Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)

Published: December 1, 2016 doi: 10.3791/54774
Automatic Translation
1, 2,3
1Department of Biology, South University of Science and Technology of China, Shenzhen, 2Mechanobiology Institute, Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore

Summary

نقدم بروتوكول لتطبيق التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)، 3-الأبعاد جزيء واحد توطين طريقة سوبر قرار المجهر، لتصوير الهيكل الخلوي الأكتين في خلايا الثدييات ملتصقة. هذا النهج يسمح التصور القائم خفيفة من الميزات الهيكلية النانوية التي من شأنها أن تبقى على خلاف ذلك دون حل نتيجة التقليدي المجهر الضوئي محدودة الحيود.

Abstract

مضان المجهر يمكن رؤية مباشرة من الجزيئات الحيوية محددة داخل الخلايا. ومع ذلك، للفحص المجهري مضان التقليدية، ويقتصر القرار المكانية التي الحيود إلى ~ 200 نانومتر داخل الطائرة صورة و> 500 نانومتر على طول المحور البصري. ونتيجة لذلك، المجهر مضان منذ فترة طويلة محدودة للغاية في مراقبة ملامح التركيبية داخل الخلايا. والتغلب على التطورات الأخيرة في طرق الفحص المجهري سوبر القرار هذا الحد. على وجه الخصوص، وظهور fluorophores photoswitchable تمكن القائم على توطين سوبر قرار المجهري، والتي تنص على حل السلطة يقترب من النطاق طول الجزيئي. هنا، نحن تصف تطبيق سوبر طريقة قرار المجهر ثلاثي الأبعاد على أساس واحد جزيء المجهري التعريب والتداخل متعدد المراحل، ودعا التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM). يوفر هذا الأسلوب قرار موحد الخواص على ما يقرب منترتيب 20 نانومتر في جميع الأبعاد الثلاثة. بروتوكولات لتصور الهيكل الخلوي الأكتين الخيطية، بما في ذلك إعداد العينات وتشغيل أداة iPALM، توصف هنا. هذه البروتوكولات هي أيضا قابلة للتكيف بسهولة ومفيدة لدراسة الخصائص التركيبية الأخرى في الخلايا.

Introduction

كان التصور من الهياكل الخلوية المعقدة منذ فترة طويلة جزءا لا يتجزأ من رؤى البيولوجية والاكتشاف. على الرغم من أن الفحص المجهري مضان يمكن أن خلايا صورة مع خصوصية جزيئية عالية، ويقتصر حل السلطة عن طريق حيود إلى ~ 200 نانومتر في الطائرة صورة (س، ص، أو البعد الأفقي) و> 500 نانومتر على طول المحور البصري (ض، أو البعد المحوري) 1،2. وبالتالي، فإن مراقبة ملامح التركيبية تاريخيا تقتصر على المجهر الإلكتروني (EM). لحسن الحظ، فإن التطورات الأخيرة في القرار المجهر السوبر والتحايل هذا الحد، مما يتيح القرار المكانية في 10 - مجموعة نانومتر 100 1-6. على وجه الخصوص، نهج سوبر قرار بناء على توطين جزيء واحد، والمعروف من قبل المختصرات مثل نخلة (PhotoActivated التعريب المجهري) 4، FPALM (الإسفار PhotoActivated التعريب المجهري) 5 (د) STORM (مباشر الاستوكاستك البصرية التعمير المجهري) 6،7، والطلاء ( بوتراكم كثافة التصوير النانو طبوغرافية) 8، GSDIM (الدولة الأرضي استنفاد المجهر تليها عودة الجزيئية الفردية) 9، أو SMACM (أحادي جزيء نشط تحكم المجهري) 10، وكذلك () تطبيقات على 3 الأبعاد 3D، مثل PALM التداخل (iPALM) 11 أو 3D-STORM 12، كانت قيمة في الكشف عن رؤى جديدة في المنظمة النانو العديد من الهياكل البيولوجية، بما فيها المحاور العصبية والمشابك 13، الالتصاقات البؤرية 14،15، تقاطعات خلية خلية 16، المسام النووية 17 وجسيم مركزي 18-20، على سبيل المثال لا الحصر.

ميزة أخرى التركيبية في الخلايا التي سوبر قرار المجهر مفيد يحتمل أن تكون هي الهيكل الخلوي الأكتين. شبكه معقدة من الخيطية (و) -actin في القشرة خلية يلعب دورا أساسيا في التحكم في شكل الخلوية والخصائص الميكانيكية 21. المنظمة سبنشاط وحيوي ينظم و و الأكتين على الرغم من العديد من البروتينات التنظيمية التي تؤثر بقوة البلمرة، يشابك، والدوران، والاستقرار، وهيكل الشبكة (22). ومع ذلك، على الرغم من أن توصيف العمارة شبكه-و أكتين مهم للرؤى الآلية إلى مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية، وحجم صغير (~ 8 نانومتر) من شعيرات و أكتين يعيق مراقبتهم من قبل التقليدي المجهر الضوئي محدودة الحيود. وبالتالي، فإن التصور من هيكل غرامة الأكتين وحتى الآن تم تنفيذ حصريا من قبل EM. هنا، نحن تصف بروتوكولات لتصور الهيكل الخلوي، و الأكتين في خلايا الثدييات الملتصقة، وذلك باستخدام سوبر قرار تقنية المجهر iPALM للاستفادة من قدرتها دقة عالية جدا في 3D 11،23. على الرغم من أن أداة iPALM متخصصة للغاية، وقد وصفت تعليمات حول إعداد مثل هذا الصك مؤخرا 23، في حين أن الوصول إلى المجهر iPALM استضافته هوكما أحرز جناح معهد هيوز الطبي المتاح للمجتمع البحوث بأقل تكلفة ممكنة. بالإضافة إلى ذلك، أساليب إعداد العينات المذكورة هنا قابلة للتطبيق مباشرة إلى النهج البديلة 3D السوبر القرار، مثل تلك التي تقوم على defocusing اللابؤرية وظيفة انتشار نقطة (قوات الأمن الفلسطينية) 12 أو ثنائية طائرة الكشف عن 24، والتي تتوفر على نطاق أوسع.

ونلاحظ أن عنصر ضروري لقرار المجهر سوبر استنادا توطين جزيء واحد في العام هو fluorophore photoswitchable 25، والذي يسمح الشروط الثلاثة الهامة للأساس توطين جزيء واحد سوبر قرار المجهر الواجب توافرها: أ) ارتفاع واحد جزيء السطوع والتباين بالنسبة إلى الإشارات الخلفية؛ ب) توزيع متفرق من الجزيئات واحدة في إطار صورة معينة. وثالثا) كثافة مكانية عالية من وضع العلامات كافية لالتقاط الملامح العامة للهيكل الأساسي (المعروف أيضا باسم نيكويست شاالمعيار أخذ العينات nnon) 26. وهكذا، للحصول على نتائج مرضية، ينبغي التشديد على قدم المساواة على كل من الإعداد المناسب من العينات لتحسين fluorophore photoswitching والحفاظ على التركيب الدقيق الأساسي، فضلا عن أدوات القياس واكتساب جوانب التجارب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد العينات التصوير

  1. منذ إشارات مضان الخلفية تتداخل مع مضان من العلامات fluorophore، وتنظيف coverglasses قبل الشطف لأول مرة في المياه المتأينة ([ده 2 O) ثم الهواء تجفيفها باستخدام الهواء المضغوط. وفي وقت لاحق، نفذ النقش البلازما في نظافة البلازما لمدة 15 ثانية، أو أطول إذا لزم الأمر.
  2. لتمكين تصحيح الانحراف والمعايرة iPALM، استخدم # 1.5 الجولة (22 مم) coverglasses تنظيفها قبل جزءا لا يتجزأ من النانوية مع الفلورسنت كعلامات الإيمانية، التي تخدم fiducials كما صامد للغاية لمعايرة موثوقة وتصحيح الانحراف. ويرجع ذلك إلى اكتساب الوقت الطويل اللازم لتجميع ما يكفي من كثافة fluorophore (> 15-30 دقيقة)، عينة الانجراف أمر لا مفر منه.
  3. وضع كل ساترة fiducialed إلى 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة. تعقيم لهم من قبل الأشعة فوق البنفسجية (UV) الأشعة في غطاء تدفق الصفحي لمدة 15 دقيقة.
  4. في غطاء تدفق الصفحي العقيمة، وإعداد الليفيحل nectin لطلاء ساترة عن طريق تمييع 1 ملغ / مل حل الأسهم فبرونيكتين في العقيمة Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) إلى التركيز النهائي 2-10 ميكروغرام / مل. شطف كل ساترة ثلاث مرات مع DPBS واحتضان مع 2 مل من محلول فبرونيكتين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. وفي وقت لاحق، نضح من الحل فبرونيكتين وشطف مرة واحدة مع DPBS.
  5. شطف الخلايا لفترة وجيزة مع DPBS. احتضان مع 1-2 مل من التربسين لدقائق قليلة عند 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا وتخمد مع ~ 10 مل من مستنبت الخلية التي تحتوي على مصل جديد. على سبيل المثال، للخلايا البشرية السري الوريد البطانية (HUVEC)، واستخدام واسع مستنبت البطانية سفينة تستكمل مع عوامل البطانية سفينة كبيرة والبنسلين أو الستربتومايسين.
    1. Replate الخلايا على ساترة المغلفة فبرونيكتين (لكثافة متفرق، لوحة <50000 خلية لكل ساترة) والحفاظ على الثقافة في حاضنة وضعت في 95٪ الرطوبة، 5٪ CO 2، و 37 & #176؛ ج.
  6. للحفاظ السليم للالهياكل الدقيقة من الهيكل الخلوي، و الأكتين، واستخدام المحاليل بناء على الكواشف عازلة جيد البالغ عددهم 27.
    1. على سبيل المثال، وإعداد عازلة PHEM كحل 2X الأوراق المالية (120 أنابيب مم، 50 مم HEPES 20 ملي EGTA، 4 مم MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.0 مع KOH) عن طريق إذابة 6.5 غرام من HEPES، 3.8 غرام من EGTA، و 190 ملغ من MgCl 2 في ~ 300 مل من ده 2 O، مع تعديل درجة الحموضة إلى 7.0 بإضافة قطرة قطرة من محلول KOH المركزة. ثم، إضافة ده 2 O لتبرزي حجم 500 مل. تعقيم المنطقة العازلة باستخدام فلتر 0.22 ميكرون، واحفظها في 4 درجات مئوية، وتمييع 1: 1 مع ده 2 O قبل الاستخدام.
  7. للحصول على أفضل النتائج مع وضع العلامات كثافة عالية من F-الأكتين، واستخدام phalloidin مترافق مع fluorophores العضوية، مثل فلور اليكسا 647. عند نقطة زمنية محددة بعد replating الخلية، وإصلاح الخلايا على النحو التالي:
    1. نضح في وسائل الإعلام من كل الثقافة التي تحتوي على جيدا معينة ليرة لبنانية. بلطف ولكن سرعان ما الاستغناء 2 مل من الحارة (37 درجة مئوية) مثبتات استخراج تحتوي على 0.25٪ غلوتارالدهيد في المخزن PHEM مع 0.25٪ تريتون X-100. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة. لخطوات لاحقة، استخدام 2 مل من تثبيتي أو التبريد عازلة في ساترة، ما لم ينص على خلاف ذلك.
    2. استبدال تثبيتي استخراج مع تثبيتي غلوتارالدهيد 2.5٪ في المخزن PHEM والسماح للعينات احتضان لمدة 10-12 دقيقة. وتجرى هذه والخطوات التالية كل في درجة حرارة الغرفة.
    3. نضح من المثبتات وبلطف استبدالها عازلة PHEM. الإمالة ودوامة بلطف، ثم يغسل مرة أخرى مع PHEM. كرر مرتين.
    4. لإرواء تألق ذاتي من غلوتارالدهيد، والتي يمكن أن تطغى على إشارات من fluorophores المطلوب، واحتضان العينات مع العازلة تبريد الطازجة التي تحتوي على NaBH 4 في تركيز كتلة من 0.1٪ في PHEM. وسيراعى في فقاعات وافر. في بعض الأحيان الاستفادة من طبق عينة بلطف إلى dislodge الفقاعات. السماح لها احتضان لمدة 5-10 دقائق.
    5. نضح من المخزن المؤقت التبريد وبلطف استبدالها عازلة PHEM. شطف عدة مرات لازالة الفقاعات. ماصة في 2 مل من PHEM العازلة والسماح لها احتضان في الظلام لمدة 5 دقائق. كرر مرتين وترك بقية العينة في المخزن PHEM عند الانتهاء.
    6. إعداد غرفة الرطوبة لphalloidin حضانة باستخدام بلاستيكية كبيرة مبطن طبق بيتري مع قطعة من منشفة ورقية مبللة بسخاء مع 5-10 مل من ده 2 O. وضع ورقة كبيرة من بارافيلم نظيفة على رأس منشفة ورقية مبللة.
    7. ويرجع ذلك إلى ارتفاع تكلفة نسبيا من phalloidin المسمى، استخدام كمية صغيرة لكل وضع العلامات. لارتفاع كثافة وضع العلامات، وتبدأ مع تركيز 0.3 ميكرومتر. إعداد ~ 60 ميكرولتر في ساترة باستخدام phalloidin-فلور اليكسا 647 في المخزن PHEM.
    8. ماصة 55-60 ميكرولتر من محلول phalloidin على ورقة بارافيلم في غرفة الرطوبة. باستخدام ملقط غرامة، وإزالة بلطف coverg عينةمعشوقة. كن حذرا أن نلاحظ الوجه التي تحتوي على الخلايا الصحيحة.
    9. بسرعة وبلطف استفادة بعيدا عازلة الزائد عن طريق لمس حافة ساترة مع قطعة مطوية من الورق ماصة دقيقة، وبعد ذلك وضع الجانب الخلية ساترة لأسفل على قطرة من حل phalloidin على بارافيلم. تأكد من عدم وجود فقاعات المحاصرين من قبل ساترة.
    10. وضع غطاء على الرطوبة. التفاف غرفة في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء المحيط، والسماح للعينة احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. يمكن أن تظل العينة في هذه الحالة لعدة أيام. تأكد من أن الغرفة الرطوبة تبقى رطبة إذا تم التخطيط التخزين الطويل.
  8. قبل التصوير، ضع بلطف الجانب الخلية ساترة حتى على لوحة 6 جيدا جديدة تحتوي على 2 مل من العازلة PHEM لكل بئر.
  9. إعداد مخازن التصوير القائم على ثيول-بكسح الأكسجين باستخدام حلول الأوراق المالية التالية: 1 M جلوكوز، 1 م cysteamine، و100X الجلوكوز أوكسيديز / الكاتالاز MIXT انزيملدى عودتهم (4 ملغ من الكاتلاز و 10 ملغ من أوكسيديز الجلوكوز في 100 ميكرولتر من العازلة PHEM، ويخلط جيدا قبل vortexing) 28. الحق قبل التصوير، وخلط 75 ميكرولتر من 1 M حل الجلوكوز، 30 ميكرولتر من محلول 1 M cysteamine، و 3 ميكرولتر من 100X الأسهم انزيم الخليط. ضبط مستوى الصوت إلى 300 ميكرولتر مع العازلة PHEM واستخدامها على الفور بعد خلط لتركيب العينة.
  10. لiPALM، وإعداد نموذج التصوير باستخدام تنظيفها قبل # 1.5 ساترة (22 مم).
    1. بدلا من ذلك، استخدم شريحة زجاجية (3 "س 1") مع الوجهين هل لاصقة للمساعدة في التجمع إذا القائم الاستجماتيزم 3D-STORM 12 لاستخدامه بدلا من ذلك.
    2. لتجميع عينة التصوير، واستخدام ملقط غرامة لإزالة بلطف ساترة عينة من المخزن المؤقت جيدا. ثم، بسرعة وبلطف استفادة بعيدا عازلة الزائد عن طريق لمس حافة ساترة مع ورقة ماصة مطوية.
    3. وضع الجانب الخلية ساترة مواجهة على قطعة من الورق عدسة نظيفة. شطف العينةعن طريق وضع 30 - 50 ميكرولتر من العازلة التصوير على العينة، وإزالة عازلة الزائد عن طريق إمالة والتنصت مع ورقة ماصة مطوية.
    4. كرر الخطوة الشطف عدة مرات، ثم وضع 30 - 50 ميكرولتر من العازلة التصوير على العينة. وصمة عار تجف حافة ساترة ووضع عدة نقاط صغيرة جدا من الايبوكسي علاج سريع إلى منطقة المجففة.
    5. انخفاض ببطء آخر تنظيفها قبل # 1.5 ساترة (عادي، جولة ساترة، 18 مم) على المركز ال 22 ملم ساترة التي تحتوي على الخلية. السماح المخزن المؤقت التصوير الرطب على حد سواء coverglasses بفعل الخاصية الشعرية. يجب على نقاط صغيرة من الايبوكسي علاج سريع الالتزام بكل coverglasses.
    6. اضغط بلطف على عينة تجميعها باستخدام ورقة ماصة مطوية لنشر الضغط بالتساوي. استخدام ما يكفي من الضغط لجعل عينة الخلايا رقيقة وحتى (<15 ميكرون)، ولكن ليس بقدر ما هو لسحق الخلايا. قياس سمك السليم من خلال مراقبة نمط حلقات لنيوتن. أيضا، تأكد من تنفيذ هذا الواحدالجيش الشعبي بلطف للحد من فقاعات الهواء. إذا لزم الأمر، وممارسة مع coverglasses فارغة عدة مرات مسبقا.
  11. ختم العينة مع ذاب الفازلين، اللانولين، البارافين (VALAP، والأوراق المالية أعدت من 100 غراما لكل من الفازلين، اللانولين، والبارافين، ذاب معا) 29، وشطف عينة مختومة مع ده 2 O، وضربة الجافة مع الهواء المضغوط. العينة هي الآن جاهزة للتركيب على المجهر للتصوير.

2. التنسيب عينة وiPALM محاذاة

  1. نقل أعلى عدسة الهدف بنابض أعلى للسماح لإزالة من صاحب العينة. ضع عينة مختومة أعدت في الخطوة 1.10 على صاحب العينة وآمنة مع عدة مغناطيس الأرضية النادرة الصغيرة. تطبيق زيت الغمر على كلا الجانبين من عينة التصوير. وضع صاحب العينة مرة أخرى في مسار بصري وخفض بلطف أعلى عدسة الهدف.
  2. بدوره على الليزر الإثارة. بدوره على جهاز إلى جانب المسؤول عن الإلكترون ضرب (EMCCD) الكاميرا في وضع الإطار نقل.
    1. تدوير في المرشحات الانبعاثات المناسبة. تنشيط مفتاح ميكانيكي لمنع شعاع مسار الأعلى (الشكل 1A) وفتح مسار الشعاع السفلي. جلب عدسة موضوعية أسفل إلى تركيز الترجمة في زيادات صغيرة باستخدام المحرك بيزو.
    2. وبمجرد أن الإيماني هو في التركيز، وفتح مسار الشعاع كبار في حين وقف مسار الشعاع القاع، وتحقيق أعلى عدسة الهدف إلى التركيز بطريقة مماثلة. مراقبة عرض الإيمانية التي تظهر على شاشة الكمبيوتر لتركيز الأمثل.
  3. لحدانية التركيز السليم، وفتح كل من أعلى ومسارات شعاع القاع. ضبط يدويا أعلى عدسة الهدف في حين يتم الاحتفاظ الهدف السفلي ثابت وذلك باستخدام زوج من مجموعة مسامير الصغيرة على ما يرام، حتى تتداخل الصور الإيمانية بأكبر قدر ممكن، من الناحية المثالية في بكسل واحد.
    1. وفي وقت لاحق، نفذ تعديلات دقيقة بحيث الصور الإيمانية في الخطوة 2.3 التداخل ضمن عشر من بكسل EMCCD. ضبط أعلى2-محور المرايا محمولة بيزو عبر برنامج حاسوبي لمراقبة بينما تحتجز كل من العدسات موضوعية وانعكاس أسفل المرايا المستمر. مقارنة مراكز fiducials من أعلى وأسفل آراء موضوعية عبر شاشة الكمبيوتر لتوجيه العملية.

3. معايرة الإعداد iPALM

ملاحظة: نظرا لأن انبعاث مضان هو غير متماسكة، لتدخل الواجب مراعاتها في iPALM، المسار أطوال من خلال الجزء العلوي ويجب أن تكون الأهداف السفلية قريبة من بعضها البعض، في غضون بضعة ميكرونات. ويمكن تحقيق ذلك على النحو التالي:

  1. مع أشعة الليزر على والكاميرات تدفق مستمر، وكلا من أعلى وأسفل مسارات شعاع مفتوحة، التأرجح صاحب العينة ض بيزو باستخدام الموجي الجهد الجيبية التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج حاسوبي لمراقبة لاستمرار التذبذب ض محور على قوته 400 نانومتر .
  2. الاستفادة من حقيقة أنه، عند الخروج من المواءمة المثلى، وشدة الإيمانية تختلف قليلا مع تيكان التذبذب، يدويا ترجمة الآلية جمعية شعاع الخائن لأعلى أو لأسفل حتى شدة يتذبذب الإيمانية بسبب تأثير التدخل فوتون واحد المطلوب. هذا يدل على المماثلة بين أطوال مسار البصرية. وهناك نسبة من> 10 الذروة إلى الوادي لا يمكن أن يتحقق في الحالات المثلى (1D الشكل).
  3. للتأكد من أن كل من السعة والطور في كل السطحية متجانسة بقدر الإمكان عبر الميدان، وضبط المرآة السفلية للجمعية شعاع الخائن في خطوات صغيرة لضبط الفجوة وزوايا الميل. أداء شعاع الخائن محاذاة غرامة بترجمة العينة في 8 نانومتر ض الخطوات أكثر من 800 نانومتر.
    1. مراقبة كثافة الإيمانية بين الكاميرات # 1 - 3. ضبط الارتفاع، والموقف، والميل للمرآة أسفل داخل الجمعية شعاع الخائن في خطوات صغيرة، مثل أن المرحلة التذبذب الكاميرا رقم 1 بالنسبة للكاميرا تكبير # 2، من الناحية المثالية في 120 ° (الشكل 1B-D).
    2. مرة الأوليمحاذاة كاملة، ترجمة العينة إلى مسح لحقل مناسبة للعرض الذي يحتوي على كل الخلايا لصورة وfiducials متعددة في مكان قريب. وضع سياج حول نظام لمنع الضوء الشارد والاضطرابات المحيطة. حالما يتم العثور على منطقة التصوير، وتنفيذ الإجراء في الخطوة 3.4 ثانية، وتسجيل منحنى المعايرة لاستخدامها في عمليات الاستخراج زي تنسيق اللاحقة باستخدام الأمر "الحصول معايرة المسح مقابل عينة بيزو الوظيفة" في الواجهة الرئيسية.

4. الحصول على البيانات

  1. مرة واحدة تم العثور على المنطقة المرغوبة ويتم الحصول على منحنى المعايرة، أدخل أسماء الملفات المناسبة في البرنامج. فتح كل من أعلى ومسارات شعاع القاع. زيادة قوة الإثارة ليزر 642 نانومتر إلى الحد الأقصى. لفلور اليكسا 647، قد تكون هناك حاجة لفترة أولية مدتها fluorophore إطفاء (الشكل 2A).
    1. فضح مع المستمرة لإثارة 642 نانومتر لمدة 5 دقائق، أو أكثر إذا لزم الأمر، حتى الاشتراكيةلوحظ جزيء ngle وامض (الشكل 2B). البرنامج يتيح زيادة تلقائية من 405 نانومتر تنشيط الصورة أثناء عملية الاستحواذ. وتتطلب أعدادا كبيرة من إطارات اكتساب عادة لميزات الخيطية لتكون مرئية بشكل واضح (> 50،000 الإطارات). عندما تصبح جاهزة، تبدأ اقتناء مجموعات الصور الخام باستخدام الأمر "بدء iPALM اكتساب" في الواجهة الرئيسية.
  2. خلال عملية الاستحواذ، ضبط مستوى تنشيط ضوئي عن طريق ضبط شدة الليزر 405 نانومتر للحفاظ على كثافة الوميض المناسبة حسب الحاجة (انظر الأمثلة في الشكل 2B).
    ملاحظة: بمجرد الانتهاء من عملية الاستحواذ، يقوم البرنامج بتحويل ملفات الصور تلقائيا في شكل ثنائي السليم. هي التي شنت مستودع البيانات في الخادم حساب بمثابة محرك أقراص شبكة الاتصال، مما يسمح البيانات المراد نسخها مباشرة هناك لمزيد من المعالجة.

5. معالجة البياناتوتحليل

  1. لتحليل توطين باستخدام البرمجيات المتقدمة المخصصة لاستخراج المعلمات الأكثر ملائمة لجميع الجزيئات واحدة وكذلك لfiducials 11،15،23. هذا لن يحقق س، ص تنسيق، ولكن أيضا الشدة التي تستخدم لتحليل منحنى المعايرة.
    1. استيراد بيانات المعايرة الخام المكتسبة في الخطوة 3.5 باستخدام الأمر "استخراج قمم تسميات متعددة" ضمن القائمة "ملف" لتنفيذ توطين جزيء واحد. وبعد تحليل توطين الأولي، الإحداثيات التي تم الحصول عليها من الكاميرات # 1-3 موجودة في قنوات الأحمر والأخضر، والأزرق، على التوالي، ويمكن حفظها لمزيد من التحليل باستخدام الأمر "حفظ معالجتها على النحو المختبر الدولي للألماس (.sav)" تحت عنوان " ملف "القائمة.
  2. لجلب البيانات من الكاميرات # 1-3 في التسجيل باستخدام fiducials الفلورسنت المدمجة على لل coverslips، تحديد العديد من fiducials مشرق لتوفير التغطية للصورة المركزية (على سبيل المثال،الشكل 1B) باستخدام الأمر "مرساة إيمانية نقاط" ضمن القائمة "التحولات صورة". استخدام مجموعات ثلاثية من توطين ينسق من الكاميرات # 1-3 تم الحصول عليها من fiducials مشرقة في الخطوة 5.1 لحساب التناوب ورفع مصفوفة من شأنها أن تجلب الكاميرات رقم 1 ورقم 3 في السجل مع كاميرا # 2. مع عدد كبير بما فيه الكفاية من fiducials، العليا تزييفها متعدد الحدود لا يمكن أن يؤديها لنوبات أفضل.
  3. مرة واحدة يتم حساب مصفوفة التحويل، تحويل البيانات الخام من كاميرات # 1-3 معا للحصول على البيانات الخام لخص. أداء جولة أخرى من تحليل توطين لانتاج س أكثر دقة، ص تنسيق وتحديد المساهمة النسبية لكل قناة الكاميرا إلى البيانات الخام لخص. استخدام الأمر "تحويل الخام، وحفظ وحفظ مبلغ (دات)" ضمن القائمة "التحولات صورة". هذه نسبة كثافة يحتوي على معلومات زي تنسيق.
  4. حدد إيمانية مشرق وأداء Z-معايرة المناسب باستخدام وظيفة "اختبار الرياح نقطة 3D" في مربع الحوار المنبثقة بالنقر على "عمليات Z-تنسيق" ضمن القائمة "المهام الخاصة". هذا وسوف تتناسب مع وظائف 3 جيبية لشدة القنوات كاميرا 3 لتحديد منحنى المعايرة. ثم يتم حفظ ملف معايرة لاستخدامها مرة أخرى على مجموعات البيانات الرئيسية.
  5. لاختبار نوعية منحنى المعايرة، نفذ ض تنسيق الاستخراج، كما هو موضح سابقا 23. لfiducials حسن تصرف في نظام معايرة بشكل جيد، يجب توسيع نطاق ض تنسيق خطيا، منذ تتخذ مجموعات البيانات المعايرة مع حملة الخطي في زي الموقف. وعلاوة على ذلك، ينبغي للض مواقف جميع fiducials تحجيم مع انحدار مماثل.
  6. مرة واحدة يتم الحصول على معايرة مرضية، نفذ الترجمة والتحليل تحول لمجموعات البيانات صورة الخام المكتسبة في الخطوة 4 التالية نفس الإجراء الموضحة في الخطوات 5،1-5،3. عند الانتهاء، تحميل ملف معايرة من الخطوة 5.4 وأداء ض تنسيق عملية الاستخلاص باستخدام وظائف "اختيار WND ملف" و "استخراج Z تنسيق" في مربع الحوار المنبثقة بالنقر على "عمليات Z-تنسيق" ضمن القائمة "المهام الخاصة".
    ملاحظة: منذ وقت الاستحواذ> 15 دقيقة، والانحراف الميكانيكي هو متوقع.
  7. لإجراء تصحيح الانحراف في س، ص، حدد إيمانية مشرقة من الإحداثيات التعريب. وينبغي أن يكون هذا الإيمانية موجودة في جميع الأطر. ثم، استخدم x و y-تنسيق الانجراف الإيمانية للتنسيق بين جميع الإحداثيات الأخرى ضمن نفس الإطار العودة إلى تسجيل (الشكل 3A-B) باستخدام وظيفة "اختبار / كتابة دليل ستار" ضمن القائمة "التحولات صورة". تسجيل Z تنسيق لا يمكن أن يؤديها كذلك عن طريق الوصول إلى "اختبار دليل ستار" و "كتابة دليل ستار" وظائف في حوار منبثق بالنقر على "عمليات Z-تنسيق" ضمن القائمة "المهام الخاصة".
  8. كما العينة قد يحمل ميل طفيف، نفذ تصحيح الميل من خلال توفير س، ص، ض إحداثيات 3 نقاط مرجعية تحديد الطائرة التي يجب أن يتم تعيين مستوى باستخدام وظيفة "إزالة XYZ الميل" في مربع الحوار المنبثقة عن طريق النقر " عمليات Z-تنسيق "تحت عنوان" القائمة المهام الخاصة ".
  9. لاحقا إلى الانجراف والميل التصحيحات حفظ إحداثيات التعريب. إعادة بناء صورة قرار سوبر لمزيد من التحليل (الشكل 4A-D) باستخدام الأمر "تقدم" على الواجهة الرئيسية. اللون يمكن استخدامها للإشارة إلى ض تنسيق. بدلا من ذلك، عرض الجانب من المنطقة المحددة ويمكن أيضا أن يصدر. إحداثيات التعريب يمكن تصديرها كملفات نصية لمزيد من التحديد الكمي، أو يمكن حفظ صورة بناءها على النحو ملف .tif.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

متطلبات حاسمة لiPALM هي محاذاة، والتسجيل، ومعايرة النظم البصرية. هذه هي اللازمة لضمان التدخل السليم داخل 3 في اتجاه شعاع الخائن شرطا لض تنسيق الاستخراج. لتمكين المراقبة المستمرة، ومصادر نقطة ثابتة من مضان ضرورية. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الفلورسنت الاتحاد الافريقي أو النانوية ثنائية المعدنية 23 التي تنشأ من محلية الرنين مأكل السطح (LSPR) معان ضوئي. كما أنها بمثابة ثنائي القطب واحد مستقر على الإضاءة ويمكن عادة أن تكون مترجمة مع 5 - دقة 10 نانومتر. هذه الجسيمات النانوية المتاحة تجاريا تنبعث من مستوى السطوع ضمن نطاق معظم fluorophores جزيء واحد، مثل أن كلا من fluorophores وfiducials يمكن تصوير مع شدة الإثارة وإعدادات مكاسب مماثلة على الكاميرات EMCCD، دون التشبع (الشكل 1B). وعلاوة على ذلك، فإن هذه fiducials أيضا القوات المسلحة الكونغولية إلى حد كبيرilitate التركيز، حيث يمكن رصد وعرض واضح للfiducials خلال تعديل التركيز. أيضا، تنظيف صرامة من سطح ساترة، مثل سمكة البيرانا الحفر أو التنظيف البلازما، ومطلوب أيضا، منذ مضان الخلفية زائفة من coverglasses تنظيفها أو تنظيفها بشكل سيئ يمكن بسهولة تطغى إشارات جزيء واحد، كما هو موضح سابقا.

تعتمد iPALM على التداخل متعدد المراحل لتمكين عالية الدقة ض تنسيق القياس في وقت واحد مع النخيل (لس، ص). في الصك iPALM، كل فوتون مضان المنبعثة يمكن اعتبار أن نشر من خلال كل المسارات البصرية، والتي ثم تدخل الذات في 3 في اتجاه شعاع الخائن و أقيمت مخصصة. وهكذا ترميز ض تنسيق في مرحلة الفوتون تدخل. الخلافات المرحلة المتبادلة من ~ 120 درجة من الحزم الإخراج من 3 في اتجاه ونتيجة شعاع الخائن في تباين كثافة الصور جزيء واحد بين CAMER 3كما يسمح ض - تنسيق الاستخراج من منحنى المعايرة. وبناء على ذلك، فإن iPALM صاحب العينة التجمع عنصرا أساسيا، حيث أنها مزودة زوج من المحركات كهرضغطية التي تتيح الترجمة نانومتر الدقة في ض التي يمكن أن تستخدم لمحاذاة والمعايرة.

في الخشوع والمحاذاة، والترجمة من العينة على طول محور ض توليد تأثير التداخل. ويتجلى هذا الأمر التذبذب من شدة الإيمانية بين القنوات كاميرا الثلاثة (الشكل 1C-D). تشير هذه التذبذبات أيضا أن كل من أعلى وأسفل مسارات شعاع البصرية تتم مطابقة تقريبا، مما يتيح التدخل فوتون واحد. عادة، عند تشغيل الجهاز، المراحل الأولى من كل كاميرا لن يكون الأمثل، وهناك حاجة لفحص ض موقف كأداة تشخيصية للمعايرة والمحاذاة. للوصول إلى مراحل أفضل، المرآة السفلى من الحزمة الخائن(الشكل 1A) يمكن تعديلها باستخدام مرحلة طرف إمالة كهرضغطية. يؤخذ الفحص معايرة ض الموقف بعد كل صغيرة 10-20 تعديل نانومتر. ثم يتم تحديد شدة الإيمانية في كل قناة عن طريق تحليل التعريب (أي المناسب مع وظيفة-2D جاوس). كثافة تطبيع من قبل مجموع كثافة يمكن أن يقترب من قبل الموجي الجيبية، والسماح لتحسب على المدى المرحلة. وبالتالي، فإن مرحلة المقابلة لكل كاميرا يمكن تحديد، كما رأينا في الشكل 1C. ونلاحظ أن مبدأ التدخل فوتون واحد المستخدمة في iPALM يمكن أيضا أن يكون أظهر باستخدام أبسط من ذلك بكثير 2-الطريقة شعاع الخائن. ومع ذلك، فإن 2 في اتجاه شعاع الخائن هو غير عملي ل3D سوبر قرار المجهر منذ عند أو بالقرب من الحد من التدخل الهدام، والإشارة في قناة واحدة هي الحد الأدنى، مما أدى إلى تقديرات صاخبة الإحداثيات كثافة والتعريب، التي تحد بشكل فعال، تنسيق ض تقرير لرنه حيث يكون كل من الكاميرات كبير كثافة (<100 نانومتر). الحد الأدنى لعدد من القنوات اللازمة للتغلب على هذا التأثير هو ثلاثة، ولقد وصفت 3- و 4 في اتجاه وإسقاط الأنظمة في الأدب 11،30.

