Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Utnytte 3D utskriftsteknologi til Merge MR med histologi: En protokoll for Brain Seksjonering

Published: December 6, 2016 doi: 10.3791/54780
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 3, 2, 1
1Translational Neuroradiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Cerebral Microcirculation Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Viral Immunology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke

Summary

Det overordnede målet med denne protokollen er å nøyaktig justere magnetic resonance imaging (MRI) bildevolumer med histologi seksjoner via etablering av tilpassede 3D-trykt hjerne holdere og slicer bokser.

Protocol

Alle dyr håndtering og prosedyrer som er beskrevet her ble utført i samsvar med en protokoll godkjent av National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag Animal Care og bruk komité. Hjerner ble samlet inn fra vanlige silkeaper (Callithrix jacchus) overtalt til å utvikle EAE. 11 Brains ble lagret i 10% formalin for mellom 3 uker og ett år etter avlivning av transcardial perfusjon av 4% paraformaldehyde.

1. Post mortem MR Forberedelse og oppkjøp

  1. marmoset Brain
    1. Fremstille en arbeidsstasjon med bomullsgas, et 50 ml sentrifugerør, små slikkepotter, ~ 30 ml av en fluorert olje, parafin, og marmosett-hjerne.
    2. Fyll røret med fluorerte olje og gas til 20 ml merket. Komprimer gasbind for å fjerne luftbobler underveis.
    3. Forsiktig tørr formalin fra overflaten av hjernen med et papirhåndkle. Sett hjernen med frontal stang mot bunnen avT-banen. sikre nøye hjernen i røret ved hjelp av mer gasbind rundt på sidene for å fikse sin posisjon. Referer til supplerende avsnitt 11 for en metode for å skape en MR hjernen vugge for oppsett av flere MR.
    4. Fyll resten av røret med gasbind og fluorerte olje. Fjern forsiktig luftbobler underveis. Fest lokket og forsegle røret med parafin.
    5. Marker cap i tråd med interhemispheric fissur. Pakk røret i et papirhåndkle og sett den inn i spolen med merket øverst i midten.
    6. Acquire 2D spin ekko T2. Parametre er gitt i tabell 1.
    7. Åpne 10 anatomiske 150 micron T2-vekting oppkjøp i Mipav og registrere den 6. oppkjøpet.
      MERK: Registrering er en optimalisert automatisk registrering 3.5D algoritme med 9 frihetsgrader, vindus sinc interpolasjon, normalisert krysskorrelasjon kostnadsfunksjonen, med en Powells ringer Brent søkealgoritme. Rotasjoner ble samplet fra 106; til -10 ° med grove rotasjoner inkrementering 5 grader og fine rotasjoner inkrementering 1 °. Deretter gjennomsnitt de registrerte bilder: Utilities, Bilde kalkulator-Bulk bilder, Average.
  2. menneskelige hjernen
    1. Skill brain fra hjernestammen ved hjelp av et kutt på nivået av midthjernen. 10 Den halvkuler kan også være atskilt med et kutt ned midtlinjen.
    2. Plasser forhjernen i et sylinderformet rør med en halvkuleformet kuppel i den ene enden og en tut i den andre enden.
    3. Fylle røret med en fluorert olje gjennom tuten. Fjern luftbobler ved hjelp av skånsom suge for ~ 30 min gjennom tuten.
    4. Innsamling av 3D T1-MPRAGE. Parametre er gitt i tabell 1.

2. Trekke Brain Overflate: Mipav 7.2

  1. Åpne MR i den koronale orientering.
  2. Velg Algoritmer, Transformation verktøy, Transform, for Oppdater. Velg Brukerdefinert størrelse og resample til Isotropic lydelementer: 0,1 x 0,1 x 0,1 mm. Lagre resampled MR som Brain_MRI_Resampled. Menneskelig: Resample til isotrope voxels 0,3 x 0,3 x 0,3 mm.
  3. Velg Algoritmer, Filtre (romlig), ikke-lineær støyreduksjon. Bruk standardinnstillingene, klikker du på OK.
  4. Velg Viser søketabellen, og klikk på den doble terskelen knappen. Dra glidebryteren på grafen for å dekke hele hjernen.
  5. Velg Algoritmer, segmentering, Threshold, Threshold bruker min / maks. Angi verdien som ligger i nedre venstre hjørne av intensiteten grafen (like under skalaen) i "Nedre grense" boksen. Velg "binær" i for type digitalbilde og fjern haken "invert terskel."
  6. Velg Algoritmer, morfologiske, Fyll hullene. Sjekk "Process i 2.5D."
  7. Fordi dette er en MR av hele hjernen, er det et tomrom mellom hindbrain og cortex som må fylles. Hjernen: hoppe over dette trinnet.
    1. Ved hjelp av linje VOI, tegne i en sammenhengmellom hindbrain og cortex på begge sider av hjernen på den laterale punktet. Fortsett denne gjennom hjernen.
    2. Velg VOI, VOI konvertering, All til binær maske. Velg Verktøy, Bilde kalkulator. Velg eller fra operatøren rullegardinmenyen og velg hjernen maske. Velg "Fremme målbildet type"
    3. Velg Algoritmer, morfologiske, Fyll hullene. Sjekk "Process i 2.5D"
  8. Lagre binær maske som Brain_Model.nii.
  9. Velg Algoritmer, Extract overflaten (marsj kuber). Velg maske bilde, Lagre som Brain_Model.ply.

3. Velge Slice Locations: Mipav 7.2

  1. Identifisere vev av interesse eller startposisjon. Beregn ment dekketykkelse. I marmoset hjernen, teller 30 MR skiver per avsnitt, og 5 MR skiver per blad gap, skaper 3 mm seksjoner med 0,5 mm blad hull, noe som resulterer i ~ 3,5 mm plater. Hjernen: 20 MR-skiver per avsnitt, og fire MR slICES per blad gap, skaper 6 mm seksjoner med 1,2 mm blad hull, noe som resulterer i ~ 7,2 mm plater.
  2. Ved plasseringen av første blad gap, klikk på "boksen VOI" og deretter tegne en boks over hjernen. Klikk på innsiden av boksen for å velge den. Kopier og lim inn kontur for hver MRI skive tilsvarer bladet gap.
  3. Hopp fremover med antall MR-skiver som tilsvarer den delen tykkelse og kopiere og lime konturen tilsvarer den neste blad gap. Gjenta denne prosessen gjennom hjernen.
  4. Velg VOI, VOI konvertering, alle for å Binary Mask. Lagre som Blade_Gaps.nii.
  5. Velg Algoritmer, Extract Surface (marsj kuber), Mask image, Blade_Gaps.ply.

4. Opprette MRI Blade Kart Mipav 7.2

  1. Åpne Brain_MRI_Resampled og Blade_Gaps.nii bildene.
  2. Med Blade_Gaps.nii bilde valgt, velger du Verktøy, Bilde Math. Velg Fremme bildetype og formere seg.Skriv inn 10000 som verdien.
  3. Velg Verktøy, Bilde Kalkulator. Velg Legg til, og velg deretter Brain_MRI_Resampled bilde fra bildet rullegardinmenyen. Velg Fremme målbildet type.
  4. Lagre dette bildet som Brain_BladeMap.nii.
  5. Ved å klikke på Triplanar visningen, kan de stedene hvor hjernen skal skiver sees i tre ortogonale utsikt.

5. Importere Brain og Blade Gap Overflater: Netfabb Professional

  1. Velg del, Legg til del. Velg filene Brain_Model.ply og Blade_Gaps.ply
  2. Velg hjernen og klikk på reparasjon modus. Reparasjon modus:
    1. Klikk på skallet valgknappen, og klikk deretter på hjernen.
    2. Klikk på byttevalg for å velge de andre maskene. Klikk på Fjern for å slette de andre maskene.
    3. Klikk på Apply reparasjon, og fjerne den gamle delen.
  3. Høyreklikk på hjernen. Velg trekk. Klikk påÅ opprinnelse knappen. Noter XYZ parametrene som vises. Disse oversettelses parametre er nødvendig for å opprettholde den skovelvinkelen satt opp i Mipav. Klikk på Translate. Deretter lukker vinduet. (Ikke klikk sette mer enn én gang. Det vil oversette igjen med de samme parametrene.)
  4. Velg Blade_Gaps modell. Høyreklikk på den delen, og velg Flytt. Skriv inn XYZ verdiene som er registrert tidligere i XYZ parametere boksene. Nå klikker Trans og lukke vinduet.
  5. Velg Brain_Model modell og klikk på Reparer-modus. Reparasjon modus:
    1. Klikk på skallet valgknappen, og klikk deretter på hjernen.
    2. Høyreklikk og velg Smooth trekanter. Skriv inn 4-5 iterasjoner. Sjekk Forhindre volumet krymper. Hjernen: 1-2 iterasjoner.
    3. Høyreklikk, velg Reduser trekanter. Skriv inn 200000 i målet trekant teller og klikk Utfør.
    4. Klikk på Automatisk reparasjon, Standard reparasjon. Deretter Klikk på Apply Repair
  6. Høyreklikk, Gi nytt navn. Gi nytt navn til glattet hjernen som Smoothed_Brain_Model.
  7. Velg Smoothed_Brain_Model. Høyreklikk, Export, STL.

6. Redigering Brain Contours: Meshmixer

  1. Importer Smoothed_Brain_Model inn Meshmixer.
  2. Bruk sculpting og utvalg verktøy for å gjøre justeringer i mesh. Edits inkluderer:
    1. Bruk Sculpting verktøy, Robust glatte. Glatt området tilsvarer linjen VOIS. Hjernen: hoppe over dette trinnet.
    2. Glatt overflaten av hjernebarken som vil bli med ansiktet ned i boksen.
    3. Jevne ut små tribuner som kan ha blitt opprettet i meshing og redigeringsprosessen.
  3. Velg Analyse, inspektør, Autorepair alt.
  4. Eksporter Smoothed_Brain_Model som Smoothed_Edited_Brain_Model.

7. Opprette Brain Slicer Box: Netfabb Professional

  1. Velg del, Legg til del. Velg file Smoothed_Edited_Brain_Model.
  2. Velg del, Legg til del. Deretter velger STL filen Brain Slicer Parts_Marmoset og klikk åpne. Hjernen: Brain Slicer Parts_Human (Supplemental koden filer).
  3. Høyreklikk på den delen, og velg Utvidede, Vasker til deler. Velg hver del individuelt og høyreklikk for å endre navn på dem. (Ved å klikke på øyet ved siden av et objekt skjuler det eller gjør det synlig.) Endre navn på den store boksen Main, den lille boksen Sub, og skjære boksen Box_Cutout, Hexagon form Blade_Holder_Main, den lille flat boks Mikrotom Blade, og halv tube objekt Cradle. Hjernen: nei Blade_Holder_Main, Mikrotom Blade, eller Cradle.
  4. Hide Main, Sub, Blade, Blade_Holder_Main, Mikrotom Blade, og Cradle og bruke shift-velger for å velge alle seks og Box_Cutout. Bare Box_Cutout og Smoothed_Edited_Brain_Model skal være synlig, men Smoothed_Edited_Brain_Model bør ikke velges.
  5. Klikk og dra de valgte delene for å justere posisjonen boksen i forhold til hjernen.
    1. Plasser hjernen i straffemerket. Posisjon hjernen dypt nok i boksen til være tett grep, men ikke for dypt til å lage overheng som hindrer riktig plassering.
  6. Når posisjonert, kan hjernen boksen konturen bli testet for fremspring. Velg Box_Cutout og Smoothed_Edited_Brain_Model. Velg boolsk operasjon.
    1. Klikk på Smoothed_Edited_Brain_Model å slå den rød.
    2. Velg boolsk subtraksjon, og gjelder beregningene.
  7. Sjekk hjernen boksen for fremspring som ville hindre den hjernevev fra å bli trygt plassert i boksen. Hvis disse overheng er til stede, justere hjernen slik at det er mindre dypt inne i boksen. Dersom hjernen er ved den ønskede dybde og overhenger til stede, se utfyllende avsnitt 10 for en løsning for å fjerne overheng.
  8. Velg Blade_Gaps modell. Høyreklikk, velg Flytt. Spill stillingen Z verdi, deretter lukke vinduet. Dette vil være den stilling som den bakre blad gap.
  9. Velg Blade STL som kom fra hjernen Slicer deler. Høyreklikk, velg Flytt.
    1. Velg Absolute oversettelse. Går inn i Z-verdi fra 7,8. For X og Y-verdier, angir den tilsvarende verdi fra dagens posisjon parameter bokser
  10. Velg Blade STL. Høyre klikk, klikk Dupliser.
    1. Sjekk Ordne deler. Angi det totale antall blader i den totale tellingen. Angi samme nummeret i Z teller boksen. Oppgi dekketykkelse i Z gap. Klikk på Duplicate. Dersom skive tykkelse ble variert, vil knivene må plasseres individuelt. Duplisere hver nye blad fra forrige (flytting fra bakre til fremre)med z gap lik snittykkelse for den delen.
  11. Plasser Mikrotom Blade deler på nøyaktig de samme intervaller som bladene i høvelen ved å gjenta trinn 7,9 og 7,10 for Mikrotom Blade. Hjernen: hoppe over dette trinnet.
    1. Velg Mikrotom Blade sammen med Blade_Holder_Main del og velg boolsk operasjon.
    2. Velg alle bladene i Mikrotom Blade å markere dem røde. Klikk på boolsk subtraksjon, og gjelder beregningene.
    3. Velg Reparer modus. Utfør en utvidet reparasjon. Velg gjelder reparasjon, og fjerne den gamle delen.
    4. Gi nytt navn til den delen Blade Holder. Eksportere den delen som STL.
  12. Shift-select Smoothed_Edited_Brain_Model, alle de Blade modeller opprettet i forrige trinn, og under og Main. Klikk på boolsk operasjon.
    1. Gjør alle delene bortsett Hoved red av seg selvoppsamling dem og klikke på pilen under den grønne boksen for å flytte dem til rødt.
    2. Velg boolsk subtraksjon og velg deretter gjelder beregninger.
  13. Klikk på reparasjon modus. Reparasjon modus:
    1. Kryss av i boksen for overheng og skarpe punkter. Disse kan glattes i Netfabb eller Meshmixer.
    2. Klikk på Automatisk reparasjon, Utvidet reparasjon. Da gjelder reparasjon og fjerne den gamle delen
  14. Høyreklikk på den reparerte hjernen boksen og endre navnet Brain Slicer Box. Eksporter som en STL.

8. Skrive ut Brain Slicer Box på Ultimaker 2

  1. Marmoset Brain: Cura
    1. Importer Brain Slicer Box i Cura.
    2. Velg Roter og dra sirkelen å rotere boksen slik at det ligger flatt på sengen.
    3. Juster utskriftsinnstillingene: 0,1 mm lag oppløsning, 50% fylltetthet, Raft.
    4. Velg Lagre Tool Sti til SD-kort. (Print tid ~ 12 timer.)
    5. Import Blade Holder itil Cura og roter det så sporene er på sidene og sekskanten ansiktet er i XZ eller YZ planet.
    6. Duplicate objektet.
    7. Juster utskriftsinnstillingene: 0,2 mm lag oppløsning, 20% fylltetthet, randen.
    8. Velg Lagre Tool Sti til SD-kort. (Utskriftstiden ~ 3 h)
  2. Menneskelige hjernen: Cura
    1. Importer Brain Slicer Box i Cura og rotere som i 8.1.2.
    2. Juster utskriftsinnstillingene: 0,2 mm lag oppløsning, 30-35% fylltetthet, Raft.
    3. Velg Lagre verktøyet banen til SD-kort. (Print tid ~ 70 timer for enkelt halvkule boks.)
  3. På Ultimaker 2
    1. Påfør et tynt lag med limstift lim for å bygge plate.
    2. Sett SD-kortet. Velg print og velg del.

9. Kutte Brain

  1. marmoset Brain
    1. Forbered en arbeidsstasjon med fast hjernen, hjernen slicer, to knivholdere, mikrotom kniver, 1 ml fluor olje, fLat pinsett, vernehansker og embedding kassetter.
    2. Plasser nye mikrotom kniver inn i sporene på bladholdere. Pass på at det skrå kanten av hvert blad er vendt i samme retning. Bruk vernehansker ved håndtering av mikrotom kniver.
    3. Fjern hjernen fra formalin og forsiktig tørke den.
    4. Plasser hjernen inn i høvelen. Noen få dråper av fluorerte olje kan bli brukt til hjernen og skjæreren for å tillate enkel posisjonering. Kontroller at hjernen er på plass.
    5. Plasser bladholdere med bladene i de tilsvarende bladspor.
    6. Trykk ned knivholdere fast og gjelder treg balanse press for å skjære gjennom hjernen.
    7. Fjerne hver skive, en om gangen, fra forsiden av hjernen. Det bidrar til å fjerne mikrotomen blad foran en skive før du fjerner skive selv. Følg nøye med på fremre / bakre retningen på hver skive.
    8. Ta bilder av fremre end bakre overflate av hver plate. De bakre plater vil mest sannsynlig inneholde separate deler, så ta hensyn til retningen av stykkene for innebygging. Plasser hver skive i en embedding kassett og sette dem alle i en 10% formalinløsning.
  2. menneskelige hjernen
    1. teste nøye tilpasning av hjernen i boksen.
    2. Skjær hjernen fra den ene enden ved hjelp av en vinklet kutt, sakte men bestemt å ha klippet. Skjær hjernen gjennom hvert blad gap.
    3. Fjern hver skive en om gangen, vier oppmerksomhet til antall og anterior / posterior retningen på hver skive.
    4. Ta bilder av fremre og bakre overflaten av hver plate. Plasser plater i forseglede 10% formalin poser. Vevsblokker vil bli kuttet fra plater og plassert i kassetter for innebygging.

10. Fjerning Overheng i Brain Box (Supplementary seksjon)

  1. Trekke ut skiver: Meshmixer
    1. Importer Smoothed_Edited_Brain_Model.
    2. Velg Rediger, lage skiver. I lage skiver:
      1. Velg Stacked 3D, Z, skriv 1-2 mm tykkelse. Klikk på Beregn. Når skivene laste, klikker du på Godta.
    3. Velg 1 eller 2 skiver med større omkrets i nærheten av bunnen av hjernebarken. Disse skiver bør være under nivået for underboksen.
    4. Eksportere hver av disse sektorene som Brain_Slice_ #.
  2. Utvide skivene opp for å fjerne overheng: Netfabb Professional
    1. Importer Brain_Slice_ # skiver.
    2. Duplicate hver Brain_Slice_ # (avmarker arrangere deler hvis sjekket).
    3. Høyreklikk på en kopi av hver Brain_Slice_ # og velger Scale.
      1. Fjern haken Fast skalering forholdet. Deretter skalere opp hjernen skive i Y-retningen slik at den vil nå nivået for bunnen av underfeltet.
    4. Endre navn på disse skivene Brain_Slice_Big_ #.
    5. Sjekk Y posisjon of den opprinnelige Brain_Slice_ # ved å høyreklikke på den delen og velge farten. Spill Y-posisjonen for hver av de opprinnelige Brain_Slice_ # skiver.
    6. Utfør beregningen: Brain_Slice_ # [y posisjon] - (Brain_Slice_Big_ # [y size] - Brain_Slice _ # [y size])
    7. Velg hver av Brain_Slice_Big_ # individuelt, høyreklikk og velg Flytt.
      1. Angi verdien beregnes ut fra 10.2.6 i Y oversettelse parameter boksen. For X og Z oversettings parametere angi verdiene som ligger i dagens posisjon parameter bokser. Velg Absolute Translation. Klikk på Trans og lukke vinduet.
        MERK: Brain_Slice_Big_ # skiver vil bli trukket sammen med hjernen og blader når du gjør boksen.

11. Marmoset Brain MR Cradle for Tilleggs skanning

  1. Opprette Brain MR Cradle
    1. Pass på at den øverste overflaten av CrAdle er på samme høyde som Box_Cutout. Dybden og plasseringen av hjernen i holderen skal settes opp på samme måte som det er for skjæreren.
    2. Shift-select for å velge Smoothed_Edited_Brain_Model og Cradle.
    3. Velg boolsk operasjon. Velg hjernen til å markere det røde, velg boolsk subtraksjon. Da gjelder beregningene. (Også velge Brain_Slice_Big_ # skiver hvis det er aktuelt.)
    4. Skriv reparasjon modus for å fjerne eventuelle skarpe punkter i vuggen kontur som gjort tidligere for høvelen. Velg Utvidet reparasjon. Påfør reparasjon, og fjerne den gamle delen.
    5. Høyreklikk for å endre navn på den delen MR Brain Cradle. Velg Export, STL.
  2. Skrive vugge: Cura
    1. Importer MR Brain Cradle inn Cura og roter det slik at den flate delen med hjernen cutout vender opp.
    2. Juster utskriftsinnstillingene: 0,1 mm lag oppløsning, 100% fylltetthet, Raft.
      3. <li> Velg Lagre verktøyet banen til SD-kort. (Print tid ~ 10 timer)
    3. Skriv ut på Ultimaker 2 som beskrevet i 8.3.
  3. Anskaffelse av høy oppløsning T2 * MR ved hjelp av holderen
    1. Forsiktig tørr formalin fra overflaten av hjernen med et papirhåndkle.
    2. Plasser hjernen i holderen som beskrevet for høvelen.
    3. Skyv hjernen og holderen inn i 50 ml sentrifugerør. Fyll den til randen med fluorerte olje.
    4. Klem forsiktig på røret for å tillate luftbobler å flykte fra hjernen. Sett Cap Sett inn det innfelte av røret lokket for å hindre luftbobler dannes der. Fest hetten, og forsegle røret med parafin.
    5. Plasser røret inn i spolen som tidligere beskrevet. 3D T2 * parametre er gitt i tabell 1.
    6. Åpne 18 anatomiske 100 micron T2 * vektet oppkjøp i Mipav og registrere den 10. oppkjøpet. Registrering parametere er de samme som i 1.1.7. Gjennomsnittlig registrerte bilder: Utilities, Bilde kalkulator-Bulk bilder, Average.

Representative Results

Arbeidsflyten for denne metoden er oppsummert i figur 1. Når hjernen er oppskåret, viser en visuell sammenligning mellom MR-bilder og bilder av den overfladiske overflatene av de plater en god orientering kamp på tvers av flere plater (figur 2). Etter at platene er innebygd i parafin, blir de delt på en mikrotom og farget. En mer grundig sammenligning mellom høy oppløsning postmortem MR og farget histologi seksjonene viser en nøyaktig og konsekvent kamp på tvers av alle strukturene i marmoset hjernen (figur 3).

I denne dyremodell av MS, dyrene utvikle hvit substans lesjoner spredt over hele cerebral hvit substans. Disse lesjonene kan oppdages invasivt ved å utføre MR. Figur 4 viser evnen av denne teknikken for å belyse den patologiske substrat av MRI. Små lesjoner oppdaget på in vivo MR kanspores i både post mortem MR og histologi. Som vist i innfellinger, demyelinering innenfor lesjoner er en av de viktigste komponentene som driver MR signalendring (hyperintensity i forhold til omgivende vev). Den histologi og post mortem MR kan også vise lesjoner savnet på in vivo MR (figur 4).

Figur 1
Figur 1. Arbeidsflyt for å opprette en silkeape hjernen slicer boks. Hjernen er festet med formalin (A1) og en T2-vektet MRI er anskaffet med isotrope voxels av 150 mikrometer per kant (A2). Bilder blir behandlet og terskelverdier for å skape en binær maske (A3). Overflaten blir deretter gjengitt i 3D modellering programvare (A4). Et boolsk subtraksjon mellom en kutte- mal og hjernen modellen danner en digital modell av hjernen høvelen (B1). Hjernen slicer boksen er trykt på en 3D-printer (B2). Hjernen anbringes deretter fast i skjæreren boks forskjæring (B3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Fra venstre til høyre: In vivo MR, post mortem MRI, og vev skive fotografi. Slicing flyene ble etablert basert på postmortem MRI (B) og visuelt sammenlignet med tilsvarende in vivo MR skive (A). Hjernen ble deretter kuttet, og de resulterende plater ble funnet å være konsistent (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Høy oppløsning postmortem MR og histologi§ matching. Platene ble innstøpt i parafin, kuttet med en mikrotom til 4 um seksjoner, og farget med rask blå og kresylfiolett (B). Seksjonene ble deretter visuelt matchet med 100 um T2 *-vektet MRI basert på strukturer i hjernen (A). Detaljer for å anskaffe dette bildet er i supplerende delen av protokollen og Tabell 1. Hjerne strukturer: (1) rød pil = interne kapsel, blå pil = anterior commissure; (2) rød pil = putamen, blå pil = optisk kanalen; (3) rød pil = caudatus, blå pil = hippocampus; (4) rød pil = corpus callosum, blå pil = hjernens akvedukt; (5) rød pil = dårligere colliculus, blå pil = pyramidesystemet. Stiplet ramme B1 indikerer en skive der, enten under hjernen skjæring eller parafin embedding, forårsaket en feil en svak rotasjon om Y-aksen, som fører til mismatch av fremre commissure til venstre. Klikk her for å vise enstørre versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Sporing lesjoner fra in vivo MR for å histologi delen. In vivo MR viste ingen overbevisende tegn på unormal hyperintensity signal som tyder på lesjoner i enten optisk veiene (A1). Imidlertid viser den høye oppløsningen postmortem MR klare hyper intense linjer i både optikk traktater (A2). Den raske blå / cresylfiolett flekken av en 4 mikrometer histologi delen viser at hyper områder sett på ex vivo MR er demyelinerte (A3). I cerebral hvit substans, viser in vivo MR subtile hyperintensity bilateralt (B1, forstørret i innfellinger). De hyper områder er mer opplagt på høy oppløsning postmortem MRI (B2). Den LFB flekken av en 4 mikrometer histologi delen viser at disse områdene er demyelinerte (B3). Etter sammenligning med referanse jegn vivo MR og en hemotoxylin-og-eosin flekken, ble høyre side fast bestemt på å være en anatomisk abnormitet, ikke en demyelinerte lesjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

kode supplerende filer
Kode supplerende filer. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl: Klikk her for å laste ned denne filen. Brain_Slicer_Parts_Human.stl: Klikk her for å laste ned denne filen. Cap_Insert.stl: Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Protokollen skissert her gjør en nøyaktig sammenligning mellom MR og histologi seksjoner. Protokollen er presentert i et enhetlig format som kan brukes til hjernen hos mennesker eller små dyr, slik som silkeaper eller gnagere. Forskjeller er spesifikke for stor (human) og små (nonhuman primat og gnager) hjerner er uthevet, og i den medfølgende video og tallene vi viser programmet i marmoset. Selv om metoden er enkel, krever fremgangsmåten i mange trinn, så vel som bruk av flere typer av programvare. Dessuten flere saker potensielt påvirker nøyaktigheten av denne metoden er viktig å nevne.

Bildekvaliteten på in vivo MR er en viktig faktor. For å minimere forskjell i bildeoppløsningen mellom MR og digitalisert histologiske bilder, bør den minst mulige MR voxel størrelse benyttes. Dette konseptet gjelder også bildekvaliteten på den postmortem MR. Mens den økteOppkjøpet tid i postmortem MRI tillater mye høyere bildeoppløsning, forberedelse kan innføre bilderester som knutepunkter signaldropouts knyttet til luftbobler. Disse gjenstander kan skjule deler av vev, så vel som påvirker dens kontur. Videre er dimensjonene av vev på postmortem MR sannsynligvis vil bli påvirket av fikseringsprosessen og varighet. Mens in vivo til ex vivo MRI kamp kan tilnærmes ved å benytte anatomiske landemerker i skive geometri ble satt opp under anskaffelse, ville en ikke-lineær registrering likevel være nødvendig for å oppnå en høyere grad av nøyaktighet i samsvarer med de to MRI-bilder.

Utformingen av hjernen holderen og høvelen er også et viktig skritt. For å lage den digitale modellen av hjernen, er en mykningsalgoritme anvendt som litt forstørrer modellen i forhold til den faste hjernen. Dette muliggjør lett innføring av hjernen i holderen og kutte- og reduserer skarpe kanter i holderen &# 39; s kontur. Imidlertid, hvis modellen er for stor (for eksempel ved mer enn 5%), i hjernen kan bevege seg under den postmortem MR og / eller snitting. Et annet viktig poeng er å tilpasse utformingen av hjernen modellen slik at lillehjernen er riktig plassert inne i 3D-trykt objekt. Dette kan være spesielt utfordrende når lillehjernen har blitt skadet under hjernen utvinning ved obduksjon.

Når du skriver ut hjernen slicer og holder, må den type 3D-printeren også velges med omhu. Noen multi-jet skrivere krever etterbehandlet med en ovn for å fjerne støttemateriale. Selv om disse skriverne kan produsere objekter som er vanntett og relativt mer holdbart enn stasjonære smeltet deponering modellering (FDM) skrivere, til oppvarmingsprosessen fjerne Støttene kan lett fordreie boksen, lage blad hull som ikke er helt vinkelrett på hjernen kontur.

Hjernen seksjonering prosessen er et annet viktig skritt. Før du skjærer the hele hjernen til plater, er det viktig å sørge for at hjernen sitter tett inne i hjernen høvelen: det bør ikke være noen bevegelse når svakt trykk blir påført på hjernen. Dette vil gjøre det mulig for bladene for å skjære gjennom hjernen på den nøyaktige plasseringen satt av etterforskere. En kontinuerlig, balansert press bør brukes på begge bladholdere når du skjærer. Avhengig av skarpheten av bladene og stivheten av vev, kan en liten tverrgående skjærebevegelse være fordelaktig for å opprettholde plane snittflater.

Parafin-embedding prosessen kan også være en kilde til forskyvning mellom MR og histologi. Hvis vevet skive ikke sitter flatt mot kassetten under innleiringen prosessen, vil det være en vippe mellom skjæringsplanet på mikrotomen og overflaten sted av platen. Dette vil kreve kutte ubrukelige deler for å finne en flat plan der alle vev utsettes. En måte å korrigere for tilter ved å endre vinkelen av visningsplanet på høy-isotrope-oppløsning post mortem MRI. Dette er imidlertid nesten umulig å utføre på in vivo MRI som vanligvis er anskaffet med anisotropisk oppløsning (typisk tykke koronale stykker).

Endelig kan vevet oppleve noen deformasjon i løpet av formalin fikseringsperioden og parafin innebygging (krymping), så vel som under fremstilling av objektglass (folding, sprekkdannelse, rynker). Noen av disse deformasjoner kan korrigeres ved å sette 4-5 mikrometer seksjoner i et vannbad før de overføres til lysbilder. Andre deformasjoner kan delvis løses ved å utføre deformerbar bilde coregistration av de histologiske digitaliserte bildene til post mortem MR-bilder. Likevel, minimere deformasjoner med forsiktig og dyktige praksis er den mest effektive tilnærmingen til matchende MR volumer til histologi seksjoner.

I konklusjonen, metodikken introdusert her gjør investigators å vurdere nøyaktig den underliggende patologi MR-funn. Mer generelt er det en lovende metode for å identifisere og / eller validere nye MR biomarkører for forskningsstudier som er rettet mot spesifikke patologiske prosesser, for eksempel betennelse eller remyelinisering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7T/30cm USR AVIII Bruker MRI Bruker Biospin
38 mm Bruker Biospin volume coil Bruker Biospin
Fomblin Solvay Solexis
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile Corning 21008-951
Fisherbrand Gauze Sponges Fisher Scientrific 13-761-52
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film Bemis
Leica RM2235 rotary microtome  Leica
Leica Disposable Blades, low profile (819) Leica
Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous Electron Microscopy Sciences 26089-01
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol Electron Microscopy Sciences 26056-15
ETOH
Ultimaker 2 Extended  Ultimaker
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA  Filament, 2.85 mm, Silver Metallic Ultimaker
Axio Observer.Z1 Zeiss
Zen 2 (Blue Edition) Zeiss
Netfabb Professional 5.0.1 Netfabb http://www.netfabb.com/professional.php
Meshmixer 10.9.332 Autodesk http://www.meshmixer.com/download.html
Mipav 7.2 NIH CIT http://mipav.cit.nih.edu
Cura Ultimaker https://ultimaker.com/en/products/cura-software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques. Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).
  2. 't Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man. Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).
  3. Ontaneda, D., Hyland, M., Cohen, J. A. Multiple sclerosis: new insights in pathogenesis and novel therapeutics. Annu Rev Med. 63, 389-404 (2012).
  4. Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets. J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).
  5. Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).
  6. Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in-vivo MRI for whole baboon brain. J Neurosci Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
  7. McGrath, D. M., Vlad, R. M., Foltz, W. D., Brock, K. K. Technical note: fiducial markers for correlation of whole-specimen histopathology with MR imaging at 7 tesla. Med Phys. 37, 2321-2328 (2010).
  8. Schormann, T., Zilles, K. Three-Dimensional linear and nonlinear transformations: An integration of light microscopical and MRI data. Hum Brain Mapp. 6, 339-347 (1998).
  9. Jiang, L., et al. Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model. NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).
  10. Absinta, M., et al. Postmortem magnetic resonance imaging to guide the pathologic cut: individualized, 3-dimensionally printed cutting boxes for fixed brains. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (8), 780-788 (2014).
  11. Gaitán, M. I., et al. Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging. Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).

Tags

Neuroscience Neuroscience menneske silkeape hjerne MR histologi 3D printing
Utnytte 3D utskriftsteknologi til Merge MR med histologi: En protokoll for Brain Seksjonering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luciano, N. J., Sati, P., Nair, G.,… More

Luciano, N. J., Sati, P., Nair, G., Guy, J. R., Ha, S. K., Absinta, M., Chiang, W. Y., Leibovitch, E. C., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning. J. Vis. Exp. (118), e54780, doi:10.3791/54780 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter