrent quantification of cellular and extracellular components of biofilms. J Vis Exp. (82), e50639 (2013).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