تحت الظروف المثلى، ل3 في اتجاه شعاع الخائن، وينبغي أن تكون الاختلافات المرحلة بين 3 كاميرات حوالي 120 درجة. شعاع الخائن 3-طريقة لiPALM يحتوي على 3 واجهات عاكسة، كما تخطيطي في الشكل 1A. يتم وضع الخائن شعاع فوق مرآة استقطاب مسطحة، مع وجود فجوة رقيقة مليئة بالنفط مطابقة معامل الانكسار، للسماح ضبط دقيق لمسار أطوال ضمن الحزمة الخائن وتحقيق الخلافات المرحلة المثلى. كما هو مبين في الشكل 1C-D، في المحاذاة الصحيحة للiPALM، الكاميرات قريبة إلى 120 درجة مرحلة المتبادلة الفرق. في الممارسة العملية، أي بفارق مرحلة أكبر من 105 درجة غير مقبولة عموما. هذه معايرة كل من دائرة الهجرة والجنسيةicates أن النظام متماشية بشكل جيد، وأنه سيتم استخدامها لاحقا استخراج زي تنسيق. ومن المفيد أيضا لتقييم منحنى المعايرة تم إنشاؤها باستخدام fiducials مختلفة. معظم fiducials مع سطوع معتدل ينبعث بصفة عامة ثنائي القطب واحد، مما أسفر عن منحنيات المعايرة حسن تصرف. ومع ذلك، وحدات من حين لآخر fiducials (غالبا تلك مع سطوع المدقع) قد تتصرف بطريقة شاذة، مما أسفر عن منحنيات المعايرة يمكن الاعتماد عليها. ومن المستحسن أيضا لاختيار fiducials بالقرب من وسط الميدان التصوير وبالقرب من منطقة ذات أهمية بيولوجية (الشكل 1B)، لاسيما وأن عالية NA عدسة الأهداف المستخدمة في إعداد iPALM ليست حقل مسطحة تصحيحها. يقتصر مجال الرؤية فعالة إلى المنطقة المركزية، وعلى ما يبدو من الاعراض الإيمانية أكبر نحو حافة الحقل.

وبعد لمحاذاة الأولية، وعرض حقول المحتوية على الخلايا مع مو مرغوب فيهويتم اختيار rphology وfiducials متعددة لضمان معايرة جيدة للتصوير. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق ترجمة ببطء صاحب العينة باستخدام محركات سيرفو 2-المحور. وترجمة للعينة يؤدي في بعض defocusing، منذ العينة ليست دائما مسطحة تماما. لذلك، يجب أن يتم ضبط التركيز باستمرار أثناء الترجمة. مرة واحدة وقد تم اختيار مجال التصوير، وجولة أخرى من المعايرة لتحسين ثم يتم منحنى المعايرة إلى صقل مواءمة النظام والحصول على منحنى المعايرة الفعلي. الأهم من ذلك، ينبغي تجنب المناطق الخاضعة لنواة أو المناطق القريبة مع مؤشر الانكسار غير متجانسة (على سبيل المثال، فقاعات الهواء) بشكل عام، لأن هذه سوف تسبب تغييرا كبيرا في مسار نسبي أطوال، تشويه ض تنسيق.

مع وضع العلامات العالية الكثافة، وإشارات مضان من fluorophores العضوية مثل اليكسا فلور 647 يمكن أن يكون مشرقا للغاية. كما هو مبين طن الشكل 2A، مع إعداد العازلة المناسبة التي تحتوي على تركيز عال من ثيول (-SH) مجموعة 31، وfluorophore يجب أن تنتقل بسرعة من تحت عالية الإضاءة الإثارة. وهذا يؤدي إلى قمع إشارات مضان من غالبية الجزيئات. في لحظة معينة، أقلية صغيرة جدا من fluorophores عودة عشوائيا إلى "على" الدولة. ويتوقع لهذه لتوزيعها قليلة وبالتالي يمكن تصور مثل الجزيئات واحدة واحدة أو عدد قليل من الإطارات قبل التبديل "قبالة". ديناميات photoswitching تعتمد بقوة على شدة الإثارة وتركيز -SH، وبالتالي، لنظام معين، ويجب الحرص على تحسين كثافة وضع العلامات المناسبة، ولا سيما منذ شدة الإثارة عالية نسبيا (640-647 نانومتر) و هناك حاجة لإيقاف غالبية اليكسا فلور 647 الجزيئات. إذا كانت الإثارة ليست قوية بما فيه الكفاية، جزءا كبيرا من أليكس فلور 647 الإرادةالبقاء في "على" الدولة، مما أدى إلى خلفية عالية، صعوبة مراقبة مضان جزيء واحد، وفي نهاية المطاف، وسوء نوعية جزيء واحد النتائج التعريب. في ظل حالة متوازنة بشكل صحيح، يجب أن تحتوي على البيانات الخام جزيء واحد عدد كبير بما فيه الكفاية من الجزيئات (مئات) في إطار (الشكل 2B)، في حين أن كل جزيء متناثر بما يكفي للسماح الكشف لا لبس فيه وتحليل التعريب. ومن الجدير بالذكر أيضا أن لiPALM، ومبادئ photoswitching هي مماثلة لتلك النخلة أو STORM، وبالتالي، والعينات التي أعدت بشكل صحيح لiPALM يمكن استخدامها مباشرة على أنظمة 3D النخيل أو 3D-STORM أبسط. للحصول على كثافة عالية بما فيه الكفاية من الجزيئات لتلبية نيكويست أخذ العينات، وعادة ما يطلب من 50،000 أو أكثر من لقطة من البيانات الخام (أي 150،000 مجموع إطارات لل3 كاميرات). كما تقدم الاستحواذ، وهو جزء متزايد من fluorophores يمكن المنضب من قبل photobleaching من المدمرة، مما أدى إلى الصاريسر كثافة جزيء واحد. للتعويض عن هذا، والبقول وجيزة من 405 نانومتر الضوء الأزرق (405 نانومتر) يمكن أن تكون مضيئة على العينة على فترات لتعزيز تفعيل fluorophore.

ويرجع ذلك إلى اكتساب الوقت الطويل اللازم، أفضل النتائج لiPALM (أو جزيء واحد توطين المجهر بشكل عام) تتطلب انخفاض عينة الانجراف و / أو تصحيح الانحراف جيد. على سبيل المثال، وذلك باستخدام وقت التعرض لل 50 مللي ثانية في واسطة نقل الإطار (20 هرتز معدل الإطار)، واكتساب الوقت الكلي للإطارات 50،000 42 دقيقة. خلال هذه الفترة، ومن المتوقع الانجراف الميكانيكي على مدى عشرات نانومتر. في الواقع، بالإضافة إلى دقة عالية التعريب وعالية الكثافة وضع العلامات، ويعتمد القرار أيضا على نوعية تصحيح الانحراف. هناك أصول متعددة لهذه الانجرافات مع التقلبات الحرارية كونه سببا رئيسيا. ونتيجة لهذا الاعتبار، حيثما كان ذلك ممكنا وقطع iPALM هي العادة تشكيله باستخدام INVAR، وانخفاض سبائك التمدد الحراري، أو الفولاذ المقاوم للصدأ،وكلاهما له أقل من ذلك بكثير خصائص التمدد الحراري من النحاس أو الألومنيوم. للأسف، وهذا يفرض أيضا تكاليف إضافية بالنسبة إلى الألومنيوم، وهو المعدن الذي يستخدم أكثر شيوعا لمكونات الميكانيكية، كونها أرخص بكثير وأسهل للآلة. مصادر أخرى من الانجراف يمكن أن يكون الاهتزازات الميكانيكية من المعدات الطرفية والبيئات المحيطة، أو تيارات الهواء. يجب أن يكون الحد الأدنى هذه عن طريق وضع نظام في الضميمة المناسبة وإعادة توجيه اتجاه تدفق الهواء في منطقة المجهر. يجب أن يبنى الإعداد على طاولة البصري البحوث الصف، وإذا كان ينبغي أن توضع الممكنة، والمكونات التي تحتوي على مروحة من على الطاولة البصرية. ومع ذلك، على الرغم من كل الاحتياطات، وبعض كمية من الانجراف لا تزال قائمة. الأهم من ذلك، يجب أن يكون الحد الأدنى هذه الانجرافات هذه الصورة التي لا تزال في التركيز طوال الوقت الاستحواذ. في أنظمتنا، وهذه الأساليب السلبية يكفي للحد من الانجراف إلى مستويات مقبولة. ومع ذلك، ينبغي أن يكون من الممكن تنفيذ الفعال كوم الانجرافطرق pensation لتمكين طويلة الأجل والتصوير عالية الدقة 32.

وبعد معالجة البيانات الخام، ويمكن الحصول على إحداثيات توطين 3D مع عادة 5-10٬000٬000 قمم جزيء واحد لكل مجموعة البيانات. كما هو مبين في الشكل (3)، والانجراف بوصفها وظيفة من الوقت يمكن تصور من الإحداثيات توطين fiducials. fiducials متعددة يمكن استخدامها لحساب متوسط تصحيح الانحراف مسار (الشكل 3A-B). أيضا، فمن المعتاد أن تصفية القمم التي تناسب سيئة إلى وظيفة 2D جاوس خلال تحليل التعريب. هذا قد يكون عائدا لضوضاء زائفة أو متداخلة جزئيا قمم جزيء واحد، ويمكن أن تكون متباينة من قبل مربع الخطأ المتبقية كبير يحسب أثناء عملية تركيب. قمم مع سطوع منخفضة (كما يدل على ذلك عدد الفوتون)، وبالتالي ارتفاع حالة عدم اليقين (أي أكبر من ~ 25 نانومتر) يتم تصفيتها أيضا، لق هذه المرجح أن تنشأ من مضان الخلفية غير محددة. وبالمثل، يتم رفض القمم التي كثافة من القنوات كاميرا 3 تناسب سيئة لمنحنى المعايرة أيضا، كما الإحداثيات ض حصلت لا يمكن الاعتماد عليها. وتجدر الإشارة إلى أن محتوى المعلومات كاملة من iPALM (والفحص المجهري التعريب بشكل عام) هائل، منذ اعلان نتائج التحليل ليس فقط في الإحداثيات fluorophore، ولكن أيضا في العديد من معلمات إضافية مثل كثافة، عرض، والسطوع، وما إلى ذلك، في الممارسة العملية، ومنذ عدد قليل نسبيا من الأدوات الحاسوبية المتاحة حاليا للتحليل في تنسيق الفضاء، وعادة ما جعل إحداثيات توطين أو إعادة بنائها إلى صور بكسل القائم لمزيد من التحليل.

النهج المتبع عادة لإعادة الإعمار صورة iPALM هو تمثيل كل التوطين بالتنسيق مع وظيفة جاوس 2D تطبيع، مع عدم اليقين توطين النحو في غاوعرض ssian 33. وهكذا، فإن الإحداثيات عالية الدقة (عادة القمم جزيء واحد مع سطوع عالية ضد خلفية منخفضة) تظهر قمم كما حادة وضيقة، في حين تظهر الإحداثيات منخفضة الدقة (عادة سطوع منخفضة أو عالية الخلفية قمم جزيء واحد) كما باهتة وأوسع نطاقا القمم. بهذه الطريقة، كل جزيء يساهم نفس القدر من شدة إلى الصورة. لمجموعة بيانات 3D، ض تنسيق يمكن تمثيلها باستخدام الألوان، وعادة على أساس جدول هوى (الشكل 4C-D). بدلا من ذلك، يمكن أن تظهر الصور كما وجهة نظر الجانب (خ، ض أو ذ، ض) الإسقاط أو وحدات التخزين. ويمكن استخدام عدد من البرامج المتاحة للجمهور لتصور هذه البيانات 34.

كما هو مبين في الشكلين 4-6 والصور iPALM تسفر عن تحسن كبير على مدى محدودة الحيود مضان المجهر. العمارة-و الأكتين في الخلايا HUVEC يمكن تصور مع الكثير تعزيز قرار يتخذ المكانيlution. في مناطق القشرة، وشبكات خيوط متميزة يمكن أن ينظر إليه، في حين أن الألياف الإجهاد، وحزم، وأقدام صفاحية، لوحظ أن شبكات و أكتين المكتظ أن يكون الملمس الخيطية، على الرغم من خيوط فردية لا يمكن تمييزها. هذا هو الأرجح بسبب القيود في كل من سطوع fluorophores ودقة الترجمة. إن وجود شعيرات القشرية مميزة تشير إلى أن التركيب الدقيق للشبكة و أكتين بشكل كاف محفوظة بشكل جيد؛ وبالتالي، يمكن أن iPALM أن تكون أداة مفيدة للتميز العمارة القشرية. في الشكل 5، يتم عرض منطقة فرعية من الخلايا HUVEC مع لمحات من خيوط الأكتين كميا. ويمكن أن ينظر إلى أن ض الرسم البياني من خيوط حوالي 15 نانومتر في العرض، صغير نسبيا مقارنة ~ 45 نانومتر لعرضية (س، ص) نظر، وتبين أن iPALM تعطي تحسنا ملحوظا قرار في زي قرار بالنسبة ل س، ص، طائرة، كما هو متوقع. ومع ذلك، منذ ACTUآل قطر F-الأكتين هو ~ 8 نانومتر، أنه من غير الواضح ما إذا كانت خيوط الملحوظ هو خيط واحد أو مجموعة من بضعة شعيرات. التصوير المتلازم باستخدام iPALM وEM يمكن أن يكون استراتيجية مفيدة لمزيد من توصيف العمارة و الأكتين، رغم أنه لم يتم تطبيق هذا النهج لدراسة و الأكتين بعد 23.

شكل 1
الشكل 1: رسم تخطيطي من iPALM 3-D سوبر قرار المجهري. أ) الخطط البصريات iPALM. العدسات موضوعية المزدوجة (نيكون، NA 1.49 60X) تسمح لكل الفوتون مضان المنبعثة إلى نشر من خلال كل من أعلى وأسفل مسارات شعاع البصرية، وتتم إعادة توجيها إلى التدخل في الحزمة الخائن من قبل زوج من المرايا الموجهة في 22.5 درجة. في مرحلة من مراحل الفوتون تدخلت الذاتي يتناسب طرديا مع δZ، وبالتالي ترميز ض تنسيق من fluorophore، ويمكن قياس لناجي شعاع الخائن 3-الطريق مع وجود اختلافات المرحلة المتبادلة من ~ 120 درجة بين الحزم الانتاج الثلاثة. وتركز من قبل العدسات أنبوب (L1-L3، F = 400 نانومتر) والتي تمت تصفيتها من قبل مرشح الانبعاثات (F1 - F3). لذا يظهر كل جزيء واحد مع كثافات مختلفة بين الكاميرات (EMCCD1-3) ولكن عند x مماثلة، الإحداثيات ص. (A) ويرد وتعديلها من المرجع. 11. (ب) صورة محدودة حيود الخلايا HUVEC المسمى لF-الأكتين مع اليكسا فلور 647. النقاط المضيئة تدل الاتحاد الافريقي fiducials جسيمات متناهية الصغر. وتتمثل 3 خطوط حمراء، خضراء، وزرقاء، على التوالي، تركزت على كل الإيمانية، مع فارق المرحلة بين الكاميرات # 1 - - زوايا مرحلة لكاميرات # 1 3 المشار إليها. مقياس شريط: 5 ميكرون (C) وصور إيمانية تظهر آثار التداخل. صور من إيمانية جسيمات متناهية الصغر الاتحاد الافريقي لكل كاميرا (CCD1-3) أو الكلي (مجموع)، تؤخذ على أنها ض الموقف (في نانومتر، على الصف السفلي) يتم فحص لمعايرة. كثافة داخل عصامويمكن رؤية كاميرا الفصل إلى التأرجح مع وجود علاقة المرحلة، كما هو مبين في الفقرة (ب). منحنى المعايرة (D) iPALM. تتم ترجمة العينة على طول محور ض. شدة من إيمانية جسيمات متناهية الصغر الاتحاد الافريقي لEMCCD1-3 هي العرض وخطوط حمراء، خضراء، وزرقاء، على التوالي (أعلى). هذه هي ثم تطبيع ويصلح لتحديد الاختلافات مرحلة (القاع). خلال المواءمة، ويتم تعديل هذا النظام لتحقيق الخلافات المرحلة القصوى بين جميع الكاميرات الثلاث. يتم أخذ منحنى المعايرة في كل موقع التصوير لاستخدامها في استخراج ض تنسيق كل جزيء واحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: واحد التصوير جزيء من Photoswitching آلإكساء فلور 647-phalloidin كما تسميات أكتين. (A) خطوة photoswitching الأولية. يسمى F-الأكتين في الخلايا الثابتة في مناطق ذات كثافة عالية من قبل phalloidin مترافق اليكسا فلور 647. ارتفاع شدة الإضاءة في المحتوية على ثيول النتائج عازلة الصورة في سرعة التبديل حالا من معظم fluorophores. (ب) إطارات التمثيلية للالخام جزيء واحد الإطارات. في الوميض ثابتة للدولة، ينبغي للتنشيط اليكسا فلور 647 يكون متفرق بما فيه الكفاية أن الجزيئات واحدة فردية تظهر كبقعة-PSF الحجم. صور من نفس الخلايا هو مبين في (أ)، كما هو موضح مع تباين معكوس. الحانات النطاق في A و B: 5 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): الانجراف تصحيح باستخدام Multip. لو Fiducials تنسيق التعريب لمدة أربعة fiducials (A، X-تنسيق، B، الإحداثي ص) كانت تستخدم لحساب الانحراف باستخدام التجهيزات كثيرات الحدود (5 تشرين النظام، المعلمات صالح في أعلى الزاوية اليمنى). متوسط مسار الانجراف يسمح تصحيح الانحراف مع الفرعي 5 نانومتر الدقة (خ: 3.085 نانومتر، ص: 3.606 نانومتر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل (4): تصور 3-D-و أكتين العمارة التي كتبها iPALM. (أ) صورة محدودة حيود الخلايا HUVEC مع F-الأكتين وصفت من قبل اليكسا فلور 647-phalloidin (الموافق المناطق الفرعية للخلية في الشكل 2). ويرجع ذلك إلى fiducials جسيمات متناهية الصغر الاتحاد الافريقي النقطة المضيئة. (C) صورة أعيد بناؤها iPALM، مع كل توطين الإحداثي صادر عن 2D-جاوس مع عرض المقابلة لحالة عدم اليقين التعريب. هو لون وفقا لشريط اللون ض تنسيق. ويمكن رؤية المناطق من الميزات الخيطية كثيفة ومتفرقة. أشرطة النطاق (AC): 1 ميكرومتر (D) التكبير في ضوء منطقة محاصر في C تظهر الخيطية طوبولوجيا الأكتين القشرية. شريط الحجم: 250 نانومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: النانو البعد من F-الأكتين تصور من قبل iPALM. (أ) صورة أعيد بناؤها iPALM خلايا HUVEC مع ب F-الأكتين المسمى ذ فلور اليكسا 647-phalloidin. ويشير اللون ض تنسيق وفقا لشريط اللون. شريط مقياس: 1 ميكرون (B) مستعرض المقطع العرضي الرسم البياني من إحداثيات س، ص الترجمة على طول المحور الطويل للمنطقة محاصر في الفقرة (أ). للحصول على الرسم البياني، ومن المتوقع الإحداثيات على محور طويل من منطقة الجزاء، واهمال مع 5 نانومتر بن الحجم. منحنى الرمادي يشير إلى وجود الأنسب الضبابي للرسم البياني، مع العرض الكامل في نصف كحد أقصى (FWHM) من 43.88 نانومتر. (C) الرسم البياني للض موقف توطين الإحداثيات في المنطقة محاصر في الفقرة (أ). واهمال للمناصب ض بحجم بن ل1 نانومتر. منحنى الرمادي يشير إلى وجود الأنسب الضبابي للرسم البياني، مع FWHM من 17.50 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

/files/ftp_upload/54774/54774fig6.jpg "/>
الرقم 6: مقارنة بين iPALM التصوير من F-الأكتين عن طريق الكواشف وصفها مختلفة الصور أعيد بناؤها iPALM من F-الأكتين المسمى باستخدام فلور اليكسا phalloidin 647 مترافق (A)، فلور اليكسا phalloidin 568-مترافق (B)، أو عن طريق ترنسفكأيشن مع الأكتين -mEos2 الانصهار ناقلات التعبير بروتين (C). أشرطة النطاق (AC): 1 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويستند النظام البصري من iPALM على تصميم موضوعي 4 و- ð ثنائي تعارض، كما هو مبين في الشكل 1A. يتم إنشاء الإعداد باستخدام أجزاء كل من عرف تشكيله والتجارية البصريات الميكانيكية، كما هو موضح سابقا 23 والمدرجة في الجدول 1. بالإضافة إلى الإعداد لدينا، ومعهد هوارد هيوز الطبي (HHMI) تستضيف النظام الذي هو في متناول المجتمع العلمي في مركز التصوير المتقدم في الحرم الجامعي بحوث Janelia. لرسومات كامل الميكانيكية، الخطط السيطرة، والبرمجيات، ونشجع القراء على الاستفسار مع هارالد هيس في HHMI للحصول على مزيد من المعلومات. والميزة الرئيسية لاستخدام iPALM فضلا عن غيرها من وسائل توطين المجهري جزيء واحد لتصور و الأكتين هي السهولة النسبية لإعداد عينة مقارنة مع تقنيات EM، والتي تتطلب عادة تجهيز العينات قاسية، وإعداد شاقة، والممارسين من ذوي المهارات العالية 3،23 . Additionallذ، مضان هو قابل بطبيعة الحال إلى التصوير المتعددة، التي لا يزال من الصعب للEM. ومع ذلك، كما هو موضح لاحقا، وهناك العديد من القيود الحالية لهذا النهج، سواء من حيث إعداد العينات وعملية التصوير. أولا، وكما هو الحال بالنسبة لإعداد نموذج EM، يجب توخي الحذر لضمان الحفاظ التركيبية لا بأس به من العينات 35، منذ بروتوكول الكافي لمستوى محدودة حيود قرار يمكن أن يسبب اضطرابات شديدة في مستوى النانو. للتصوير الأكتين، تثبيت السليم للخلايا هو عامل مهم يؤثر عينة الجودة. غلوتارالدهيد هو مثبت المفضل لأنه يحافظ على الهيكل الخلوي والغشاء بشكل جيد للغاية، وإن كان في حالات شارك في تلطيخ مع الأجسام المضادة، ومواقع حاتمة يمكن أن تتأثر. في مثل هذه الحالات، لامتصاص العرق قد تقدم حلا وسطا مقبولا، لأنه يميل إلى الحفاظ على أفضل المواقع حاتمة الأجسام المضادة. الأهم لجزيء واحد توطين المجهر، هذه المثبتات تميللتوليد تألق ذاتي الخلفية؛ وهكذا، بعد تثبيت التبريد بواسطة بوروهيدريد ضروري، وخاصة في حالة غلوتارالدهيد.

بالإضافة إلى ذلك، واختيار المناسب من fluorophores واستراتيجيات العلامات هي من بين أهم العوامل للتجارب الناجحة. بسبب البعد النانو من F-الأكتين، يطلب من كثافة عالية من تسميات لالتقاط شبكات الخيطية الأساسية، كما هو منصوص عليه من قبل نيكويست أخذ العينات نظرية 36. لالأكتين، phalloidin يسمح عالية جدا كثافة العلامات، مع مجموعة واسعة من fluorophores العضوية المتاحة من العديد من الشركات المصنعة. ومع ذلك، منذ phalloidin غير سامة، لا بد من تثبيت الخلية وpermeabilization. وتشمل استراتيجيات بديلة للخلايا الحية الأكتين متوافقة وضع العلامات باستخدام مزيج من البروتينات الفلورية (FP)، إما مع الأكتين أحادى أو مع البروتينية الصغيرة أكتين. ومع ذلك، وجدنا أن هذه تميل إلى أن تسفر عن أقل كثافة العلامات مقارنة phalloidin ( نانوغرام> الشكل 6). ونلاحظ أن الأكتين النقاء ويمكن أيضا أن يكون المسمى مباشرة مع fluorophores العضوية وإدخالها في الخلايا الحية التي Electroporation لل37، ولكن من المتوقع أن يكون مكلفا وكثيفة العمالة هذا النهج. من حيث fluorophores، وعموما تم العثور على اليكسا فلور 647 لتقديم أداء جيد على الدوام للفحص المجهري التعريب. هذا يمكن وصفها من حيث نسبة التباين الحاصل بين سطوع ذروة جزيء واحد ومضان الخلفية 38. وأعلى كثافة العلامات تتطلب نسبة تباين أعلى، لأن الخلفية يمكن أن تتحلل بشكل تراكمي دقة الترجمة. في تجربتنا، والعديد من fluorophores أخرى، مثل ATTO488، ATTO520، واليكسا فلور 568 (الشكل 6B)، ويمكن استخدامها لتصور و الأكتين، على الرغم من نتائج أقل اتساقا بالمقارنة مع فلور اليكسا 647، والذي يقدم أداء photoswitching قوية عبر مجموعة واسعة من الظروف عازلة التصوير.

معشوقة = "jove_content"> وبالنسبة لعملية التصوير، وغالبا ما تصور القيود في أساليب التصوير البيولوجية ومفاضلة في القرار المكانية، القرار الزماني، ومجموعة التصوير (في الميدان من رأي / العمق من الميدان والمدة) 39. وينطبق ذلك أيضا على مزايا وقيود iPALM. بالمقارنة مع تقنيات قرار المجهر سوبر 3-الأبعاد الأخرى، ظلت iPALM النهج البصرية أعلى حل إلى التاريخ، لا سيما على طول محور ض، مع ض قرار ما يقرب من 2 مرات أفضل من X، Y-قرار 11. ومع ذلك، فإن اعتماد iPALM على التداخل لارتفاع ض القرار أيضا يفرض قيودا على عمق التصوير، لأن منحنى المعايرة هو الدوري. وبعبارة أخرى، الإحداثيات ض تتكرر كل 250 نانومتر أو نحو ذلك (ل~ 700 انبعاث موجات نيوتن متر من اليكسا فلور 647). في الواقع، يمكن معالجة هذه الحالة باستخدام TIRF الإضاءة، مما يحد من منطقة الإثارة إلى داخل عمق الحقل زائل من <200 نانومتر من ساترة. وهكذا، fluorophores أعمق في العينة ليست متحمسة وتظل غير مرئية. ومع ذلك، وهذا يحد من الهياكل البيولوجية التي يمكن تصوير لتلك على مقربة من ساترة، مثل الالتصاقات البؤرية، الهيكل الخلوي القشري، وغشاء البلازما بطني، في حين أن أكثر الهياكل الداخلية هي بعيدة المنال. لعينة ثابتة، وعلاج واحد هو لأداء cryosectioning 40. ومع ذلك، فإن مثل هذا النهج هو شاقة للغاية ويتطلب خبرة متخصصة لا يمكن الوصول إليها عادة.

بدلا من ذلك، iPALM يمكن تكييفها للموسعة ض المدى من خلال الجمع بين التداخل مع نظام defocusing اللابؤرية-12 المستخدمة في 3D-STORM. ويوفر هذا النهج المزدوج زي تنسيق قراءات، أول من التداخل، الذي هو درجة عالية من الدقة ولكن الدورية، والثانية defocusing اللابؤرية، وهو أقل دقة ولكن غير دورية. وهذه الأخيرة يمكن استخدامها بعد ذلك إلى "بسط" أو كسر الانحطاط منإحداثيات ض التداخل، وبالتالي تمكين ثلاثة أضعاف عمق التصوير iPALM إلى ~ 750 نانومتر، وتقترب بشكل فعال العمق البؤري لا يتجزأ من العدسات عالية موضوعية NA. مع مرحلة إزالة التغليف، وقد استخدم iPALM للهياكل صورة عميقة داخل العينات، مثل الميتوكوندريا، وإن كان ذلك مع انخفاض طفيف الدقة في جميع الأبعاد 3 بسبب إضافي defocusing 40.

الحد جوهري آخر من iPALM هو سرعة التصوير. نظرا للحاجة أعداد كبيرة من الإطارات للحصول على كثافة عالية من الإحداثيات التوطين، وسرعة الكاميرا هي عادة الحد الأقصى لمعدل الاستحواذ. مع الكاميرات EMCCD الحالية التي تعمل في 10-20 معدلات ميغاهيرتز قراءات، يطلب عشرات من دقيقة لعدد كاف من الإطارات. وتتطلب هذه الفترات الزمنية الطويلة التي تكون ثابتة العينة. هنا، التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير، مثل أكسيد التكميلي معدن أشباه الموصلات (sCMOS) الكاميرا أسرع بكثير العلمية، قد تمكن من زيادة سريعة في الدردشةسرعة 41 الشيخوخة، على الرغم من أن هذا لم ينفذ لiPALM حتى الان. بالنسبة لبعض جزيء واحد نهج توطين المجهر، حقل واحد جزيء كثيفة يمكن تحليلها باستخدام خوارزمية تعديل 42 أو ضغط الاستشعار 43. تكييف هذه الاستراتيجيات قد أيضا تسريع iPALM عن طريق السماح للكثافة الصور جزيء واحد، وبالتالي أقل الإطارات.

مع القيود في سرعة ومجموعة التصوير والقوة في القرار المكانية، تطبيق رئيسيا لiPALM هو كطريقة التركيبية التي تعزز فوائد وضع العلامات الفلورية للكشف عن تنظيم النانوية بروتينات معينة 14،15،44. مزيد من التحسن، سواء من حيث تقنيات البصريات وfluorophore، يجب تمكين مزيد من تعزيز في القرار المكانية iPALM. على سبيل المثال، يستخدم iPALM معالجة الصور حاليا مقاربة بسيطة نسبيا التقريب من الدرجة الأولى، مع كل جزيء واحد عن طريق وظيفة-2D جاوس وعلى غرار ماسوميد أن يكون متوسط ​​نظائريا ثنائي القطب. يمكن أن تضاف هذه مع الطرق الحديثة، التي تستخدم نموذج أكثر دقة وظيفة نقطة الانتشار والتوجه ثنائي القطب، أو معالجة صريحة من الانحرافات البصرية عبر مجال الرؤية إلى حد كبير تحسين القرار المكانية. وبالمثل، تم الإبلاغ عن photocaging، مما يعزز سطوع fluorophore من حيث الحجم 45. في الواقع، منذ العناصر الرئيسية لمنظمتهم التركيبية اتسمت جيدا فإن الهيكل الخلوي، و أكتين يمكن أن يكون نظام نموذجا قيما للغاية لاختبار المزيد من التطورات المنهجية في iPALM. ومن المتوقع أن القدرة على تحليل منظمة بروتين بواسطة المجهر الضوئي مع صحيح على مستوى EM حل السلطة ليعزز إلى حد كبير فهمنا للجوانب لا تعد ولا تحصى من الهيكل الخلوي وظيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ستشغل وPK الامتنان الدعم المالي من مؤسسة البحوث الوطنية في سنغافورة، منحت لPK (جبهة الخلاص الوطني، NRFF-2011-04 وNRF2012NRF-CRP001-084). كما نشكر مختبر والأساسية المجهر مفتوحة مرافق MBI لدعم البنية التحتية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
optical table Newport, CA RS4000 iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical table Newport, CA S-2000
laser-642 Newport, CA 1185055 output power=100 mw
laser-561 Newport, CA 1168931 output power=200 mw
laser-488 Newport, CA 1137970 output power=200 mw
laser-405 Newport, CA 1142279 output power=100 mw
broadband dielectric mirrors Thorlabs, NJ BB1-E02 laser combiner
dichroic beamsplitter Semrock, NY LM01-427-25
acousto-optic tunable filter AA Opto-Electronic, France AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer Newport, CA 05LP-VIS-B
baseplate local workshop customized
turning mirror (22.5°) Reynard Corpporation, CA customized 22.5° mirror
motorized optic mounts New Focus, CA 8816
motorized XYZ translation stage Thorlabs, NJ MT3/M-Z6 sample holder
T-Cube DC servo motor controller Thorlabs, NJ TDC001
Piezo Phase Shifter Physik Instrumente, Germany S-303.CD
objective lens Nikon, Japan MRD01691 objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stage New Focus, CA 9062-COM-M
Pico Motor Actuator New Focus, CA 8301
rotary Solenoid/Shutter DACO Instruments, CT 5423-458
3-way beam splitter Rocky Mountain Instruments, CO customized beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner Physik Instrumente, Germany S-316.10
motorized five-axis tilt aligner New Focus, CA 8081
Picmotor ethernet controller New Focus, CA 8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module Physik Instrumente, Germany E-509/E-503/E-517
band-pass filter Semrock, NY FF01-523/20 filters
band-pass filter Semrock, NY FF01-588/21
band-pass filter Semrock, NY FF01-607/30
band-pass filter Semrock, NY FF01-676/37
notch filter Semrock, NY NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter Thorlabs, NJ FW103H
EMCCD Andor, UK DU-897U-CSO-#BV 3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization Dell Precision T3500 PC, 4 sets
coverslips with fiducial Hestzig, VA 600-100AuF sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectin Millipore, MT FC010
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 15710 fixation. 16%
glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 16220 25%
triton X-100 Sigma aldrich, MO T8787
HUVEC cells Life Technologies, CA C-015-10C
Medium 200 Life Technologies, CA M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors Life Technologies, CA A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 14190367
Pennicillin/Streptomycin 15140122
Trypsin/EDTA Life Technologies, CA 25200056
PIPES Sigma aldrich, MO P1851 PHEM
HEPES 1st base, Malaysia BIO-1825
EGTA Sigma aldrich, MO E3889
MgCl2 Millipore, MT 5985
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen, CA A22287 staining
sodium borohydride (NaBH4) Sigma aldrich, MO 480886 quenching
glucose 1st base, Malaysia BIO-1101 imaging buffer
glucose oxidase Sigma aldrich, MO G2133
catalase Sigma aldrich, MO C9322
cysteamine Sigma aldrich, MO 30070
Epoxy Thorlabs, NJ G14250
vaseline Sigma aldrich, MO 16415 sample sealing
lanolin Sigma aldrich, MO L7387
parafin wax Sigma aldrich, MO 327204
Immersion oil Electron Microscopy Sciences, PA 16915-04 imaging. Cargille Type HF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
  2. Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
  3. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  5. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  7. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
  8. Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
  9. Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
  10. Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
  11. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
  12. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  13. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
  14. Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
  15. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
  16. Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
  17. Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  18. Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
  19. Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
  20. Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
  21. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
  22. Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
  23. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
  24. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
  25. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
  26. Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
  27. Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
  28. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  29. Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
  30. Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
  31. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
  32. Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
  33. Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
  34. El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
  35. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
  36. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
  37. Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
  38. Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
  39. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
  40. Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
  41. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  42. Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
  43. Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
  44. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
  45. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).

Tags

الفيزياء الحيوية، العدد 118، القرار سوبر المجهر، النخيل، iPALM، الإسفار، F-الأكتين، واحدة جزيء الأقلمة، Photoswitchable Fluorophores، التداخل
ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Kanchanawong, P.… More

Wang, Y., Kanchanawong, P. Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). J. Vis. Exp. (118), e54774, doi:10.3791/54774 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter