Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

إعداد و Published: December 4, 2016 doi: 10.3791/54776
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MR Neuroimaging Agents, Max Planck Institute for Biological Cybernetics

Summary

يصف هذا البروتوكول إعداد وتوصيف وكيل النقيض dendrimeric التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) الذي يحمل يخلب macrocyclic أساس cyclen للتنسيق بين أيونات ممغطس الجادولينيوم. في سلسلة من التجارب التصوير بالرنين المغناطيسي في المختبر، أنتج هذا العامل إشارة التصوير بالرنين المغناطيسي تضخيم بالمقارنة مع التناظرية أحادى متاحة تجاريا.

Abstract

المجمعات ممغطس الجادولينيوم (III) مع اسيكليك أو يخلب macrocyclic هي عوامل التباين الأكثر شيوعا (CAS) للتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). الغرض منها هو تعزيز معدل استرخاء البروتونات الماء في الأنسجة، وبالتالي زيادة تباين الصورة MR وخصوصية القياسات التصوير بالرنين المغناطيسي. الحالي عوامل التباين وافق سريريا ومنخفضة الوزن الجزيئي الجزيئات التي يتم تطهيرها بسرعة من الجسم. استخدام dendrimers كحاملات للchelators ممغطس يمكن أن تلعب دورا هاما في التنمية المستقبلية أكثر كفاءة عوامل التباين التصوير بالرنين المغناطيسي. على وجه التحديد، فإن الزيادة في تركيز المحلية من نتائج الأنواع ممغطس في أعلى النقيض إشارة. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا CA أطول فترة بقاء الأنسجة المقرر أن الوزن الجزيئي المرتفع والحجم. هنا، علينا أن نبرهن إجراء مناسب لإعداد dendrimers مع monomacro الجزيئات وكلاء التصوير بالرنين المغناطيسي النقيض من ذلك على أساس بولي (amidoamine) (PAMAM)دوري DOTA من نوع chelators (DOTA - 1،4،7،10-tetraazacyclododecane-1،4،7،10-tetraacetate). تم إلحاق وحدة مخلبية من خلال استغلال التفاعل من مجموعة ثيوسيانات (سي إس) نحو الجماعات سطح أمين من dendrimer PAMAM لتشكيل الجسور ثيوريا. وتنقيته المنتجات Dendrimeric وتحليلها باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي، قياس الطيف الكتلي، وتحليل العناصر. وأخيرا، تم تسجيل عالية الدقة صور الرنين المغناطيسي وتم مقارنتها التناقضات إشارة تم الحصول عليها من dendrimeric استعداد وكلاء أحادى متاحة تجاريا.

Introduction

التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) هي تقنية قوية وغير المؤين التصوير المستخدمة على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية والتشخيص السريري نظرا لطبيعتها موسع وممتازة جوهري على النقيض من الأنسجة الرخوة. أساليب التصوير بالرنين المغناطيسي الأكثر شيوعا الاستفادة من إشارة تم الحصول عليها من البروتونات المياه، وتوفير صور عالية الدقة ومعلومات مفصلة داخل الأنسجة على أساس الاختلافات في كثافة إشارات المياه. كثافة إشارة وخصوصية التجارب التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن تحسينها باستخدام عوامل التباين (CAS). وهذه هي الأنواع ممغطس أو مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic التي تؤثر على الطولي (T 1) وعرضية (تي 2) مرات الاسترخاء على التوالي 1،2.

مجمعات للالجادولينيوم اللانثينيدات أيون مع polyamino بروابط حمض كاربوكسيلية هي الأكثر شيوعا تي 1 المصدقة. الجادولينيوم (III) تقصير الاسترخاء T 1الوقت من البروتونات المياه، مما يزيد من النقيض إشارة في تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي 3. ومع ذلك، الجادولينيوم الأيونية هي سامة. حجمه يقارب ذلك من الكالسيوم (II)، وأنه يؤثر بشكل خطير يشير في الخلايا بمساعدة الكالسيوم. لذلك، يتم توظيف اسيكليك وmacrocyclic يخلب لتحييد هذه السمية. وقد وضعت مختلف بروابط متعدد الأسنان حتى الآن، مما أدى الجادولينيوم (ثالثا) المجمعات مع الاستقرار الحرارية العالية وهمود الحركي 1. تلك التي تستند إلى cyclen azamacrocycle 12 membered، ولا سيما في DOTA مشتق tetracarboxylic (1،4،7،10-tetraazacyclododecane-1،4،7،10-tetraacetate) هي المجمعات الأكثر التحقيق والتطبيقية لهذه الفئة كاليفورنيا.

ومع ذلك، GdDOTA من نوع المصدقة وانخفاض أنظمة الوزن الجزيئي، وعرض بعض العيوب مثل كفاءة التباين المنخفض وإفراز الكلى سريع. الجزيئات ومتعددي المصدقة قد يكون حلا جيدا لهذه المشاكل 4. منذ CA biodistribuنشوئها يتحدد أساسا من حجمها، عرض المصدقة الجزيئات مرات الاحتفاظ أطول بكثير داخل الأنسجة. بنفس القدر من الأهمية، وmultivalency من هذه العوامل يؤدي إلى زيادة تركيز المحلية لجنة التحقيق أحادى MR (على سبيل المثال، مجمع GdDOTA)، وتحسين كبير في إشارة MR المكتسبة وجودة القياس.

Dendrimers هي من بين السقالات الأكثر تفضيلا لإعداد متعددي المصدقة للتصوير بالرنين المغناطيسي 4،5. هذه الجزيئات تشعبت للغاية مع أحجام محددة جيدا عرضة لمختلف ردود الفعل اقتران على سطحها. في هذا العمل، ونحن التقرير إعداد وتنقية، وتوصيف CA dendrimeric للتصوير بالرنين المغناطيسي تتكون من الجيل 4 (G4) بولي (amidoamine) (PAMAM) dendrimer بالإضافة إلى يخلب GdDOTA مثل (DCA). وصفنا توليف مشتق DOTA على رد الفعل واقتران بها إلى dendrimer PAMAM. على complexation مع كلمة المدير العام (III)، وتوصيف الفيزيائية القياسية proceduإعادة من DCA تم تنفيذها. وأخيرا، أجريت تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي لإظهار قدرة DCA لإنتاج صور الرنين المغناطيسي مع تباين أقوى من تلك التي تم الحصول عليها من انخفاض الوزن الجزيئي المصدقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد DCA

  1. تركيب وحدة أحادى 4 6.
    1. توليف 4- (4-nitrophenyl) -2- (ثلاثي 4،7،10-tris---butoxycarbonylmethyl 1،4،7،10-tetraazacyclododec-1-YL) زبدي حمض ثلاثي -butyl استر (2).
      1. حل (ثلاثي 4،7-bis- -butoxycarbonylmethyl-1،4،7،10-tetraaza-cyclododec-1-YL) -acetic ثلاثي حمض -butyl استر 1 (1.00 جم، 1.94 ملمول) في N، N -dimethylformamide ( DMF، 5 مل)، إضافة كربونات البوتاسيوم (0.67 جم، 4.86 ملمول، 2.5 يعادل.) ويحرك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
        وقد أعد Macrocycle 1 من cyclen وثالثي -butyl bromoacetate وفقا للإجراءات التي تم نشرها مسبقا 7: ملاحظة.
      2. إضافة ثالثي -butyl-2-برومو-4- (4-nitrophenyl) butanoate (0.87 جم، 2.53 ملمول، 1.3 يعادل.) portionwise أكثر من 1 ساعة. تواصل اثارة الخليط تحت رانه ظروف التفاعل نفسها للساعة 18 التالية.
        ملاحظة: -butyl-2-برومو-4- ثالثي أعد (4 nitrophenyl) butanoate من 4- (4-nitrophenyl) حمض -butyric، كلوريد الثيونيل، والبروم وفقا للإجراءات التي تم نشرها مسبقا 8.
      3. إزالة DMF عن طريق لمبة لمبة-تقطير فراغي في 40-60 درجة مئوية 9.
      4. تنقية المخلفات التي اللوني العمود (هلام السيليكا، 7٪ الميثانول / ثنائي كلورو ميثان) للحصول على المنتج (2)، البني غير متبلور الصلبة (1.09 ز، 72٪) 10.
    2. توليف 4- (4-aminophenyl) -2- (ثلاثي 4،7،10-tris---butoxycarbonylmethyl 1،4،7،10-tetraazacyclododec-1-YL) زبدي حمض ثلاثي -butyl استر (3).
      1. حل نترات البنزين المشتق 2 (1.00 جم، 1.28 ملمول) في الإيثانول (10 مل)، و7 N محلول الأمونيا في الميثانول (150 ميكرولتر). إضافة البلاديوم على الكربون المنشط كمحفز (PD / C، 150 ملغ، 15٪ بالوزن) إلى solutiعلى.
      2. يهز خليط غير متجانس لمدة 16 ساعة في ظل جو الهيدروجين (2.5 بار) في الجهاز hydrogenator بار.
      3. إعداد كعكة من الأرض دياتومي عن طريق إيقافه في الإيثانول وتصفية تعليق من خلال قمع الزجاج المحجر. صب تعليق من 1.1.2.2 على كعكة مستعدة لإزالة محفز المشتريات / C عن طريق الترشيح.
      4. إزالة المذيب عن طريق التقطير لطيف على المبخر الدوار (الماء درجة حرارة الحمام ~ 40 درجة مئوية) للحصول على مركب (3) والبني غير متبلور الصلبة (0.91 ز، 95٪).
    3. توليف 4- (4-isothiocyanatophenyl) -2- (4،7،10-tris- ثالثي -butoxycarbonylmethyl 1،4،7،10- tetraazacyclododec-1-YL) زبدي ثلاثي حمض -butyl استر (4).
      1. إضافة thiophosgene (0.124 مل، 1.58 ملمول، 1.3 يعادل.) إلى خليط من 3 (0.91 جم، 1.22 ملمول) وثلاثي الإيثيلامين (0.685 مل، 4.87 مليمول، 4 يعادل.) في ثنائي كلورو ميثان (15 مل).
      2. يحرك بقوة ميل رد فعلxture مع محرك مغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة.
      3. إزالة المذيب عن طريق التقطير لطيف على المبخر الدوار (الماء درجة حرارة الحمام ~ 40 درجة مئوية)، ومن ثم تنقية الناتج الخام بواسطة اللوني العمود (هلام السيليكا، 5٪ الميثانول / ثنائي كلورو ميثان) للحصول على المنتج 4 كما البني الفاتح غير متبلور الصلبة (0.51 ز، 53٪).
  2. تجميع للDCA dendrimer.
    1. تجميع للdendrimer 5.
      1. خذ dendrimer G4-PAMAM (667 ملغ، 10٪ محلول dendrimer في الميثانول، 4.67 مكرومول)، يتبخر الميثانول عن طريق التقطير لطيف على المبخر الدوار (الماء درجة حرارة الحمام ~ 40 درجة مئوية)، وتذوب بقايا في DMF (4 مل) .
      2. إضافة ثلاثي الإيثيلامين (0.105 مل، 0.75 مليمول، 160 يعادل.)، يحرك المزيج لمدة 45 دقيقة في 60 درجة مئوية، وإضافة ثيوسيانات 4 (354 ملغ، 0.45 ملمول، 1.5 يعادل. النسبي للفئات سطح الأمينية من dendrimer) portionwise اوفهص 1 ساعة.
      3. يحرك خليط التفاعل مع محرك مغناطيسي في 45 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
      4. إزالة المذيب عن طريق لمبة لمبة-تقطير فراغي في 40-60 درجة مئوية.
      5. تنقية المخلفات التي اللوني الحجم استبعاد استخدام دهون هلام الترشيح المتوسطة والميثانول كما شاطف. حزمة العمود، تنتفخ وسائل الاعلام الترشيح في الميثانول لا يقل عن 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة (> 4 مل من الميثانول لكل 1 غرام من مسحوق) من دون تطبيق الضغط. أداء فصل الجاذبية من خلال جمع 1 مل الكسور.
      6. تحليل الكسور التي تم جمعها مع اللوني طبقة رقيقة (TLC). تطوير لوحة TLC في 15٪ الميثانول / ثنائي كلورو ميثان (فقط يتم اشتقاق معظم بقعة القطبية تقع على خط قاعدة من المنتج dendrimeric). تتبخر الكسور التي تم جمعها عن طريق التقطير لطيف على المبخر الدوار (درجة حرارة حمام ماء ~ 40 درجة مئوية) للحصول على المنتج 5 (270 ملغ، 91٪).
    2. تجميع للdendrimer
    3. حل خالب محمية dendrimeric 5 (270 ملغ، 4.23 مكرومول) في حمض الفورميك (5 مل) ويحرك الخليط على 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    4. تتبخر حمض الفورميك عن طريق التقطير على المبخر الدوار (~ ضغط 15 مللي بار ودرجة حرارة حمام ماء ~ 40 درجة مئوية) وتجميد تجفيف المنتج لإعطاء 6 (ضغط ~ 0.2 مللي بار) 9.
  3. تجميع للعامل تباين dendrimeric (DCA)
    1. حل خالب dendrimeric 6 (4.35 مكرومول) في المياه وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M.
    2. حل GdCl 3 · 6H 2 O (113 ملغ، 304 مكرومول) في الماء (1 مل)، وإضافته قطرة قطرة في حل خالب 6 على مدى 4 ساعات. الحفاظ على درجة الحموضة في 7.0 مع مائي محلول هيدروكسيد الصوديوم (0.05 م) عن طريق قياس درجة الحموضة مع متر الرقم الهيدروجيني.
    3. يحرك الخليط مع محرك مغناطيسي في تي الغرفةemperature لمدة 24 ساعة.
    4. إضافة ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA، 158 ملغ، 426 مكرومول) إلى portionwise حل أكثر من 4 ساعة لإزالة الفائض من كلمة المدير العام (III) مع الحفاظ على درجة الحموضة في 7.0 مع مائي محلول هيدروكسيد الصوديوم (0.05 م). يحرك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
    5. أداء الحجم الاستبعاد اللوني لإزالة غالبية GdEDTA ويزيد من EDTA. استخدام ماء المتوسطة هلام الترشيح تورم في الماء لتعبئة العمود. تقليل الخليط إلى حجم مناسب وتحميل العمود. أزل عمود مع الماء منزوع الأيونات دون الضغط.
    6. الطرد المركزي العينة باستخدام وحدة تصفية الطرد المركزي 3 كيلو دالتون لمدة 30 دقيقة في الطرد المركزي قوة 1800 x ج لإزالة مخلفات GdEDTA وEDTA. كرر هذه الخطوة (حوالي خمس مرات) حتى يظهر الترشيح غياب EDTA وGdEDTA. نقل العينة إلى قارورة، تتبخر، ومن ثم تجميد الجافة المذيب للحصول على المنتج من البيض مثل DCA النهائي (186 ملغ، 71٪).
      ملاحظة: تحقق غياب EDTA وGdEDTA بواسطة ESI-MS.
    7. تأكيد غياب كلمة المدير العام (III) كما أيون مجانا باستخدام اختبار زايلينول البرتقال. حل الترشيح (0.5 مل) في حل العازلة خلات (درجة الحموضة 5.8). إضافة بضع قطرات من محلول زايلينول البرتقال وتتبع تغير اللون (الأصفر أو اللون البنفسجي يدل على غياب أو وجود لحرية ش ج (III) الأيونات في الحل، على التوالي) 11.

2. في المختبر توصيف Dendrimeric المنتجات

  1. تقدير عدد DOTA وحدات macrocyclic بالإضافة إلى dendrimer PAMAM (تحميل من dendrimer مع macrocycles مثل DOTA)
    1. تقدير مع 1 H NMR (NMR - النووي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي).
      ملاحظة: هذا الإجراء هو ممكن على dendrimers 5 و 6، ولكن ليس على DCA.
      1. تسجيل الطيف 1 H NMR 12.
      2. دمج المنطقة العطرية والمنطقتين منفصلة الأليفاتية (1. إشارات من dendrimer الأليفاتية والبروتونات macrocyclic؛ 2. إشارات من المجموعات ر -Bu) أو مجرد منطقة دهنية لdendrimers 5 و 6 على التوالي.
        ملاحظة: لا توجد أية إشارة منفصلة في المنطقة الأليفاتية نشأت من المجموعات ر -Bu في dendrimer 6 منذ أن تم تحلل.
      3. استخدام المعادلة. 1 أو المعادلة. 2 لتقدير عدد الوحدات macrocyclic (ن)، حيث R = نسبة من التكاملات (الأليفاتية / العطرية في المعادلة 1 أو الأليفاتية-dendrimer / aliphatic- تي بو في المعادلة 2)، H dend = عدد البروتونات في dendrimer، H هارون = عدد البروتونات العطرية، H ر بو = عدد البروتونات في مجموعات ر -Bu، وH ماك = عدد البروتونات في macrocycle واحد.
        ملاحظة: إما المعادلة. 1 أو المعادلة. 2 يمكن استخدامها FOdendrimer 5 ص، بينما المعادلة فقط. 1 يمكن استخدامها لdendrimer 6. منذ البروتونات تبديل (على الأمينات، الاميدات، thioureas، أو carboxylates) وعادة ما يجري استبدالها الديوتيريوم، كانوا لا يفترض في الحسابات. هنا، H dend استخدمت = 1128 (لمدة 5) أو 1000 (لمدة 6)، H هارون = 4، وH ماك = 27.
        المعادلة 1 (1)
        المعادلة 2 (2)
    2. تقدير من تحليل العناصر باستخدام نسبة النيتروجين إلى الكبريت.
      1. إجراء تحليل العناصر على عينة dendrimeric الصلبة (DCA في هذا العمل).
      2. استخدام المعادلة. 3 لتقدير عدد الوحدات macrocyclic (ن)، حيث R = نسبة يحددها٪ N و٪ S، N dend أو S dend = عددالنيتروجين أو ذرات الكبريت في dendrimer، وN ماك أو S ماك = عدد من النيتروجين أو الكبريت الذرات في وحدة macrocyclic واحد.
        ملاحظة: يتم الحصول على عامل 2.29 من النسبة في الكتل الذرية من الكبريت والنيتروجين. في هذا العمل، واستخدمت N dend = 250، S dend = 2، ن ماك = 5، و S ماك = 1.
        المعادلة 3 (3)
    3. تقدير مع مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز الوقت / تأين الطيران (MALDI-TOF).
      1. إجراء تحليل MALDI-TOF MS 13.
      2. حساب عدد الوحدات macrocyclic (ن) وفقا لالمعادلة. 4، حيث M ض = الكتلة لاحظ (م / ض)، ض = تهمة الأنواع، M dend = كتلة الجزء dendrimeric، وM ماك = كتلة وحدة macrocyclic واحد.
        لاالشركة المصرية للاتصالات: M dend = 14306 وM ماك = 719 استخدمت في هذا العمل.
        المعادلة 4 (4)
  2. تحديد تركيز DCA ([DCA]): السائبة قياس القابلية المغناطيسية (BMS)
    1. حل DCA (5-10 ملغ) في الماء (360 ميكرولتر) في أنبوب قارورة بلاستيكية ([DCA] ~ 5-10 ملم).
      ملاحظة: [DCA] ينبغي أن يكون في حدود 5-10 ملم لتجنب التداخل المحتمل من الأصداء BuOH تي في تركيزات عينة> 15 ملم، مع صدى المياه في δ = 4.7 جزء في المليون.
    2. إضافة 60 ميكرولتر من D 2 O: تي خليط BuOH (2: 1 ت / ت) إلى محلول مائي من دائرة الطيران المدني وخلط المحلول الناتج (420 ميكرولتر) باستخدام خلاط دوامة.
    3. نقل 400 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب الرنين المغناطيسي الخارجي، ووضع أنبوب إدراج NMR متحد المحور مع BuOH تي: H 2 O خليط (10:90 ت / ت) في أنبوب العينة.
    4. سجلوNMR الطيف 1 H وقياس التحول تردد بين إشارات الرنين المستمدة من تي BuOH في أنابيب الرنين المغناطيسي النووي الداخلية والخارجية (المرجع) 12.
    5. استخدام المعادلة. 5 لتحديد [DCA]، حيث T = درجة الحرارة المطلقة، Δχ = التحول المسجلة ميكرون ممثل المؤسسة = لحظة فعالة المغناطيسية لأيون انثانيد (μ ممثل المؤسسة = 7.94 لكلمة المدير العام (III) 14، وق = أ تعتمد ثابت على شكل العينة ومكانتها في المجال المغناطيسي (0، 1/3، 1/6 وفي حالة وجود المجال، اسطوانة موازية ل، واسطوانة عمودي على المجال المغناطيسي، على التوالي).
      ملاحظة: القيمة المحسوبة التي تم الحصول عليها ل[DCA] يجب تصحيح لتركيز الأصلي بسبب إضافة D 2 O: تي حل BuOH (60 ميكرولتر).
      المعادلة 5 (5)
  3. ضوء الديناميةنثر (DLS) القياسات.
    1. يعد حل DCA تصفيتها (0.2 ميكرون بوليتيترافلوريثيليني مرشح / PTFE، 0.75 ملم في كلمة المدير العام (III)) في 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) العازلة (25 مم، ودرجة الحموضة 7.4) وتحويلها إلى كفيت لقياس DLS.
    2. ضع كفيت في الجهاز دائرة الأراضي والمساحة وتعيين المعلمات التالية: 5 التكرار من 15 بالاشعة (1 مسح = 12 ثانية، معامل الانكسار = 1.345، وامتصاص = 1٪) دون تأخير في بين المسح الضوئي ومع موازنة درجة الحرارة قبل 30 ثانية لتسجيل .
    3. تصدير البيانات التي حصل عليها والحصول على الرسم البياني حجم التوزيع عن طريق التآمر السكان (٪) بوصفها وظيفة من حجم (قطر الهيدروديناميكية).
  4. قياس relaxivities طولية وعرضية.
    ملاحظة: إجراء مماثل تم بالفعل وصف باستخدام الاسترخاء الوقت محلل 15؛ تم تنفيذ هذا الإجراء باستخدام الرنين المغناطيسي النووي مطياف 300 ميغاهيرتز مع Topspinالبرمجيات.
    1. إعداد مجموعة من الحلول DCA في H 2 O: D 2 O (500 ميكرولتر و 10٪ D 2 O في H 2 O، [DCA] = 2.0، 2.5، 3.0، 3.5، 4.0، 4.5، و 5.0 ملم، [HEPES ] = 25 مم) من العينة الأسهم DCA (انظر القسم 2.2).
    2. نقل 450 ميكرولتر من الحل في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي ووضعه في الصك.
    3. تحسين المعلمات الاستحواذ (90 درجة مدة النبضة الإثارة (P1)، وإشعاع التردد الإزاحة (O 1)) ثم قم بإجراء تي 1 و تي 2 التجارب باستخدام الانتعاش قلب (الأشعة تحت الحمراء)، والسيارات، بورسيل-Meiboom-جيل (CPMG ) تسلسل النبض، على التوالي.
    4. تقرير مرات تي 1 و تي 2 الاسترخاء.
      1. حدد سجلت القياس، عملية الطيف 2D في البعد F2، وتنفيذ أعمال التصحيح المرحلة التفاعلي.
      2. حدد شريحة المناسبة (الذروة مع الحد الأقصى لكثافة) في تحليل / T 2 نافذة الاسترخاء، ودمج ذلك، وتصدير المنطقة إلى وحدة الاسترخاء.
      3. حدد الوظيفة المناسبة المناسب (invrec أو uxnmrt2 للتجارب الأشعة تحت الحمراء وCPMG، على التوالي) للحصول على تي 1 أو تي 2 مرات الاسترخاء.
    5. كرر الخطوات 2.4.4.2-2.4.4.4 لجميع الحلول المتبقية [DCA].
    6. حساب معدلات الاسترخاء (R 1 و R 2) من الحصول تي 1 القيم (ص 1،2 = 1 / T 1،2).
    7. مؤامرة R 1 و R 2 (ثانية -1) كدالة للتركيز كلمة المدير العام (III) مم.
    8. تحديد relaxivities طولية وعرضية، ص 1 و ص 2 (ملي -1 ثانية -1)، من المنحدر من خط تركيبها، على النحو المحدد من قبل المعادلة. 6، حيث R ط، طب التوليد = والطولي (ط = 1) أو عرضية (ط = 2) معدل الاسترخاء diamagnetic منالمياه في حالة عدم وجود الأنواع ممغطس و[كلمة المدير العام] = تركيز كلمة المدير العام (III) المستخدمة في التجربة.
      المعادلة 6 (6)

3. في المختبر التصوير بالرنين المغناطيسي. مقارنة بين DCA وGdDOTA

  1. إعداد الأشباح أنبوب
    1. تحضير المحاليل المائية من DCA (4 × 350 ميكرولتر) وGdDOTA (4 × 350 ميكرولتر)، وكذلك عينات من المياه (4 × 350 ميكرولتر) لمجموعتين من التجارب حيث يتم حساب تركيز عوامل التباين: (3.1.1.1) في كلمة المدير العام (III) أو (3.1.1.2) في الجزيء.
      1. إعداد عينتين DCA واثنين من GdDOTA عينات مع تركيزات 0.5 و 1.0 مم في كلمة المدير العام (III)، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، وإعداد اثنين من عينات المياه (مثل أنابيب السيطرة).
      2. إعداد عينتين DCA (2.5 و 5.0 مم في كلمة المدير العام (III) أو 0.05 و 0.1 ملم في جزيء dendrimeric)، عينتين GdDOTA (0.25، 0.5 ملم) واثنين من عينات المياه (كنترولأنابيب لتر).
        ملاحظة: يجب أن يتم إعداد DCA وGdDOTA تركيزات المناسبة عن طريق تمييع عينات الأسهم منهما مع تركيزات تحدد من خلال طريقة BMS (انظر القسم 2.2) مع العازلة HEPES (7.4 درجة الحموضة). من أجل تبسيط العمليات الحسابية، وكان من المفترض ن = 50 لمتوسط ​​عدد الوحدات macrocyclic في جزيء dendrimer. ولذلك، فإن نسبة DCA: كانت GdDOTA 1: 5، وتحسب على أساس لكل جزيء.
    2. وضع العينات في 300 أنابيب قنينة بلاستيكية ميكرولتر، وتجنب وجود فقاعات الهواء في الحل.
      ملاحظة: حجم الأنابيب قنينة بلاستيكية يعتمد على نوع وحجم ملف الترددات الراديوية المستخدمة (هنا، وتعطى مثالا مع لفائف وحدة التخزين).
    3. إدراج العينات داخل حقنة (60 مل الحجم)، وملء مع 1 ملم GdDOTA حل، ووضعه في الماسح الضوئي.
      وضعت العينات في محلول مائي من GdDOTA لتجنب آثار الحساسية (الاختلافات في مجال الصورة المغناطيسي ملاحظة:trength التي تحدث بالقرب من الواجهات بين المواد قابلية مغناطيسية مختلفة).
  2. الأمثل المعلمة والتصوير.
    1. استخدام الفحص التشريحي (كالايزر / Tripilot) لوضع الحقنة مع العينات في مركز التساوي من المغناطيس.
    2. اضغط على إشارة المرور (مسح تعديل) لإجراء تعديلات على الملئ (تعديل التجانس المجال المغناطيسي) من حجم كامل، التردد المركزي (O 1)، وكسب المتلقي (RG)، وكسب الإرسال (TX0 وTX1).
    3. لتي 1 -weighted (T 1W) والتصوير، وحدد طريقة سريعة منخفضة زاوية اطلاق النار (عاجل جدا).
    4. اختيار شريحة الاكليلية للعينات وضعت عموديا (حقنة أفقيا) في الماسح الضوئي باستخدام المسح الضوئي كالايزر.
    5. استخدام المعادلة. 7 لتعظيم الاستفادة من (CNR) الاستحواذ على النقيض إلى الضجيج المعلمات 16، حيث α = زاوية الوجه، TE = وقت الصدى، TR =الوقت التكرار، وتي 1، A، T 1، B = تي 1 مرات من العينة ألف (تي 1، A) والعينة الثانية (تي 1، B) والتي يجب أن يكون الحد الأقصى لجنة المصالحة الوطنية (نفس صالحة ل T 2 مرات: T 2، A و T 2، B).
      يجب تعيين تي 1 و تي 2 الاسترخاء مرات لالقيم التي تم الحصول عليها من قياسات (القسم 2.4) relaxivities طولية وعرضية، في حين أن الشركة المصرية للاتصالات، ينبغي الحصول TR، وα من الحساب الأمثل لجنة المصالحة الوطنية: ملاحظة.
      المعادلة 7 (7)
    6. الحصول على صورة باستخدام المعلمات التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة (3.2.5).
    7. حساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR).
      1. تحميل المكتسبة تي 1W صورة (مسح) في صورة العرض والتجهيزالنافذة، وانقر على تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI).
      2. اختيار العائد على الاستثمار دائري واستدراجه في موقف عينة والخلفية. وفي وقت لاحق، انقر على الشاشة للحصول على متوسط السعة إشارة (S إشارة) والانحراف المعياري للخلفية (الضوضاء S).
      3. كرر الخطوة 3.2.7.2 لDCA، GdDOTA، وعينات من المياه.
      4. حساب SNR باستخدام الصيغة: SNR = S إشارة / S الضوضاء.
    8. وبعد إجراء تعديل طفيف، نفذ T 2 -weighted (T 2W) التصوير باستخدام سرعة اقتناء مع طريقة تعزيز الاسترخاء (نادر). لتعظيم الاستفادة من المعلمات الاستحواذ لجنة المصالحة الوطنية، واستخدام المعادلة. 8.
      المعادلة 8 (8)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إعداد DCA يتكون من مرحلتين: 1) التوليف من أحادى DOTA من نوع خالب (الشكل 1) و 2) اقتران خالب مع dendrimer G4 PAMAM ثم إعداد وكلمة المدير العام dendrimeric (III) معقد (الشكل 2) . في المرحلة الأولى، تم إعداد DOTA من نوع خالب القائم على cyclen تحتوي على أربعة الأحماض الكربوكسيلية ومجموعة متعامدة مناسبة لمزيد من التعديلات الاصطناعية. إعداد بدأ من 1 (DO3A- ثالثي -butyl استر) 7، والذي كان الألكيلية مع ثالثي -butyl 2-برومو-4- (4-nitrophenyl) butanoate 8 لتوفير DOTA المشتقة 2. خفضت الهدرجة المحفز البلاديوم مجموعة نيترو العطرية في 2 لانتاج الأنيلين 3. نتج عن تحويل 3 مع thiophosgene في ثيوسيانات 4، حركتيوقد استخدم ح سابقا وكيلا-أمين رد الفعل لإعداد dendrimeric المصدقة 17.

في المرحلة التالية، تم استخدام macrocycle 4 كوحدة أحادى الأساسية في رد فعل اقتران المتوفرة تجاريا dendrimer G4 PAMAM. المجموعات سطح أمين من dendrimer تتفاعل مع المجموعات ثيوسيانات من مونومر 4 في وجود قاعدة. تمت إزالة الفائض من 4 بواسطة اللوني الحجم استبعاد استخدام وسيلة هلام الترشيح للدهون مع الميثانول كما شاطف. وتحلل استرات ثالثي -butyl على الحصول عليها، dendrimer macrocyclic المترافقة 5 مع حمض الفورميك لانتاج 6، الذي كان آنذاك مجفف بالتجميد واستخدامها في الخطوة التالية دون تنقية. تم إجراء تشكيل كلمة المدير العام (ثالثا) المجمعات من DOTA من نوع macrocycles بإضافة GdCl 3 · 6H 2 O إلى حل س مائيو 6 مع الحفاظ على درجة الحموضة في حوالي 7. فائض كلمة المدير العام (III) والمعقد مع ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل خالب المشترك (EDTA). تم إزالة GdEDTA EDTA معقدة والزائدة من النظام اللوني الحجم استبعاد استخدام وسيلة هلام الترشيح ماء مع الماء كما شاطف. تم إزالة الشوائب المتبقية صغيرة الحجم من الحل عن طريق الطرد المركزي باستخدام 3 كيلو دالتون وحدات الترشيح الطرد المركزي.

وبعد تركيب تقارن-dendrimer macrocycle، وقد تم استخدام نهج تحليلي موحد لتميز المنتجات. لتحديد الإشغال سطح أمين من 5 و 6، وقد تم تحليل 1 أطياف H NMR. وتمت مقارنة النتائج وأكد مع المنتج النهائي (DCA)، حيث قدرت التحميل من dendrimer مع macrocycles باستخدام التحليل العنصري وMALDI-TOF الطيف الكتلي (الشكل3). أدى مزيج من هذه الطرق الثلاث في المتوسط ​​من 49 وحدة macrocyclic يجري مترافق إلى dendrimer G4، والتي تتطابق مع ~ 75٪ سطح الأمينات الإشغال المجموعة.

وتضمن المزيد من توصيف لمجمع dendrimeric تحديد القيم relaxivity، مما أدى إلى 6.2 ± 0.1 مم -1 ثانية -1 في كلمة المدير العام (III) (أو ما يقرب من حوالي 300 ملي ثانية -1 -1 في dendrimer) لrelaxivity الطولي و 30.5 ± 0.6 ملي -1 ثانية -1 في كلمة المدير العام (III) (تقريبا 1500 ملي -1 -1 ثانية في dendrimer) لrelaxivity عرضية. وأشارت القياسات DLS قطر الهيدروديناميكية 7.2 ± 0.2 نانومتر لDCA (الشكل 4).

وأخيرا، للتدليل على تأثير عامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي dendrimeric، تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي على مجموعتين من الأشباح مع دائرة الطيران المدني وعيادةGdDOTA متاح حليف للمقارنة (الشكل 5). تم إعداد أول مجموعة من الأشباح لغرض المقارنة بين هذه عوامل التباين اثنين على تركيزات متطابقة كلمة المدير العام (III)، في حين تم تصميم المجموعة الثانية لإظهار تأثير على تركيزات جزيء المقارنة لعوامل التباين dendrimeric وأحادى، على التوالي.

شكل 1
الشكل 1: توليف macrocyclic DOTA من نوع خالب 4. الكواشف والشروط والعوائد معزولة: (ط) ثالثي -butyl 2-برومو-4- (4-nitrophenyl) butanoate، K 2 CO 3، DMF، 45 ° C ، 16 ساعة، 72٪، (ب) H 2، PD / C، ETOH، RT، 16 ساعة، 95٪، (ج) CSCL 2، إت 3 N، RT، 2 ساعة، 53٪. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا فاي جوري.

الشكل 2
الشكل 2: توليف dendrimeric وكيل التصوير بالرنين المغناطيسي النقيض DCA الكواشف والشروط: (أ) 4، إت 3 N، DMF، 45 ° C، 48 ساعة، 91٪،. (ب) حمض الفورميك، 60 ° C، 24 ساعة، ضليع في الرياضيات. (ج) GdCl 3 ∙ 6H 2 O، ودرجة الحموضة 7.0، RT، 24 ساعة، 71٪. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: توصيف المنتج dendrimeric بواسطة MALDI-TOF الطيف الكتلي الحصول على MALDI-TOF الطيف الكتلي نموذجي لDCA.r يمكنك الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: توصيف المنتج dendrimeric عن طريق نثر دينامية ضوء (DLS) قياس DLS من DCA (HEPES، ودرجة الحموضة 7.4) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: في التجارب المختبرية التصوير بالرنين المغناطيسي على الأشباح أنبوب في 7 T المجال المغناطيسي (أ، ب) T 1 -weighted و (ج، د) T 2 -weighted التصوير بالرنين المغناطيسي من دائرة الطيران المدني وGdDOTA. تم تنفيذ كل تجربة التصوير بالرنين المغناطيسي مع اثنين من تركيزات مختلفة من وكيل النقيض: (أ، ج) مع مقارنة كلمة المدير العام (ثالثا) تركيزات (HEPES، ودرجة الحموضة 7.4)؛ (ب، د) مع دائرة الطيران المدني: نسبة تركيز GdDOTA من 1: 5 (HEPES، ودرجة الحموضة 7.4). يتم التعبير عن التركيزات في جزيء ويتم عرض القيم SNR في الأقواس. كانت المعايير المستخدمة في هذه التجارب: مجال للرأي (فوف) = 40 × 40 مم 2، شريحة سمك = 0.5 مم، وعدد من الإثارات (NEX) = 30؛ (أ) حجم المصفوفة (MTX) = 256 × 256، والوقت التكرار (TR) = 100 ميللي ثانية، والوقت الصدى (TE) = 2.95 ميللي ثانية، الوجه زاوية (FA) = 90 درجة، اكتساب الوقت (TA) = 12 دقيقة 48 ثانية . (ب) MTX = 256 × 256، TR / TE = 20 / 2.95 ميللي ثانية، اتحاد كرة القدم = 90 درجة، TA = 2 دقيقة 34 ثانية؛ (ج) MTX = 512 × 512، TR / TE = 10000/130 ميللي ثانية، عامل نادر (RF) = 16، TA = 26 دقيقة و 40 ثانية؛ (د) MTX = 512 × 512، TR / TE = 10000/100 ميللي ثانية، RF = 16، TA = 26 دقيقة و 40 ثانية.776fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إعداد وكيل التصوير بالرنين المغناطيسي النقيض dendrimeric يتطلب الاختيار المناسب للوحدة أحادى (أي خالب للكلمة المدير العام (III)). أنها تقلل من سمية هذه أيون ممغطس، وحتى الآن، ومجموعة متنوعة واسعة من اسيكليك وchelators macrocyclic تخدم هذا الغرض 1-3. ومن بين هؤلاء، macrocyclic chelators DOTA من نوع تمتلك أعلى الاستقرار الحرارية وهمود الحركي، وبالتالي، هي الخيار الأكثر تفضيلا لإعداد التصوير بالرنين المغناطيسي خامل عوامل التباين 1،18. وعلاوة على ذلك، فهي عرضة لمختلف التحولات الاصطناعية، مما يؤدي إلى chelators bifunctional، وقادرة على ربط جزيئات وظيفية مختلفة (على سبيل المثال، ناقلات استهداف أو ناقلات النانو) في حين لا يزال تشكيل كلمة المدير العام مستقر (III) مجمعات 19. ولهذه الغاية، تم إعداد وحدة أحادى DOTA من نوع الموضحة في هذا الإجراء من DO3A- استر ثلاثي -butyl، والسلائف المشترك ومتاحة بسهولة، ومشتق من بروميدو4- (4-nitrophenyl) حمض البوتانويك. ويستمد هذا الجزيء من DOTA وتمتلك بنية مماثلة لتنسيق كلمة المدير العام (III). ويهدف التعديل الاصطناعية لجعل هذا خالب عرضة للاقتران ردود الفعل على جزيئات وناقلات وظيفية مختلفة. وهي إعداد نتائج جزيء المعدلة DOTA في خالب لا يزال مع أربع مجموعات الكربوكسيل المتاحة للتنسيق لكلمة المدير العام (III) لتشكيل خاملة مجمع وجماعة nitrophenyl المتعامدة، والتي عند التحويل تولي هذا خالب إلى السطح dendrimer. هذا الإجراء يسمح أيضا المرونة في اختيار من مجموعة رد الفعل متعامدة (على سبيل المثال، NH 2 أو COOH)، والتي يمكن أن تعمل على الزوجين خالب كلمة المدير العام (III) إلى الناقل المطلوب بطريقة المفضلة.

وخالب bifunctional التي تم الحصول عليها يمكن أن يقترن إلى جزيئات أخرى بطريقتين مختلفتين (أي إجراءات الاصطناعية). عندما يتم خفض مجموعة نيترو إلى مجموعة الأمينية، ويمكن للالأنيلين الناتجة تحتالذهاب رد فعل التكثيف مع مجموعة حمض الكربوكسيلية للجزيء آخر 8. وعلاوة على ذلك، وهي جماعة وظيفية العطرية أمين الرئيسي في وجود thiophosgene يمكن تحويلها بسهولة إلى ثيوسيانات، وهي المجموعة التي يتفاعل بسهولة مع الأمينات في المذيبات العضوية القطبية وكذلك المياه، وتقديم المزيد من الإمكانيات رد فعل للاقتران وحدات أحادى إلى dendrimers 17 ، 20،21.

لاقتران خالب bifunctional إلى الناقل dendrimeric، ينبغي اختيار سقالة dendrimeric المناسبة. ينبغي أخذها في الاعتبار عدة عوامل لها علاقة بنية dendrimer المترافقة النهائي والتطبيق المطلوب لفي هذه الخطوة. نظرا لتوافر التجاري واسعة من شركات dendrimeric، المنتجات مع مختلف الهياكل الأساسية، ومجموعات رد الفعل السطحية، أو أجيال ويمكن اختيار. ونتيجة لذلك، فإن رد فعل الاقتران تعتمد على مجموعة سطح dendrimer ومجموعة متعامدة من خالب، في حين أنقد تكون المكورات النهائي محايدا، مشحونة، أو لديها أحجام مختلفة (تصل إلى 15-20 نانومتر، وهذا يتوقف على توليد dendrimer) 22. ينبغي أن تؤخذ جميع هذه الجوانب بعين الاعتبار قبل إعداد CA dendrimeric، لأنها قد تؤثر على الذوبان، relaxivity (MRI تعزيز إشارة)، ونشرها، والخصائص الدوائية الأخرى من وكيل النقيض من ذلك، وهو ما قد يعرض للخطر تطبيقها في التصوير بالرنين المغناطيسي. على سبيل المثال، قد dendrimers الموجبة تظهر سمية في النظم البيولوجية. ومع ذلك، وهذا التأثير يمكن الحد من اقتران مجموعات سالبة الشحنة على سطح dendrimer، وبالتالي الحد من تهمة الإيجابي العام على 23.

في هذا البروتوكول، ونحن على استعداد للعامل تباين dendrimeric DCA باستخدام الإجراء الذي اقترن مجموعة ثيوسيانات من macrocycle أحادى 4 إلى cystamine النواة G4-PAMAM التجارية مجهزة 64 مجموعة سطح أمين الابتدائية. تنقية الأولية للhydrophتم إجراء obic المنتج dendrimeric 5 بواسطة اللوني هلام باستخدام عمود مع محبة للدهون المتوسطة هلام الترشيح والميثانول كما شاطف من أجل إزالة معظم وحدات أحادى غير المتفاعل. التحلل المائي للاسترات ر -butyl مع حمض الفورميك واضح ومباشر، مما أدى إلى منتج dendrimeric للذوبان في الماء يمكن تنقيته مع اللوني الحجم استبعاد استخدام ماء المتوسطة هلام الترشيح. تم إجراء complexation من chelators multimeric وdendrimeric مع كلمة المدير العام (III) مع الحفاظ على الحل في الرقم الهيدروجيني محايدة من أجل تسهيل تشكيل تعقيدا. خلاف ذلك، وcomplexation من كلمة المدير العام (III) (المضافة مثل الملح كلوريد) يقلل من درجة الحموضة، وتباطؤ رد الفعل. وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن المجموعات أمين في قلب dendrimer تميل أيضا إلى التنسيق مع كلمة المدير العام (III)، ولكن فقط مع الزيادة التي لا يمكن بالكلاب مع الوحدات DOTA. تجنب وجود كلمة المدير العام (III) خارج خالب DOTA أمر ضروري، منذ جنيهakage ش ج (ثالثا) من كاليفورنيا قد يكون لها آثار غير مرغوب فيها. وهي، فإنه يمكن أن تحفز سمية في الجسم الحي 18. الزائدة كلمة المدير العام (III) يمكن إزالتها بشكل فعال من قبل complexation مع EDTA تليها الترشيح الفائق من GdEDTA وEDTA مجانا باستخدام 3 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع (MWCO) مرشحات. يمكن أن تستخدم مرشحات MWCO أقل عندما يكون تقارن dendrimeric أقل الأوزان الجزيئية.

هناك نوعان من استكشاف مشكلات رئيسية تتعلق إعداد DCA. ويرجع ذلك إلى تأثير توسيع كبير من كلمة المدير العام (III) على إشارات الرنين المغناطيسي النووي، وتحليل DCA عن طريق الرنين المغناطيسي الطيفي ليست غنية بالمعلومات. بدلا من ذلك، يجب أن يتم تنفيذ هذا التحليل في الخطوات السابقة (مركبات 5 و 6). المقبل، واقتران وحدات monomacrocyclic إلى السطح dendrimer يتم أبدا تحقيق ذلك مع تحويل 100٪، ولكن من المرجح أن يكون بين 50-90٪ (أنظر أدناه). عادة، يمكن زيادة غلة رد فعل بإضافة جزء الثاني من monomeriاكتمال ج وحدة رد الفعل بعد الاقتران الأول من dendrimer وحدة أحادى 24. ومع ذلك، كل النتائج إعداد دفعة بأعداد متوسط ​​مختلفة إلى حد ما من chelators مترافق على سطح dendrimer، حتى عندما تستخدم dendrimer وDOTA حدات متطابقة كمواد للاقتران. على الرغم من أن المبلغ النهائي للكلمة المدير العام (III) الحالي في DCA يمكن تحديد بشكل مستقل عن طريق أسلوب BMS (انظر القسم 2.2)، لتوصيف أفضل لتقارن dendrimeric، فمن الضروري إجراء تقييم وحدات أحادى المربوطة في كل مرة دفعة جديدة من يتم إعداد DCA (انظر 2.1 والمناقشة أدناه).

توصيف تحليلي للمنتجات dendrimeric معزولة لا يمكن أن يؤديها من خلال 1 H مطيافية الرنين النووي المغناطيسي (فقط على المنتجات 5 و 6)، تحليل العناصر، وMALDI-TOF MS. عائدات نموذجية لتحويل مجموعات سطح الأمينية تقع بين 50-90٪، اعتمادا على الجيل dendrimerعلى، نوع من خالب، وظروف التفاعل المستخدمة (المذيبات ودرجة الحرارة) 6،20،24،25. في هذه الحالة بالذات، والجماهير المحسوبة التي تم الحصول عليها من التحليلات مجتمعة تتوافق مع ما معدله 49 يخلب أحادى يجري بالإضافة إلى dendrimer (أي ~ 75٪ الإشغال من الأمينات سطح dendrimer). وعلى الرغم من عدم تطابق طفيف في العدد النهائي للمجموعة الأمينية رد فعل يمكن توقع بين هذه المنهجيات 25، وتقدم مقارنة بهم مباشرة أدلة معقولة لتشكيل DCA المطلوب مع متوسط معين عدد من الوحدات مخلبية المرفقة.

توصيف في المختبر بهدف تقييم إمكانات DCA لتعزيز التباين في تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي يتكون من دائرة الأراضي والمساحة، relaxometric، وتجارب التصوير بالرنين المغناطيسي. تم تحديد قطرها الهيدروديناميكية من دائرة الطيران المدني أن يكون 7.2 ± 0.2 نانومتر بواسطة القياسات DLS، وهو ما يتفق مع تقارن ذكرت سابقا من هذا النوعمع الجيل G4 4 PAMAM dendrimers 26. وجاء تحديد relaxivity الطولي للDCA الإجراء الموضح سابقا 15 وكشف قيمة 6.2 ± 0.1 مم -1 ثانية -1 في كلمة المدير العام (III). حوالي 50٪ من تعزيز في ص 1 من ممغطس كلمة المدير العام (III) في DCA نسبة إلى جزيئات صغيرة الحجم من نوع مماثل (على سبيل المثال، GdDOTA) يمكن تفسيره مع حجم الوسيط لعامل تباين dendrimeric. وهي انخفاض حركة ش ج-يخلب تعلق على السطح dendrimer يزيد من وقت ارتباط التناوب، وبالتالي، ص 1؛ لا يزال هذا التأثير يجب مراعاتها في حقول مغناطيسية عالية للعملاء أصغر نانو الحجم. على خلاف ذلك، فإن الزيادة في الوقت ارتباط التناوب تساهم يغلب على ص 1 تعزيز في المجالات المغناطيسية المنخفضة 27. من ناحية أخرى، كان حجم كيل النقيض dendrimeric تأثير واضح على من الحقيقية عرضيةxivity 28، مما أدى إلى قيمة 30.5 ± 0.6 مم -1 ثانية -1 في كلمة المدير العام (III). وباختصار، فإن أساليب التقييم في المختبر من DCA هي واضحة وتتطلب إعداد عينة فقط دقيق، لذلك لا يتوقع حدوث صعوبات عند الحصول على البيانات وتحليل النتائج.

للتدليل على أداء عامل تباين dendrimeric وسعها لتؤثر على النقيض من الصورة، أجرينا تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي على الأشباح أنبوب مع وكيل النقيض من ذلك أعدت حديثا DCA. كنا أيضا حلا لعامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي المتاحة تجاريا وافق سريريا، GdDOTA، وعلى سبيل المقارنة وأنابيب مع الماء كعنصر تحكم. في تي الأول 1 -weighted التصوير بالرنين المغناطيسي التجربة، عندما استخدمت متساوية كلمة المدير العام (ثالثا) تركيزات (0.5 أو 1 (الثالث) في DCA أو GdDOTA ملي ش ج)، ودائرة الاستخبارات الوطنية في الأنابيب مع DCA بالفعل ما يصل إلى 12٪ أعلى نتيجة لزيادة بنحو 50٪ في relaxivity الطولي للDCA مقارنة GdDOTA (Figure 5A). تم تصميم الثانية T 1 -weighted تجربة التصوير بالرنين المغناطيسي لإظهار تأثير DCA عندما تم حساب تركيزات في الجزيء. وعلى الرغم من تطبيق 5 مرات أقل DCA مقارنة GdDOTA (50 مقابل 250 ميكرومتر أو 100 مقابل 500 ميكرومتر DCA مقابل GdDOTA، على التوالي)، وتحميل عالية من DCA مع كلمة المدير العام (III) أدى إلى زيادة كبيرة في تباين الصورة، وهذا بدوره أدى إلى القيم SNR المرصودة كانت أعلى ثلاث مرات على الأقل في أنابيب الوهمية مليئة DCA. متوقعا، عرضت كل من T 2 -weighted تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي كبيرة الخلافات (3-20 مرات) في SNR بين أنابيب الوهمية مليئة DCA وGdDOTA.

في الختام، يصف هذا البروتوكول على إعداد مناسب للCA dendrimeric للتصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام إجراءات الاصطناعية مشتركة لتوفير DCA مع خصائص محسنة مقارنة بحجم صغير المصدقة. المعارض DCA فضلت الاستقرار الحرارية وهمود الحركي مقارنةلنظائرها في كاليفورنيا أحادى. ومع ذلك، فإن multivalency من دائرة الطيران المدني، وبالتالي، فإن تركيز المحلية عالية من الأنواع ممغطس في المنطقة المستهدفة الحث على النقيض من ارتفاع في صور الرنين المغناطيسي. وبالنظر إلى الخصائص الدوائية غالبا المفضلة (على سبيل المثال، أطول الأنسجة الوقت الاحتفاظ) بالمقارنة مع نظائرها CA أحادى، أو القدرة على تحمل مزيد من الوظائف (على سبيل المثال، ناقلات المستهدفة)، وتمثل هذه تقارن dendrimeric-macrocycle فئة واعدة والقيمة من عوامل التباين ل مختلف التصوير بالرنين المغناطيسي في المستقبل وتطبيقات التصوير الجزيئي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyclen CheMatech C002
tert-Butyl bromoacetate  Alfa Aesar A14917
N,N-Dimethylformamide Fluka 40248
Potassium carbonate Sigma-Aldrich 209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid Aldrich 335339
Thionyl chloride  Acros Organics 382662500 Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine Acros Organics 402841000 Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled 
Diethyl ether any source
Sodium sulphate Acros Organics 196640010
Chloroform  VWR Chemicals 22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate Aldrich 364789 Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate Acros Organics 174560250 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate Acros Organics 424270010
Ethyl-acetate any source For column chromatography
n-Hexane any source For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus Büchi Model type: Glass oven B-585
Silicagel Carl Roth GmbH P090.2
Methanol any source For column chromatography
Dichloromethane  any source For column chromatography
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
Ammonia Acros Organics 428381000 7 N Solution in Methanol
Palladium Aldrich 643181 15% wet
Hydrogenation apparatus PARR PARR Instrument Company
Celite 503 Aldrich 22151
Sintered glass funnel any source
Thiophosgen Aldrich 115150 Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine Alfa Aesar A12646
Dichloromethane  Acros Organics 348460010 Extra dry 
Magnetic stirrer any source
PAMAM G4 Dendrimer Andrews ChemService AuCS - 297 10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20 Sigma LH20100
Thin-layer chromatography plates Merck Millipore 1.05554.0001
Formic acid VWR Chemicals 20318.297
Lophylizer  any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate Aldrich G7532
Sodium hydroxide Acros Organics 134070010
pH meter any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Aldrich E5134
Mass spectrometer (ESI) Agilent Ion trap SL 1100 
Acetate buffer any source pH 5.8
Xylenol orange Aldrich 52097 20 μM in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15 GE Healthcare 17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Merck Millipore UFC900324 Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge any source
NMR spectrometer  Bruker Avance III 300 MHz
Topspin Bruker Version 2.1
Combustion analysis instrument EuroVector SpA EuroEA 3000 Elemental Analyser 
MALDI-ToF MS instrument Applied Biosystems Voyager-STR
Deuteriumoxid Carl Roth GmbH 6672.3
tert-Butyl alcohol Carl Roth GmbH AE16.1
Vortex mixer any source
Norell NMR tubes Deutero GmbH 507-HP-7
NMR coaxial tube Deutero GmbH coaxialb-5-7
DLS instrument Malvern Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE filter  Carl Roth GmbH KC94.1
HEPES Fisher BioReagents BP310
Plastic tube vials any source
Dotarem Guerbet NDC 67684-2000-1
MRI scanner Bruker BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil Bruker Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software) Bruker Version 5.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , Wiley. (2013).
  2. Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
  3. Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
  4. Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
  5. Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
  6. Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
  7. Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
  8. Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
  9. Vogel, A. I., Furniss, B. S. Vogel's textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , Longman. (1989).
  10. Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , Wiley-VCH. (2013).
  11. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
  12. Keeler, J. Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , Wiley. (2010).
  13. Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , Wiley-VCH. (2007).
  14. Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
  15. Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844 (2011).
  16. Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
  17. Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
  18. Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
  19. Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
  20. Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
  21. Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
  22. Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
  23. Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
  24. Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
  25. Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
  26. Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
  27. Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
  28. Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).

Tags

الكيمياء، العدد 118، يخلب، عوامل التباين، dendrimer، الجادولينيوم، التركيب العضوي، والتصوير بالرنين المغناطيسي، ومواد النانو
إعداد و<em&gt; في المختبر</em&gt; توصيف وكلاء التباين القائم Dendrimer للتصوير بالرنين المغناطيسي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gündüz, S., Savić,… More

Gündüz, S., Savić, T., Toljić, Đ., Angelovski, G. Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54776, doi:10.3791/54776 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter