Preparazione e<em> In Vitro</em> Caratterizzazione del dendrimero a base di agenti di contrasto per risonanza magnetica
Summary
Questo protocollo descrive la preparazione e caratterizzazione di un agente di contrasto dendrimerica risonanza magnetica (MRI) che porta chelati macrociclici cyclen basati coordinamento ioni paramagnetici gadolinio. In una serie di esperimenti in vitro MRI, questo agente prodotto un segnale RM amplificato rispetto all'analogo monomerica disponibile in commercio.
Abstract
complessi paramagnetici di gadolinio (III) con aciclico o chelati macrociclici sono gli agenti di contrasto più comunemente usati (CAS) per la risonanza magnetica (MRI). Il loro scopo è quello di migliorare la velocità di rilassamento dei protoni dell'acqua nel tessuto, aumentando così il contrasto dell'immagine MR e la specificità delle misurazioni MRI. mezzi di contrasto clinicamente approvati attuali sono molecole a basso peso molecolare che sono rapidamente eliminato dal corpo. L'utilizzo di dendrimeri come portatori di chelanti paramagnetiche possono giocare un ruolo importante nel futuro sviluppo di agenti di contrasto per MRI più efficienti. In particolare, l'aumento della concentrazione locale dei paramagnetici risultati specie in contrasto segnale più alto. Inoltre, questa CA fornisce un tempo di ritenzione del tessuto più grazie al suo elevato peso e dimensione molecolare. Qui, dimostriamo un procedimento conveniente per la preparazione di agenti di contrasto MRI macromolecolari a base di poli (amidoamine) (PAMAM) dendrimeri con monomacrociclici DOTA tipo chelanti (DOTA – 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetato). L'unità chelante è stato aggiunto sfruttando la reattività del gruppo isotiocianato (NCS) verso i gruppi superficiali ammina del dendrimero PAMAM per formare ponti tiourea. prodotti dendrimerici sono stati purificati e analizzati mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, spettrometria di massa e analisi elementare. Infine, ad alta risoluzione immagini RM sono state registrate e contrasti segnale ottenuto dal dendrimero preparato e agenti monomeriche disponibili in commercio sono stati confrontati.
Introduction
La risonanza magnetica (MRI) è una tecnica di imaging potente e non ionizzanti ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica e diagnostica clinica per la sua natura non invasiva e un eccellente contrasto dei tessuti molli intrinseca. I metodi MRI più comunemente utilizzati utilizzano il segnale ottenuto da protoni dell'acqua, fornendo immagini ad alta risoluzione e informazioni dettagliate all'interno dei tessuti a base di differenze di densità dei segnali acqua. L'intensità del segnale e la specificità degli esperimenti di risonanza magnetica possono essere ulteriormente migliorate utilizzando mezzi di contrasto (CA). Questi sono specie paramagnetiche o superparamagnetiche che influenzano il longitudinale (T 1) e trasversale (T 2) tempi di rilassamento, rispettivamente 1,2.
Complessi di lantanidi gadolinio ionico con poliamminici ligandi acidi policarbossilici sono i più comunemente usati T 1 CA. Gadolinio (III) accorcia il rilassamento T 1tempo di protoni dell'acqua, aumentando così il contrasto del segnale in esperimenti MRI 3. Tuttavia, gadolinio ionica è tossico; le sue dimensioni approssima quella del calcio (II), e colpisce seriamente calcio assistita segnalazione nelle cellule. Pertanto, aciclici e macrociclici chelati sono impiegati per neutralizzare questa tossicità. Vari leganti multidentati sono stati sviluppati finora, con conseguente gadolinio complessi (III) con elevata stabilità termodinamica e cinetica inerzia 1. Quelli basati sul Cyclen azamacrocycle 12-membered, in particolare la sua tetracarbossilico DOTA derivata (1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetato) sono complessi più studiati e applicati di questa classe CA.
Tuttavia, GdDOTA tipo CA sono sistemi a basso peso molecolare, che mostrano alcuni svantaggi come l'efficienza e basso contrasto escrezione renale veloce. Macromolecolare e polivalente CA possono essere una buona soluzione a questi problemi 4. Dal momento che CA biodistribuzione è determinata principalmente dalla loro dimensione, CA macromolecolari mostrano tempi di ritenzione molto più lunghi all'interno dei tessuti. Ugualmente importante, il multivalenza di questi agenti si traduce in un aumento della concentrazione locale della sonda monomerica MR (ad esempio, complessi GdDOTA), migliorando sostanzialmente il segnale MR acquisite e la qualità della misura.
I dendrimeri sono tra i ponteggi preferite per la preparazione di polivalente CA per MRI 4,5. Queste macromolecole altamente ramificate con determinate dimensioni sono inclini a varie reazioni di accoppiamento sulla loro superficie. In questo lavoro, si segnala la preparazione, purificazione e caratterizzazione di una CA dendrimerica per la risonanza magnetica costituito da un 4 (G4) poli generazione (amidoamine) (PAMAM) dendrimero accoppiato ad chelati GdDOTA-like (DCA). Descriviamo la sintesi del reattiva derivata DOTA e il suo accoppiamento con il dendrimero PAMAM. Su complessazione con Gd (III), la caratterizzazione chimico-fisica di serie Operazire di DCA è stata eseguita. Infine, gli esperimenti di risonanza magnetica sono stati eseguiti per dimostrare la capacità di DCA di produrre immagini RM con un contrasto più forte di quelli ottenuti da basso peso molecolare CA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preparazione del mezzo di contrasto MRI dendrimerica richiede appropriata selezione dell'unità monomerica (cioè, il chelante per Gd (III)). Essi riducono la tossicità di questo ione paramagnetico e, ad oggi, una grande varietà di aciclici e chelanti macrociclici servire a questo scopo 1-3. Tra questi, macrociclici DOTA tipo chelanti possiedono la massima stabilità termodinamica e cinetica inerzia e, quindi, sono la scelta più preferito per la preparazione di agenti di contrasto per MRI iner…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The financial support of the Max-Planck Society, the Turkish Ministry of National Education (PhD fellowship to S. G.), and the German Exchange Academic Service (DAAD, PhD fellowship to T. S.) are gratefully acknowledged.
Materials
| Cyclen | CheMatech | C002 | |
| tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
| Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
| Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
| Diethyl ether | any source | ||
| Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
| Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
| Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48 % BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
| Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
| n-Hexane | any source | For column chromatography | |
| Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
| Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| Methanol | any source | For column chromatography | |
| Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7N Solution in Methanol |
| Palladium | Aldrich | 643181 | 15 % wet |
| Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
| Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
| Sintered glass funnel | any source | ||
| Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
| Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
| Magnetic stirrer | any source | ||
| PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS – 297 | 10 % wt. solution in MeOH |
| Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| Lophylizer | any source | ||
| Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
| pH meter | any source | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
| Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
| Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
| Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
| Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
| Centrifuge | any source | ||
| NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | version 2.1 | |
| Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
| MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| Vortex mixer | any source | ||
| Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| Plastic tube vials | any source | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
| RF coil | Bruker | dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
| Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |
References
- Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, &. #. 2. 0. 1. ;. . The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , (2013).
- Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
- Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
- Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
- Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
- Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
- Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
- Vogel, A. I., Furniss, B. S. . Vogel’s textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , (1989).
- Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. . Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , (2013).
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
- Keeler, J. . Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , (2010).
- Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. . MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , (2007).
- Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
- Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844 (2011).
- Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
- Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
- Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
- Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
- Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
- Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
- Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let’s meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
- Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
- Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
- Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
- Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
- Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).
