Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Udnytte 3D Printing Technology til Flet MRI med Histologi: En protokol for Brain Skæring

Published: December 6, 2016 doi: 10.3791/54780
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 3, 2, 1
1Translational Neuroradiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Cerebral Microcirculation Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Viral Immunology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke

Summary

Det overordnede mål med denne protokol er at præcist at tilpasse magnetisk resonans imaging (MRI) image volumener med histologiresultater sektioner via oprettelsen af ​​skræddersyede 3D-printet hjerne indehavere og pålægsmaskine bokse.

Protocol

Al håndtering og procedurer beskrevet heri dyr blev udført i overensstemmelse med en protokol, der er godkendt af National Institute of Neurologiske og Stroke Animal Care og brug Udvalg. Hjerner blev indsamlet fra almindelige silkeaber (Callithrix jacchus) induceret til at udvikle EAE. 11 Hjerner blev opbevaret i 10% formalin i mellem 3 uger og et år efter eutanasi ved transcardial perfusion af 4% paraformaldehyd.

1. Postmortem MRI Forberedelse og Acquisition

  1. marmoset Brain
    1. Forbered en arbejdsstation med bomuldsgaze, en 50 ml centrifugerør, små spatler, ~ 30 ml af en fluorholdig olie, paraffin, og silkeabe hjernen.
    2. Fyld røret med den fluorerede olie og gaze til 20 ml mærket. Komprimere gaze for at fjerne luftbobler undervejs.
    3. Forsigtigt tør formalin fra overfladen af ​​hjernen med en papirserviet. Sæt hjernen med den frontale pol mod bunden afrøret. sikre forsigtigt hjernen i røret ved hjælp af mere gaze omkring sider til at fastsætte sin position. Se supplerende afsnit 11 for en metode til at skabe en MRI hjerne vugge til opsætning af yderligere MR-scanninger.
    4. Fyld resten af ​​røret med gaze og fluorerede olie. Fjern forsigtigt luftbobler undervejs. Fastgør hætten og forsegle rør med paraffin.
    5. Marker hætten på linje med den interhemispheric revne. Pak røret i en køkkenrulle og sæt det i spolen med mærket top-center.
    6. Anskaf 2D spin-ekko T2. Parametre angives i tabel 1.
    7. Åbn 10 anatomiske 150 mikron T2-weigted opkøb i Mipav og registrere til erhvervelsen 6 th.
      BEMÆRK: Registrering er en optimeret automatisk registrering 3,5D algoritme med 9 frihedsgrader, windowed sinc interpolation, normaliseret krydskorrelation omkostningsfunktion, med en Powells kalder Brent søgealgoritme. Rotationer blev udtaget fra 106; til -10 ° med grove rotationer forøgning 5 grader og fine rotationer forøgning 1 °. Så gennemsnittet af registrerede billeder: Utilities, billede lommeregner-Bulk billeder, Average.
  2. menneskelige hjerne
    1. Adskil forhjerne fra hjernestammen ved anvendelse af en nedskæring på niveau med midthjernen. 10 De halvkugler kan også være adskilt med et snit ned midterlinjen.
    2. Placer forhjernen i et cylindrisk rør med en halvkugleformet kuppel i den ene ende og en tud i den anden ende.
    3. Fyld røret med en fluoreret olie gennem tuden. Fjern luftbobler hjælp blid sug for ~ 30 min gennem tuden.
    4. Anskaf 3D T1-MPRAGE. Parametre angives i tabel 1.

2. Udpakning Brain Overflade: Mipav 7.2

  1. Åbn MRI i den koronale orientering.
  2. Vælg Algoritmer, Transformation værktøjer, Transform, Resample. Vælg Brugerdefineret størrelse og resample til Isotropic voxels: 0,1 x 0,1 x 0,1 mm. Gem resampled MRI som Brain_MRI_Resampled. Menneskelig: Resample at isotrope voxels 0,3 x 0,3 x 0,3 mm.
  3. Vælg Algoritmer, Filtre (rumlig), Ikke-lineær støjreduktion. Brug standardindstillingerne, skal du klikke på OK.
  4. Vælg Viser opslagstabel og klik på tærsklen knappen dobbelt. Træk skyderen på grafen for at dække hele hjernen.
  5. Vælg Algoritmer, segmentering, Threshold, Threshold hjælp min / max. Indtast værdien placeret i nederste venstre hjørne af intensiteten grafen (lige under skalaen) ind i feltet "Nedre grænse". Vælg "binær" i for output billedet type og fjern markeringen "invert tærskel."
  6. Vælg Algoritmer, Morfologiske, Fyld huller. Check "Process i 2.5D."
  7. Da dette er en MRI af hele hjernen, der er vist tomrum mellem baghjerne og cortex, der skal udfyldes. Menneskelige hjerne: springe dette trin.
    1. Ved hjælp af line VOI, tegne i en sammenhængmellem baghjerne og cortex på begge sider af hjernen på det mest laterale punkt. Fortsæt denne gennem hjernen.
    2. Vælg VOI, VOI konvertering, Alle til binær maske. Vælg Utilities, billede lommeregner. Vælg eller i rullemenuen operatør og vælg hjernen maske. Vælg "Fremme målbilledet type"
    3. Vælg Algoritmer, Morfologiske, Fyld huller. Check "Process i 2.5D"
  8. Gem den binære maske som Brain_Model.nii.
  9. Vælg Algoritmer, Uddrag overflade (marcherende kuber). Vælg maske billede, Gem som Brain_Model.ply.

3. Valg Skær Steder: Mipav 7.2

  1. Identificer væv af interesse eller udgangsposition. Beregn den tilsigtede plade tykkelse. I silkeabe hjerne, tælle 30 MRI skiver pr sektion og 5 MR skiver pr klinge hul, skaber 3 mm sektioner med 0,5 mm klinge huller, hvilket resulterer i ~ 3,5 mm plader. Menneskelige hjerne: 20 MR skiver pr afsnit, og fire MR slis pr klinge hul, skaber 6 mm sektioner med 1,2 mm klinge huller, hvilket resulterer i ~ 7.2 mm plader.
  2. Ved placeringen af ​​den første vinge kløften, klik på "kasse VOI" og derefter trække en boks over hjernen. Klik inde i feltet for at vælge den. Kopier og indsæt konturen for hver MRI skive svarer til hullet bladet.
  3. Spring fremad med antallet af MRI skiver svarende til afsnit tykkelse og kopiere og indsætte konturen svarende til den næste klinge hul. Gentag denne proces gennem hjernen.
  4. Vælg VOI, VOI Konvertering, Alt til Binary Mask. Gem som Blade_Gaps.nii.
  5. Vælg Algoritmer, Uddrag Surface (marcherende kuber), Mask billede, Blade_Gaps.ply.

4. Oprettelse MRI Blade Kort: Mipav 7.2

  1. Åbn Brain_MRI_Resampled og Blade_Gaps.nii billeder.
  2. Med den Blade_Gaps.nii billede valgt, vælg Hjælpeprogrammer, Image Math. Vælg Fremme billedtype og Multiply.Indtast 10.000 som værdien.
  3. Vælg Utilities, billede lommeregner. Vælg Tilføj, og vælg derefter det Brain_MRI_Resampled billede fra billedet dropdown boksen. Vælg Fremme destination billedtype.
  4. Gem billedet som Brain_BladeMap.nii.
  5. Ved at klikke på treplans opfattelse kan de steder, hvor hjernen bliver skiveskåret ses i tre ortogonale.

5. Import Brain og Blade Gap Overflader: Netfabb Professional

  1. Vælg del, Tilføj del. Vælg filerne Brain_Model.ply og Blade_Gaps.ply
  2. Vælg hjernen og klik på reparation mode. I reparation tilstand:
    1. Klik på valgknappen skallen, og derefter klikke på hjernen.
    2. Klik på knappen skifte valg til at vælge de andre masker. Klik på Fjern for at slette de andre masker.
    3. Klik på Anvend Reparation, og fjerne den gamle del.
  3. Højreklik på hjernen. Vælg træk. Klik påTil knap oprindelse. Optag de XYZ parametre, der vises. Disse oversættelse parametre for at opretholde klingen positionering oprettet i Mipav. Klik på Oversæt. Derefter lukke vinduet. (Klik ikke på at oversætte mere end én gang. Det vil oversætte igen med de samme parametre.)
  4. Vælg Blade_Gaps model. Højreklik på den del, og vælg Flyt. Indtast XYZ værdier, der tidligere er registreret i XYZ parametre bokse. Klik nu på Oversæt og lukke vinduet.
  5. Vælg Brain_Model model, og klik på Reparer mode. I reparation tilstand:
    1. Klik på valgknappen skallen, og derefter klikke på hjernen.
    2. Højreklik og vælg Smooth trekanter. Indtast 4-5 iterationer. Tjek Undgå volumen faldende. Menneskelige hjerne: 1-2 iterationer.
    3. Højreklik, og vælg Formindsk trekanter. Indtast 200000 i målet trekant tæller, og klik Udfør.
    4. Klik på Automatisk reparation, Standard reparation. Så Klik på Anvend Reparation
  6. Højreklik, Omdøb. Omdøb den glattede hjerne som Smoothed_Brain_Model.
  7. Vælg Smoothed_Brain_Model. Højreklik, Export, STL.

6. Redigering Brain konturer: Meshmixer

  1. Importer Smoothed_Brain_Model ind Meshmixer.
  2. Brug sculpting og udvælgelse værktøjer til at foretage justeringer masken. Redigeringer omfatter:
    1. Brug Sculpting værktøjer, Robust glat. Glat areal svarende til linien vois. Menneskelige hjerne: springe dette trin.
    2. Glatte overfladen af ​​cortex, der vil vende nedad i kassen.
    3. Glat væk små opslåede græstørv, der kunne have været skabt i meshing og redigeringsprocessen.
  3. Vælg Analyse, Inspector, Autorepair alle.
  4. Eksporter Smoothed_Brain_Model som Smoothed_Edited_Brain_Model.

7. Oprettelse af Brain Slicer Box: Netfabb Professional

  1. Vælg del, Tilføj del. Vælg den file Smoothed_Edited_Brain_Model.
  2. Vælg del, Tilføj del. Vælg derefter STL fil Brain Slicer Parts_Marmoset og klik på Åbn. Menneskelige hjerne: Brain Slicer Parts_Human (supplerende kode filer).
  3. Højreklik på den del, og vælg Udvidede, skaller til dele. Vælg hver del individuelt og højreklik for at omdøbe dem. (Ved at klikke på øjet ved siden af et objekt skjuler det eller gør det synligt.) Omdøb den store kasse Main, den lille boks Sub, og opskæring boksen Box_Cutout, den Hexagon form Blade_Holder_Main, den lille flad kasse Mikrotom Blade, og halv- rør objekt Cradle. Menneskelige hjerne: nej Blade_Holder_Main, Mikrotom Blade, eller Cradle.
  4. Skjul Main, Sub, Blade, Blade_Holder_Main, Mikrotom Blade, og Cradle og bruge shift-select for at vælge alle seks og Box_Cutout. Kun Box_Cutout og Smoothed_Edited_Brain_Model skal være synlige, men Smoothed_Edited_Brain_Model bør ikke vælges.
  5. Klikke og trække udvalgte dele for at justere boksen position i forhold til hjernen.
    1. Placer hjernen i midten af ​​boksen. Postion hjernen dybt nok i kassen til at blive stramt grebet, men ikke for dybt til at skabe udhæng, som forhindrer korrekt placering.
  6. Når placeret, kan hjernen kasse kontur testes for udhæng. Vælg Box_Cutout og Smoothed_Edited_Brain_Model. Vælg Boolean Operation.
    1. Klik på Smoothed_Edited_Brain_Model at tænde den rød.
    2. Vælg Boolean Subtraktion, og anvende beregningerne.
  7. Check hjernen kasse for udhæng, som ville forhindre hjernevævet bliver sikkert placeret ind i feltet. Hvis disse udhæng er til stede, justere hjernen, så det er mindre dybt inde i boksen. Hvis hjernen er i den ønskede dybde og udhænger til stede, se supplerende afsnit 10 for en løsning til at fjerne udhæng.
  8. Vælg Blade_Gaps model. Højreklik, vælg Flyt. Optag position Z-værdi, og luk derefter vinduet. Dette vil være positionen af ​​mest posteriore bladmellemrummet.
  9. Vælg Blade STL, der kom fra hjernen Slicer dele. Højreklik, vælg Flyt.
    1. Vælg Absolute oversættelse. Indtast Z-værdi fra 7,8. For X og Y-værdier, indtaste det tilsvarende værdi fra de nuværende position parameter kasser
  10. Vælg Blade STL. Højreklik, klik Duplicate.
    1. Check Arranger dele. Indtast det samlede antal vinger i den samlede optælling. Indtast det samme nummer i Z tæller kassen. Indtast plade tykkelse i Z hul. Klik på Duplicate. Hvis tykkelsen slab blev varieret, vil knivene skal placeres individuelt. Duplicate hver ny vinge fra den tidligere (flytter fra posterior til anterior)med z hul svarende til afsnittet tykkelse for denne sektion.
  11. Anbring Mikrotom Blade dele på nøjagtig de samme intervaller som bladene i pålægsmaskine ved at gentage trin 7.9 og 7.10 for Mikrotom Blade. Menneskelige hjerne: springe dette trin.
    1. Vælg Mikrotom Blade sammen med Blade_Holder_Main del og vælg Boolean Operation.
    2. Vælg alle bladene i Mikrotom Blade at fremhæve dem røde. Klik på Boolean subtraktion, og anvende beregningerne.
    3. Vælg Reparer mode. Udfør en udvidet reparation. Vælg anvende reparationen, og fjerne den gamle del.
    4. Omdøb del Blade Holder. Eksporter del som STL.
  12. Shift-vælg Smoothed_Edited_Brain_Model, alle Blade modeller skabt i det forrige trin, og Sub og Main. Klik på Boolean operation.
    1. Gør alle de dele, bortset fra Main red af seat der er valgt dem og klikke på pilen under den grønne boks til at flytte dem til rød.
    2. Vælg Boolean Subtraktion og vælg derefter anvende beregninger.
  13. Klik på reparation mode. I reparation tilstand:
    1. Markér afkrydsningsfeltet for udhæng og skarpe punkter. Disse kan udjævnes i Netfabb eller Meshmixer.
    2. Klik på Automatisk reparation Udvidede reparation. Så gælder reparation og fjerne den gamle del
  14. Højreklik på den reparerede hjerne boksen og omdøbe den Brain Slicer Box. Eksporter som en STL.

8. Udskrivning af Brain Slicer Box på Ultimaker 2

  1. Marmoset Brain: Cura
    1. Importer Brain Slicer Box i Cura.
    2. Vælg Roter og træk cirklen for at rotere kassen, så det er fladt på sengen.
    3. Juster udskriftsindstillingerne: 0,1 mm lag opløsning, 50% fyld tæthed, Raft.
    4. Vælg Gem Tool Sti til SD-kort. (Print tid ~ 12 timer.)
    5. Import Blade Holder itil Cura og drej den så slots er på siderne og sekskanten ansigt er i XZ eller YZ-planet.
    6. Dupliker objektet.
    7. Juster udskriftsindstillingerne: 0,2 mm lag opløsning, 20% fyld tæthed, randen.
    8. Vælg Gem Tool Sti til SD-kort. (Print tid ~ 3 timer)
  2. Menneskelig Brain: Cura
    1. Importer Brain Slicer Box i Cura og roterer som i 8.1.2.
    2. Juster udskriftsindstillingerne: 0,2 mm lag opløsning, 30-35% fyld tæthed, Raft.
    3. Vælg Gem værktøj sti til SD-kort. (Print tid ~ 70 timer for enkelt halvkugle boks.)
  3. På Ultimaker 2
    1. Påfør et tyndt lag lim stick lim til at bygge plade.
    2. Indsæt SD-kortet. Vælg print og vælge den del.

9. Skæring hjernen

  1. marmoset Brain
    1. Forbered en arbejdsstation med den faste hjerne, hjernen pålægsmaskine, to knivholdere, mikrotomknive og knive, 1 ml fluorerede olie, flat pincet, beskyttelseshandsker og indlejring kassetter.
    2. Placer nye mikrotomknive og knive ind i åbningerne på knivholderne. Kontroller den affasede kant af hvert blad vender i samme retning. Bær beskyttelseshandsker, når omgangen med mikrotomknive klinger.
    3. Fjern hjernen fra formalin og forsigtigt tør det.
    4. Placer hjernen ind i pålægsmaskine. Et par dråber af fluoreret olie kan anvendes til hjernen og slicer at muliggøre nem positionering. Sørg for, at hjernen er på plads.
    5. Placer knivholdere med knivene i de tilsvarende blade-slots.
    6. Tryk ned på knivholderne fast og anvende langsom balance pres for at skære gennem hjernen.
    7. Fjern hver plade, en ad gangen, begyndende fra forsiden af ​​hjernen. Det hjælper til at fjerne mikrotomens klinge foran en plade, før du fjerner pladen selv. Vær meget opmærksom på den forreste / bageste orientering af hver plade.
    8. Tag billeder af den forreste end bageste overflade af hver plade. De bageste plader vil sandsynligvis indeholde separate stykker, så være opmærksom på orientering af stykkerne til indlejring. Placer hver plade i en indlejring kassette og sætte dem alle i en 10% formalin løsning.
  2. menneskelige hjerne
    1. teste omhyggeligt pasningen af ​​hjernen i kassen.
    2. Skær hjernen startende fra den ene ende ved hjælp af et vinklet snit, langsomt men fast udskæring. Skær hjernen gennem hvert blad hul.
    3. Fjern hver plade en ad gangen, meget opmærksom på antallet og forreste / bageste orientering af hver plade.
    4. Tage billeder af den forreste og bageste overflade af hver plade. Placer plader i forseglede 10% formalin poser. Tissue blokke vil blive skåret fra pladerne og anbragt i kassetter til indlejring.

10. Fjernelse Udhæng i Brain Box (Supplerende afsnit)

  1. Trække skiver: Meshmixer
    1. Importer Smoothed_Edited_Brain_Model.
    2. Vælg Rediger, Få skiver. I Foretag skiver:
      1. Vælg Stacked 3D, Z, indtaste tykkelse 1-2 mm. Klik Compute. Når skiverne indlæse, skal du klikke på Accepter.
    3. Vælg 1 eller 2 skiver med store perimetre nær bunden af ​​cortex. Disse skiver bør være under niveauet for Sub boksen.
    4. Eksporter hver af disse skiver som Brain_Slice_ #.
  2. Udvidelse skiverne op for at fjerne udhæng: Netfabb Professional
    1. Importer Brain_Slice_ # skiver.
    2. Duplicate hver Brain_Slice_ # (fjern markeringen arrangere dele, hvis markeret).
    3. Højreklik på én kopi af hver Brain_Slice_ # og vælge Scale.
      1. Fjern markeringen Fast skalering forholdet. Derefter opskalere hjernen skive i Y-retningen, så det vil nå op på bunden af Sub boksen.
    4. Omdøb disse skiver Brain_Slice_Big_ #.
    5. Kontroller Y-positionen of den oprindelige Brain_Slice_ # ved at højreklikke på den del og vælge træk. Optag Y-positionen for hver af de oprindelige Brain_Slice_ # skiver.
    6. Udfør beregning: Brain_Slice_ # [y position] - (Brain_Slice_Big_ # [y size] - Brain_Slice _ # [y størrelse])
    7. Vælg hver af de Brain_Slice_Big_ # individuelt, højreklikke og vælge flytte.
      1. Indtast værdien beregnet ud fra 10.2.6 i Y oversættelse parameter kassen. For X og Z oversættelse parametre, indtaste værdierne ligger i de nuværende position parameter bokse. Vælg Absolute Translation. Klik på Oversæt og lukke vinduet.
        BEMÆRK: Brain_Slice_Big_ # skiver vil blive fratrukket sammen med hjernen og knive, når de foretager kassen.

11. Marmoset Brain MRI Cradle til Ekstra scanning

  1. Oprettelse af Brain MRI Cradle
    1. Sørge for, at den øverste overflade af CrADLE er i samme højde som Box_Cutout. Dybden og position af hjernen i vuggen skal være setup ligesom det er for pålægsmaskine.
    2. Shift-select for at vælge Smoothed_Edited_Brain_Model og Cradle.
    3. Vælg Boolean operation. Vælg hjernen til at fremhæve det røde, og vælg derefter Boolean subtraktion. Derefter anvende beregningerne. (Vælg Også Brain_Slice_Big_ # skiver hvis relevant.)
    4. Indtast reparation tilstand til at fjerne eventuelle skarpe spidser i vuggen kontur som tidligere gjort for pålægsmaskine. Vælg Udvidet reparation. Påfør reparationen, og fjerne den gamle del.
    5. Højreklik for at omdøbe den del MRI Brain Cradle. Vælg Export, STL.
  2. Udskrivning af vugge: Cura
    1. Importer MRI Brain Cradle ind Cura og drej den, så den flade del med hjernen udskæring vender opad.
    2. Juster udskriftsindstillingerne: 0,1 mm lag opløsning, 100% fyld tæthed, Raft.
      3. <li> Vælg Gem værktøj sti til SD-kort. (Print tid ~ 10 timer)
    3. Udskriv i Ultimaker 2 som beskrevet i 8.3.
  3. Erhvervelse høj opløsning T2 * MRI hjælp vuggen
    1. Forsigtigt tør formalin fra overfladen af ​​hjernen med en papirserviet.
    2. Placer hjernen i holderen som beskrevet for opskæringsmaskinen.
    3. Skub hjernen og holderen ind i 50 ml centrifugerør. Fyld den til randen med fluorholdige olie.
    4. Tryk forsigtigt på røret for at tillade luftbobler at undslippe fra hjernen. Sæt Cap Sæt ind i indsatte af røret hætten for at forhindre luftbobler dannes der. Fastgør hætten, og forsegle rør med paraffin.
    5. Reagensglasset anbringes spolen som tidligere beskrevet. 3D T2 * parametre er angivet i tabel 1.
    6. Åbn 18 anatomiske 100 micron T2 * vægtede opkøb i Mipav og registrere til købet 10 th. Registrering parametre er de samme som i 1.1.7. Gennemsnittet af registrerede billeder: Utilities, billede lommeregner-Bulk billeder, Average.

Representative Results

Arbejdsgangen af ​​denne fremgangsmåde er opsummeret i figur 1. Når hjernen skiver, en visuel sammenligning mellem de MR-billeder og billeder af de overfladiske overflader af pladerne viser en god orientering match tværs af flere plader (figur 2). Efter pladerne er indlejret i paraffin, er de i snit på en mikrotom og farvet. En mere grundig sammenligning mellem den høje opløsning postmortem MRI og de farvede histologiske sektioner viser en nøjagtig og konsistent match tværs af alle strukturerne i silkeabe hjernen (figur 3).

I denne dyremodel af MS, dyrene udvikle hvid substans læsioner spredt over hele cerebral hvide substans. Disse læsioner kan detekteres noninvasivt ved at udføre MRI. Figur 4 viser evnen hos denne teknik til at belyse den patologiske substrat af MR-fund. Små læsioner fundet på in vivo-MRI kanspores på både obduktion MRI og histologi. Som vist i indsatsene, demyelinisering inden læsionerne er en af ​​hovedkomponenterne køre MR-signalet ændring (hyperintensity forhold til omgivende væv). Den histologi og obduktion MR kan også vise læsioner besvaret, på in vivo MRI (figur 4).

figur 1
Figur 1. Arbejdsgang for at skabe en silkeabe hjerne pålægsmaskine boks. Hjernen er fast med formalin (A1) og en T2-vægtet MRI er erhvervet med isotrope voxels på 150 um pr kant (A2). Billederne behandles og tærsklingsbehandles at skabe en binær maske (A3). Overfladen bliver derefter gengives i 3D modeling software (A4). En boolesk subtraktion mellem en slicer skabelon og hjernen Modellen skaber en digital model af hjernen pålægsmaskine (B1). Hjernen pålægsmaskine boks er trykt på en 3D-printer (B2). Hjernen anbringes derefter fast i slicer boks tilskæring (B3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Fra venstre til højre: In vivo MRI, postmortem MRI, og væv slab fotografi. Udskæring fly blev etableret baseret på obduktion MRI (B) og visuelt i forhold til det tilsvarende in vivo MRI slice (A). Hjernen blev derefter skåret, og de resulterende plader blev fundet at være konsistente (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Høj opløsning postmortem MRI og histologisektion matching. Plader blev indlejret i paraffin, skåret med en mikrotom i 4 um snit og farvet med hurtig blå og cresylviolet (B). Snittene blev derefter visuelt matches med 100 um T2 * vægtede MRI baseret på hjernens strukturer (A). Detaljer for at erhverve dette billede er i supplerende afsnit i protokollen og Tabel 1. Brain strukturer: (1) Rød pil = intern kapsel, blå pil = forreste kommissurstiverne; (2) røde pil = putamen, blå pil = optisk tarmkanalen; (3) røde pil = caudatus, blå pil = hippocampus; (4) røde pil = corpus callosum, blå pil = cerebral akvædukt; (5) røde pil = ringere colliculus, blå pil = pyramideformede tarmkanalen. Den stiplede boks i B1 angiver en skive, hvor, enten under hjernen opskæring eller paraffin indlejring, forårsaget en fejl en svag rotation omkring Y-aksen, hvilket fører til misforhold mellem den forreste commissure til venstre. Klik her for at se enstørre version af denne figur.

Figur 4
Figur 4. Sporing læsioner fra in vivo MRI til histologi sektion. In vivo MRI viste ingen overbevisende tegn på abnorm hyperintensity signal at foreslå læsioner i enten optisk tarmkanalen (A1). Men den høje opløsning postmortem MRI viser, klare hyper intense linjer i begge optiske skrifter (A2). Den hurtige blå / cresylviolet plet af en 4 um histologi afsnit viser, at hyperintense områder ses på ex vivo MRI er demyeliniserede (A3). I den cerebrale hvide substans, in vivo MRI viser subtile hyperintensity bilateralt (B1, forstørret i mellemværker). De hyperintense områder er mere indlysende på den høje opløsning postmortem MRI (B2). Den LFB plet af en 4 um histologi afsnit viser, at disse områder er demyeliniserede (B3). Efter sammenligning med baseline in vivo MR og en hemotoxylin-og-eosin pletten, blev den højre side bestemt til at være en anatomisk abnormitet, ikke en demyeliniserede læsion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende kodefiler
Supplerende kodefiler. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl: Klik her for at downloade denne fil. Brain_Slicer_Parts_Human.stl: Klik her for at downloade denne fil. Cap_Insert.stl: Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Protokollen beskrevet her muliggør en nøjagtig sammenligning mellem MRI og histologi sektioner. Protokollen er præsenteret i en samlet format, der kan anvendes på hjerner fra mennesker eller små dyr såsom silkeaber og gnavere. Forskelle specifikke for store (menneske) og mindre (ikke-human primat og gnavere) hjerner er fremhævet, og i ledsagende video og tal, vi demonstrere anvendelsen i silkeabe. Selv om det synspunkt er ligetil, kræver fremgangsmåden mange trin samt anvendelse af flere typer af software. Desuden flere spørgsmål potentielt påvirker nøjagtigheden af ​​denne metode er vigtige at nævne.

Billedkvaliteten af in vivo MRI er en vigtig faktor. For at minimere forskellen i billedopløsningen mellem MR og digitaliserede histologiske billeder, bør anvendes den mindst mulige MRI voxel størrelse. Dette begreb gælder også for kvaliteten af ​​det postmortem MRI billede. Mens den øgedeerhvervelse tid i postmortem MRI tillader meget højere billedopløsning, forberedelse kan introducere billedartefakter såsom fokale signal dropouts relateret til luftbobler. Disse artefakter kan tilsløre områder af væv samt påvirke dens kontur. Endvidere er dimensionerne af vævet på obduktion MRI sandsynligvis vil blive berørt af fiksering proces og varighed. Mens in vivo til ex vivo MRI kamp kan tilnærmes ved at udnytte anatomiske landemærker i skive geometri setup under erhvervelse, ville en ikke-lineær registrering stadig være nødvendigt for at nå en højere grad af nøjagtighed i matchende disse to MRI-billeder.

Udformningen af ​​indehaveren af ​​hjernen og pålægsmaskine er også et afgørende skridt. Ved at skabe den digitale model af hjernen, er en udjævning algoritme anvendt denne lidt forstørrer model i forhold til den faste hjernen. Dette muliggør let indføring af hjernen i holderen og pålægsmaskine og reducerer skarpe kanter i holderen &# 39; s kontur. Men hvis modellen er for stor (fx med mere end 5%), hjernen kan bevæge sig under obduktion MR og / eller skæring. Et andet vigtigt punkt er at tilpasse designet af hjernen modellen, så cerebellum er korrekt placeret inden i 3D trykte objekt. Dette kan være særligt udfordrende, når lillehjernen er blevet beskadiget under hjernen ekstraktion ved obduktion.

Ved udskrivning hjernen pålægsmaskine og holder, skal den type 3D-printer også vælges med omhu. Nogle multi-jet printere kræver efterbehandling ved hjælp af en ovn til at fjerne støttemateriale. Mens disse printere kan producere objekter, der er vandtætte og relativt mere holdbart end desktop smeltet deposition modellering (FDM) printere, at opvarmningen fjerne understøtninger kan let slå kassen, skaber klinge huller, der ikke er helt vinkelret på hjernen kontur.

Hjernen sektionering er et andet afgørende skridt. Før skære the hele hjernen i plader, er det vigtigt at sørge for, at hjernen sidder stramt inde i hjernen pålægsmaskine: der bør være nogen bevægelse, når et let tryk påføres hjernen. Dette vil gøre det muligt for knivene til at skære gennem hjernen på det præcise sted fastsat af efterforskerne. En kontinuerlig, afbalanceret pres bør anvendes på både knivholderne når der skæres. Afhængigt af skarpheden af ​​bladene og stivheden af ​​væv, kunne en mindre tværgående skærebevægelse være fordelagtigt til opretholdelse af plane snitflader.

Den paraffin-embedding proces kan også være en kilde til misforholdet mellem MR og histologi. Hvis vævet plade ikke sidder fladt mod kassetten under indlejringsprocessen, vil der være en hældning mellem skæreplanet af mikrotomen og overfladen sted af pladen. Dette vil kræve at skære ubrugelige sektioner for at finde et fladt plan, i hvilket alle væv er udsat for. En måde at korrigere for tilter ved at ændre vinklen af ​​betragtningsplanet på high-isotrope opløsning postmortem MRI. Dette er imidlertid næsten umuligt at udføre på in vivo MRI, der normalt erhverves med anisotropisk opløsning (typisk tykke koronale skiver).

Endelig kan vævet opleve nogle deformation under formalin rentebindingsperiode og paraffin indlejring (svind), samt under udarbejdelsen af ​​dias (folde, revner, rynker). Nogle af disse deformationer kan korrigeres ved at sætte 4-5 um sektioner i et vandbad før overførsel på dias. Lign kan delvist løses ved at udføre deformerbare billede coregistration af de histologiske digitaliserede billeder til de postmortem MRI-billeder. Ikke desto mindre, minimerer deformationerne med omhyggelig og dygtig praksis er den mest effektive metode til at matche MRI volumener til histologi sektioner.

Afslutningsvis den metode indført her muliggør investigators præcist at vurdere den underliggende patologi MR-fund. Mere generelt er det en lovende metode til at identificere og / eller validere nye MRI biomarkører for forskningsundersøgelser, der er målrettet specifikke patologiske processer, såsom betændelse eller remyelinering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7T/30cm USR AVIII Bruker MRI Bruker Biospin
38 mm Bruker Biospin volume coil Bruker Biospin
Fomblin Solvay Solexis
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile Corning 21008-951
Fisherbrand Gauze Sponges Fisher Scientrific 13-761-52
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film Bemis
Leica RM2235 rotary microtome  Leica
Leica Disposable Blades, low profile (819) Leica
Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous Electron Microscopy Sciences 26089-01
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol Electron Microscopy Sciences 26056-15
ETOH
Ultimaker 2 Extended  Ultimaker
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA  Filament, 2.85 mm, Silver Metallic Ultimaker
Axio Observer.Z1 Zeiss
Zen 2 (Blue Edition) Zeiss
Netfabb Professional 5.0.1 Netfabb http://www.netfabb.com/professional.php
Meshmixer 10.9.332 Autodesk http://www.meshmixer.com/download.html
Mipav 7.2 NIH CIT http://mipav.cit.nih.edu
Cura Ultimaker https://ultimaker.com/en/products/cura-software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques. Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).
  2. 't Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man. Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).
  3. Ontaneda, D., Hyland, M., Cohen, J. A. Multiple sclerosis: new insights in pathogenesis and novel therapeutics. Annu Rev Med. 63, 389-404 (2012).
  4. Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets. J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).
  5. Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).
  6. Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in-vivo MRI for whole baboon brain. J Neurosci Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
  7. McGrath, D. M., Vlad, R. M., Foltz, W. D., Brock, K. K. Technical note: fiducial markers for correlation of whole-specimen histopathology with MR imaging at 7 tesla. Med Phys. 37, 2321-2328 (2010).
  8. Schormann, T., Zilles, K. Three-Dimensional linear and nonlinear transformations: An integration of light microscopical and MRI data. Hum Brain Mapp. 6, 339-347 (1998).
  9. Jiang, L., et al. Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model. NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).
  10. Absinta, M., et al. Postmortem magnetic resonance imaging to guide the pathologic cut: individualized, 3-dimensionally printed cutting boxes for fixed brains. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (8), 780-788 (2014).
  11. Gaitán, M. I., et al. Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging. Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).

Tags

Neuroscience Neuroscience menneske silkeabe hjerne MRI histologi 3D-print
Udnytte 3D Printing Technology til Flet MRI med Histologi: En protokol for Brain Skæring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luciano, N. J., Sati, P., Nair, G.,… More

Luciano, N. J., Sati, P., Nair, G., Guy, J. R., Ha, S. K., Absinta, M., Chiang, W. Y., Leibovitch, E. C., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning. J. Vis. Exp. (118), e54780, doi:10.3791/54780 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter