Introduction
生体分子の構造を決定することは、その機能を理解するための重要な前提条件です。構造決意ための2つのよく確立された方法は、低温電子顕微鏡法およびX線結晶1、2です。今日では、両方の方法は、オングストロームレベルまで解像度を持つ高解像度の構造情報を提供します。これらの2つの方法は、タンパク質複合体のような大きな生体分子の構造を解明するために広く使用されています。既存の方法は、常に最後の数十年を通じて改善されているが、大規模な動的および過渡複合体は3を検討する際に、生物学的構造の複雑さは、まだ具体的には、構造生物学に大きな課題を提起します。
巨大分子複合体の力学、特に構造 - 機能の関係を研究するために、単一分子方法はPROVを有しますIDED有用な情報4。いくつかの新しい戦略は、構造的および動的な情報を取得するに直交するアプローチを提供する開発されました。例としては、高速AFM 5、機械的操作6、蛍光局在顕微鏡7と同様に、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動（smFRET）8、9です。かなり早い段階FRET上ので生体高分子10の長さスケールでの距離依存性に起因する分子定規を 、と呼ばれています。
smFRETの特に興味深い適用は、構造情報11、12、13、14を推測するsmFRET測定から得られた距離情報を使用することで、15 >、16、17、18、19、20、21、22、23。 smFRETの高時間分解能を、タンパク質構造の可動部の位置を局在化することができます。しかし、smFRETデータから定量的情報を抽出するために色素分子に関する重要な補正パラメータは、測定24中に決定される必要があります。これらの補正係数を用いて、FRET効率E FRET式を用いて計算することができます
、
ここで、I AとI D 図2参照 ）は、それぞれ、ドナー及びアクセプター分子の蛍光強度です。 βファクタは、アクセプターチャネルに、クロストークのためのドナー発光の漏れを占め、によって計算されます
I 'AとI D'は、アクセプター分子の光退色後のドナーとアクセプター分子の蛍光強度どこにいます。
γ-要因は、2チャンネルの相対的な検出効率の違いだけでなく、ドナーの蛍光量子収率とアクセプター色素の違いを補正します。それはによってすべての個々の時間トレースから計算されます
この説明は、時には重要になり、同様のために修正する必要があるアクセプター分子の直接励起を無視することを、注意してください。これらの補正係数を決定するためには、光物理的変化と構造力学を区別するために、交互スキーム25にドナーならびにアクセプターの両方を励起するのに便利です。
定量的smFRET効率だけでなく、定量的な構造情報を取得するだけでなく、ためには、ナノポジショニングシステム（NPS）は、2008年26で導入されました。名前は、衛星ベースの全地球測位システム（GPS）との類似性に基づいて選択しました。 NPSは、生体高分子複合体中の未知の色素位置の局在化smFRETとX線結晶学データを組み合わせたハイブリッド技術です。 C言語rystal構造は、参照フレームとして機能し、smFRET結果が不明フルオロフォアの位置（ アンテナ ）と結晶構造（ 衛星 ）からの既知の位置との間の距離情報を取得するために使用されます。連続実験では、アンテナと複数の衛星との間の距離が測定され、アンテナの位置がベイズパラメータ推定に基づいて、統計的に厳密な分析手法によって決定されます。その結果、アンテナの有力位置だけではなく計算されますが、その完全な3Dの不確実性分布、いわゆる後方には、信頼できるボリュームによって可視化しました。また、NPSは完全smFRETネットワーク27の分析を可能にするために拡張されました。
NPSは、真核生物の転写において重要な質問の数、すなわち上流のDNAもちろん、非鋳型DNAとRNAポリメラーゼII伸長共内新生のmRNAを解決するために使用されていますまた、転写開始の効果を実証mplex 12、28は 、26因子と29を開放プロモーターの動的なアーキテクチャが複雑。また、NPSは、転写伸長因子Spt4 / 5 31と同一部位に競合的に結合する転写開始因子TFEのオープン複雑30、特に位置古細菌RNAポリメラーゼの構造を解明するために使用されました。
それ以来、smFRET基づく構造のアプローチの数は15、18、21、23を発表されています。異なるsmFRET基づく構造の方法を比較すると、それは、この方法の明らかな精度は、染料モデルの特定の選択に大きく依存することが明らかとなります。一つは、あることに注意する必要があります色素分子は、それらの局所環境に応じて異なる空間および配向挙動を示すことができます。
このため、高速NPSは32を導入しました。高速NPSは大幅に計算時間を削減する高度なサンプリングアルゴリズムを使用しています。また、高速NPSは1つが構造解析を実行することを可能にし、ユーザが次に説明する5異なる色素モデルのセットから選択することができ、各色素分子のため。 古典と呼ばれる最も保守的なモデルは、染料が一つだけが、未知の、位置を占めていることを前提としています。この位置では、フルオロフォアは、そのサイズがそのそれぞれの（時間依存性）蛍光異方性から決定される円錐内で自由に回転することができます。円錐の向きは、距離に測定smFRET効率を変換する際に大きな不確実性をもたらす、知られていません。それは他の染料のモードに比べて最小精度につながるので、この点で、このモデルは、保守的ですlsの。ごく短い距離のための前提条件が著しく不正確な位置決意に古典的なモデルのリードによって作らなければなりません。典型的なsmFRET値については、正確な位置は常に比較的大きな信頼できるボリュームで囲まれています。
より高い精度が望まれるので、開発および精度を改善するために役立つ可能性が代替染料モデルをテストすることが重要です。染料は、その固有の蛍光寿命よりもはるかに高速に回転する場合、いわゆるISOモデルを適用することができます。ここでは、2κ配向係数は（特性の等方性のフェルスター半径を計算するために必要な
）2/3に設定されています。その結果、計算された信頼性の高いボリュームは、古典的なモデル32におけるものと比較してほぼ2桁小さいです。フルオロフォアは、高速reoriだけでなく、できる環境で発見された場合にはすべてのアクセス可能な容量を超えるentationが、さらに速い動きは、meanposイソモデルを使用する必要があります。このモデルでは、染料は、効果的に空間平均は多項式距離変換15によって占められて唯一の平均位置を占めます。 （例えば、一般的に疎水性）色素が親水性領域、 例えば、DNAに取り付けられている場合、このモデルは適用されます。 meanposイソモデルの適用は、約2倍信頼ボリュームのサイズをさらに低減することができます。しかし、タンパク質に連結された色素は、その立体的にアクセス可能なボリューム（AV）のいくつかの疎水性パッチに可逆的に結合する可能性があります。瞬時にこれらの領域の間にスイッチが、1領域内の自由な回転を受け、高速なローカライズされた動きがVAR-meanpos -イソモデルによって最良に記載されている。フォア似たような状況のためにした染料は、モデルが適用されるVAR-meanposを自由に回転することではありません。以上のDこれらのモデルについてetailsは、私たちの最近の刊行物32に記載されています。
これらのモデルは、具体的には色素が発生する可能性のある様々な環境を考慮し、それらを適用することは賢明にその局在化の精度を最適化する広範なレパートリーを提供します。高速NPSで特定の位置に取り付けられたすべての色素分子は、FRET-パートナーは異なるモデルを持つことが許可されているように、個々のモデルに割り当てることができます。これは無限にあり、近隣ツー自然モデリングを可能にします。しかし、1つが最終的なモデルの組み合わせによって得られた結果は実験データと一致したままであることを保証するために厳密な統計的検定を行うことが重要です。これらのテストは、高速NPSソフトウェアに含まれています。
実験データに高速NPSを適用するために（のみ）3つの入力パラメータの測定が必要とされます。まず、色素ペア固有の等方性のフェルスター半径（/54782/54782eq5.jpg "/>）を決定する必要がドナー色素のあるので、量子収率（QY）、ドナーの蛍光発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルを測定する必要がある。これらの測定値は、で行うことができますバルクは、標準的な分光計及び標準的な蛍光分光計を用いて、それぞれのペアについて、R 0は、その後フリーPhotochemCADを使用して計算され、NPS分析に使用することができる。また、色素分子の（時間分解）蛍光異方性が必要偏光（及び時間）に敏感な蛍光分光計を用いて得ることができる。しかし、高速NPSのための最も重要な入力パラメータは、全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）などの単一分子蛍光顕微鏡の設定で測定smFRET効率であります。
ここでは、smFRETデータを取得し、高速NPS（ 図1）を適用するためのステップバイステップのプロトコルを提示します。
Protocol
1.前提条件および実験器具
注：測定室のアセンブリは、図3に示されています。石英ガラス（溶融シリカ）スライド、封止膜とフローチャンバーをシールカバースリップ：測定室のサンドイッチ設計は、3つの主要なコンポーネントを含みます。測定室は、カスタマイズされた試料ホルダーに取り付けられます。試料室と金属ホルダの寸法は、標準的な顕微鏡用石英ガラススライド（76ミリメートル×26 mm）のに適合するように連動されています。
- 図4に示す位置にダイヤモンドドリル（0.75ミリメートル）を使用して、石英ガラススライドをカット。石英ガラススライドのデザインは、各スライドの両側を区別するために非対称です。
注：表面が傷になるまで、石英スライドを測定した後に再使用することができます。 - 図5に示すようにチャンバをマウントするには、<カスタマイズされた金属試料ホルダーを使用します/ strong>の。サンプルホルダーは、入口と流れチャンバ出口チューブを接続するために、2つのスレッド（M4）を含みます。また、金属ホルダーに試料室をマウントするだけでなく、スレッド（M3）は、金属ホルダーの下半分に上にプリズムホルダを固定するためのスレッド（M3）を使用します。
- プリズム型全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）（ 図6）にsmFRET測定を実行します。
注：緑色（532nmで、のNd：YAGレーザ）とドナーの励起とアクセプター色素分子だけでなく、青色レーザー（491 nmの赤色レーザー（643 nmのダイオードレーザー）TIRFMは、3つのレーザを提供していますsmFRET測定の前に試料室のバックグラウンド蛍光不純物を漂白するための、ダイオード励起固体レーザー）。 3つのレーザビームは、空間的に合成され、音響光学チューナブルフィルタ（AOTF）を介して選択することができます。蛍光光は、高開口対物レンズによって集めドナーに分割し、受け入れれますまたはダイクロイックミラーを使用し、2 EM-CCDカメラに投影することによりチャネル。試料室は、二つのステッピングモータを用いてX方向及びY方向の移動を可能にするマイクロメータステージに取り付けられています。第三の圧電モータは、実験を通じて最適なフォーカスを確保するためにオートフォーカスシステムを構築するために、IRレーザー及び位置検出器と一緒に使用されます。- FRET時間軌道内のダイナミクスが25を観察している交互にレーザ励起（ALEX）を使用します。このようなダイナミクスは、分子内のコンフォメーション変化のいずれかによって、または受容輝度とアクセプタ点滅の変動によって引き起こされ得ます。
注：ALEXは、これらの2つの原因との識別を可能にし、動的FRET軌道の誤解を防ぐことができます。しかし、簡単のため、プロトコル部分は、ALEXことなく撮影映画の分析に制限されます。
注意：クラス3Bのレーザは、単一分子蛍光セットアップで使用されています。その適切なラことを確認してくださいシステムが作動する前に、SERの安全上の注意事項は、地方政府の規制に従って、取られています。
- FRET時間軌道内のダイナミクスが25を観察している交互にレーザ励起（ALEX）を使用します。このようなダイナミクスは、分子内のコンフォメーション変化のいずれかによって、または受容輝度とアクセプタ点滅の変動によって引き起こされ得ます。
- （材料および方法を参照されたい）、UV-VIS分光計での量子収率を決定するために使用される吸収測定を行います。
- （材料および方法を参照）、ドナーの蛍光発光スペクトルを、アクセプターの吸収スペクトルと蛍光分光計で蛍光異方性の測定を行います。
- 公開された手順33に係る試料室を準備します。あるいは、[34]に記載の手順を使用することができます。
- smFRETに適したドナー・アクセプター色素分子ペアで調査したサンプルにラベルを付け、試料室の表面上に固定化するためのビオチン部分があることを確認してください。
注：異なるサンプルの構築が必要とされる高速NPSソフトウェアで、未知のアンテナ色素位置をローカライズするために。すべての構築物のnEEDSは未知のアンテナ色素位置での1のラベルと結晶構造から知られている衛星の位置にラベルを1つ持っています。アンテナの位置に取り付けられた染料3つの異なる衛星位置との少なくとも3つの異なる構築物は、正確な結果を得るために必要とされます。アンテナ間ならびに衛星との間の測定もまた、精度を向上させるのに有用であるが、これは正しく解析で入力する必要がある色素分子の交換を必要とします。
カスタムホルダーに流れチェンバースの2取付
- 中空タブのネジ（M4）にシリコンチューブ（0.8ミリメートルのID、2.4ミリメートルのOD）を引いて、鋭利なカミソリの刃を使用して、まっすぐ両側に1センチメートルのオーバーハングを残して両端にチューブをカット。タブスクリューの一方の側に約2mmのチューブのオーバーハングを調整します。
- 石英ガラススライドの穴は、試料ホルダーにスレッドを一致させるような方法で試料ホルダーにフローチャンバーをマウントします。締め付けます入口と出口のネジを静か試料室の入口および出口がまだ浸透していることを確実にします。ゆっくりとフローチャンバーの位置を固定するためにアクリルガラスホルダーの4本のネジを締めます。
- 長さ20cmの片にシリコンチューブ（0.58ミリメートルのID、0.96ミリメートルのOD）をカットします。入口と測定室の出口ネジ個の1を挿入します。クランプを使用して、入口と出口チューブを閉じます。
注：組み立てられたサンプルチャンバは、最大2週間室温で保存することができます。
TIRF顕微鏡3. smFRET測定
- PBSの500μLと試料室を洗浄するために注射器を使用してください。異なる緩衝液に変更する前に、入口管の端部で液滴を生成することにより、常にサンプルチャンバに入る気泡を防ぎます。
- 100μLのニュートラ（PBS中の0.5mg / mL）の溶液を試料室をフラッシュし、室温で15分間インキュベートします。
- ウォッシュPBSの500μLとニュートラソリューションアウト。
- 試料室の上にプリズム用の金属ホルダーをねじ込みます。
- TIRF顕微鏡のマイクロメーターステージに試料室をマウントします。プロセスをスキャン中にデフォーカスを回避するために、対物レンズの前面に水平にできるだけまっすぐ試料室をマウントすることを確認します。
- EM-CCDカメラとステージのピエゾモータを制御するためのソフトウェアを制御するソフトウェアを起動します。
- IRレーザーの反射を見て、顕微鏡対物レンズの焦点を調整します。
- 金属プリズムホルダの上にプリズム（PS991はn = 1.52）を配置します。レーザ光がプリズムはその後、接着剤を使用し、5分間UV光でインキュベート打つことを確認するために、プリズムの横方向の位置を調整します。
注：マウントされたプリズムは、洗浄により再利用することができます。 - カメラ制御ソフトウェアクリックし、「設定の取得」では、以下の取得パラメータを定義します：100ミリintegratイオン時間、401フレーム/映画（緑カメラ）、400フレーム/映画（赤カメラ）、電子乗算器は14ビットで225、プリアンプのゲイン5倍と読み出し速度は3MHzを得ます。
- 測定のためのローカルハードドライブ上のフォルダを作成します。年月日、 例えば 、測定・ファイルの任意の名前を選択してください。設定が「自動保存」ライダーに行くソフトウェアでは、「自動保存」を有効と*映画の取得のための.sifをファイル形式を選択します。ハードディスク上のフォルダを選択します。 filestemとしてフォルダ名を使用してください。
- 「自動インクリメント」機能（1に設定された開始値）を有効にします。ファイル名に、オペレータの付着を有効にします。それぞれ、ドナーとアクセプターチャネル用の「DON」と「ACC」を使用してください。セパレータとして「_」を選択します。
- カメラ制御ソフトウェアの「ビデオ」をクリックするすべての3つのレーザの最大レーザー強度を使用して、試料室をスキャンすることによって、カメラと漂白剤バックグラウンド蛍光のライブ画像を開始する（コムbined≈3,000W / cmの視野あたり2 10秒）。
- 青色レーザーのスイッチをオフにします。交互レーザー励起（ALEX）が使用されている場合は約200 W / cm 2の赤色レーザのための約40ミリワット/ cm 2の緑色レーザの強度を低下させます。
- 50-100 PMの濃度になるように、ビオチン化蛍光試料を希釈します。溶液100μLをロードします。サンプルは、結合時にチャンバ表面に固定化されます。
注：室が過負荷にならないことを確認してください。隣接する分子は互いに分離されなければなりません。 - 必要に応じて、チャンバに2倍以上の濃縮サンプルの追加の100μLをロードします。
- ローディングが完了した後、クランプを使用して測定チャンバの入口および出口チューブを密封します。
- すべてのレーザーのスイッチをオフにし、さらにフローチャンバーに2つの視野を移動するために、ピエゾモーターを使用しています。
- カメラ制御ソフトウェアでは、動画の撮影やスイッチを開始するには、「テイク信号」をクリックしてください同時にレーザーに。分子の80％以上は、レーザーパワーを調整することにより、映画の終わりまでに漂白されていることを確認。
- 繰り返して、全体prebleachedサンプルチャンバ領域のための3.17と3.18を繰り返します。
トランスフォーメーション・マップの4買収（「beadmap」）
- セクション1.1、1.2及び2に記載されているようにフローチャンバーを準備します。
- ドナーとアクセプターチャネルで蛍光発光を示すアビジン被覆蛍光マルチスペクトルビーズを使用してください。 1分間ボルテックス株式を、次いで別の10秒ボルテックス、1〜2分の超音波処理、1分間再び50μLのddH 2 O渦に株式の50μLを希釈。
- smFRET測定（セクション3.5から3.10）について記載した手順を実行します。
- フローチャンバー内に2希釈した蛍光ビーズ：1の負荷100μL（1室容積）。表面に結合する蛍光ビーズのために10分を待ちます。
- 3.9で取得パラメータを使用しますが、ちゃんGEムービー26までの長さ（緑カメラ）、25（赤カメラ）と10の電子増倍ゲイン。
- 20 W / cm 2の値に緑色レーザーの強度を設定します。
- 約50-100ビーズで視野で映画一本を取ります。
5.処理および解析smFRETデータの
- 取得した映画（材料および方法を参照）beadmapの分析のためのカスタム書かれたソフトウェアSMのFRETを使用してください。プログラムviewPlot1.mを起動します。
- 解析にクリック|バッチ分析、それが使用されていない場合は、「ALEX」オプションをオフにします。最高のパフォーマンスを実現するために「高」ピーク検出のしきい値を選択します。 「OK」を押します。
- beadmapが既に解析されているかどうかを尋ねられたときに「NO」を選択します。取得beadmapを含むフォルダを参照し、（それをダブルクリックして）* .sifファイルを選択します。次のダイアログウィンドウでボタンを押すと、「OK」。
注：beadmapはすでに前の尺度で分析している場合メントは、ここで「YES」を選択し、beadmap * .MAPファイルに正しいフォルダをダブルクリックに参照して保存したbeadmapを選択します。ステップ5.8に進みます。 - 視野の対角に位置する2つの単一のビーズを選択してください。画素強度は、色分けされたダークブルー（低強度）から暗赤色（高輝度）にあります。
- 最初のビードの中心をクリックします。分子の中心が色分けによって明確に配置することができた場合は、「YES」を選択または他の「NO」をクリックし、別の分子のペアを選択します。
- 「KEEP」最大強度とプレスを示すピクセルに十字線を配置します。第二のチャネルを使用してプロセスを繰り返します。
- 反対側の隅に分子をクリックし、手順5.5と5.6を繰り返します。
注：2つのチャネルの相対的なピクセルシフトがコマンドウィンドウに表示され、変換マップが自動的にbeadmap * .sifファイルを含むフォルダに* .MAPファイルとして保存されます</李> - 「バッチ分析」のために、ドナーとアクセプタームービー（*の.sif）をロードするには、分析されなければならないすべてのムービーを選択し、フォルダを参照し、「OK」をクリックしてください。次のダイアログウィンドウで、「OK」を押します。
注：コマンドウィンドウに表示された最後のレーンで始まる時にバッチ分析が終了した「完成分析...」。検出された分子はまた、ドナーと変換マップから求め受容チャネルの相対的なシフトを示し、新しいウィンドウに表示されます。 - ロード|バッチ処理動画ファイルは、ファイルをクリックしてロードします。それが使用されていない場合はオプション「ALEX」をオフにします。 10にsmoothwidthを設定し、「OK」をクリックします。 * .ttrファイルを含むフォルダを選択して、次のコンテキストメニューで「すべて選択」と「OK」をクリックしてください。
- 表示されたトレースが特徴smFRETフェーズ（ 図2）を備えていた場合はトグルボタンを押して、最初の「選択しない」とマウスカーソルで行を移動し、マウスの左ボタンをクリックすることで、FRETイベントの開始時刻を選択します。次に受容体分子の漂白およびドナー分子の漂白の最後に時刻の時点を選択します。
- 次のウィンドウでFRET効率が青でプロットされています。トレースプレスを選択するには「はい」ボタンを押して、そうでない場合は「いいえ」を選択します。再アクセス時間トレースするには、「前へ」ボタンをクリックします。
- 映画の最後の分子までの手順を繰り返します。
- "|ファイルの保存」映画の中で最後の分子を分析した後をクリックして選択したトレースを保存します。 *の.sifファイルと同じフォルダに選択された痕跡を保存します。
- 繰り返しは、取得した全ての映画の5.10から5.13までを繰り返します。
- プログラムcombine_fret_results.mを実行します 。 * .resファイルのファイルとすべての* .FRETonly_traceファイルを含むフォルダを選択します。 MW.datのような分子単位のFRETとフレーム単位のFRETファイルを保存し、それぞれFRW.dat、。
注：* .datファイルをASCIIファイルとして保存されます。 FRW.datファイルには、各FRETフレームのための6つの列と1行が含まれています。第6列は、補正フレーム単位のFRET効率が含まれています。 MW.datファイルには、21列と選択されたFRET分子ごとに1行が含まれています。 3列目は、分子単位のFRET効率が含まれています。
6.ヒストグラムでsmFRETデータの表示
注：すべての記録smFRETデータの平均smFRET効率を抽出するために、フレーム単位のデータまたは分子単位のデータをヒストグラムにプロットし、ガウスは、（複数の）ピークにフィット用いて分析されます。以下では、プロトコルは、（材料リストを参照してください）商用データ解析ソフトウェアを使用しています。しかしながら、任意の他の利用可能なソフトウェアを代わりに使用することができます。
- データ解析ソフトウェアを開きます（材料リストを参照してください）。インポート| |複数のASCIIファイルをクリックします。 FRW.datファイルを含むフォルダを選択します。ファイルを選択し、を押して "OK＆＃34 ;.変更せずに「OK」と入力オプションを受け入れます。
- 統計| |ヒストグラム補正されたFRET効率を含む3番目の列C（Y）を選択し、列を選択しプロット上で右クリックします。ヒストグラムウィンドウで列をダブルクリックし、「自動ビニング」を選択解除し、所望のビンサイズ、 例えば 、0.05を選択します。また、例えば 、-0.025および1.025を最初と最後の値を選択します。
- それらを左クリックすることにより、ヒストグラムの列を選択します。次に右クリックして「ビンのワークシートに移動」を選択します。その上で左クリックし、「カウント」列を選択し、右クリックして選択プロット|コラム/バー/パイ|コラム。
- フィッティング| |非線形曲線フィット| [開く]ダイアログ列バープロットでは分析に移動します。 「パラメータ」ライダーに行く[関数の下に「ガウス」を選択します。自動パラメータ初期化の選択を解除します。 「フィット」に0をクリックでオフセット値（Y0）を修正しました。
注：フィット関数だけでなく、フィッティングデ尾部は、現在の列プロットに表示されます。 「XC」値はフィット機能、 すなわち、NPSのソフトウェアのための入力パラメータとなる平均FRET効率の中心を与えます。
量子収率の7測定
- ウルトらによって記載した手順と同様の相対的な方法で量子収率の決意を実行します。 35、標準としてのエタノールに溶解ローダミン101（QY = 91.5％）を使用。
- 1cmの経路長の吸収キュベットに80μLの容量を用いてUV-VIS分光計で記録吸収スペクトル。蛍光励起のために使用される波長での吸光度は0.05≤なければなりません。
- 光子計数モードで動作ランプにキャリブレーションスペクトロメーター上のレコード発光スペクトル。 SPECTRを使用してパス（マジック角条件）を励起（0°）にグラントムソン偏光子で測定を行い、放出（54.7°）それぞれ約5 nmおよび励起および発光モノクロメータ用2.5nmで、のアル帯域幅。計数率は10 6秒を超えないように注意しながら3mmの経路長と蛍光キュベットに転送-1後メジャーサンプル。
- に従って量子収率を計算します
ここで、nおよびn stdがそれぞれ、サンプルの溶媒および標準の屈折率です。 F（λ）とf_Std（λ）は波長λにおけるサンプルおよび標準の蛍光強度です。 （λEX）とstd（λexは ）励起波長でサンプルとリファレンスの吸光度であり、Φのstdが標準の量子収率です。
ル "> 8。等方性フォルスター半径の計算- （等方性のフェルスター半径を計算します
）ドナー分子の発光スペクトルから、アクセプター分子の吸収スペクトルは、ドナーの量子収量及び媒質の屈折率。の計算のためのフリーウェアPhotochemCADを使用します 。しかし、任意の他の利用可能なソフトウェアは、代わりに36を使用することができます。
）ドナー分子の発光スペクトルから、アクセプター分子の吸収スペクトルは、ドナーの量子収量及び媒質の屈折率。の計算のためのフリーウェアPhotochemCADを使用します異方性の9.測定
- 様々な励起/発光の偏光設定で蛍光スペクトルの記録から定常状態蛍光異方性を決定し（V / V、V / H、H / V、H / H）36。
- からの波長ごとに、楽器の偏光アーティファクトを補正するG-係数を計算比
各波長に対する異方性の値を計算するために使用します。
ここで、IをXYは 、励起偏光xおよび発光の偏光Yの強度を示します。
- 定常状態の蛍光異方性を計算するために、発光スペクトルの範囲にわたって値を平均します。
高速NPSソフトウェアの10.インストール
- http://www.cgl.ucsf.edu/chimeraからUCSFキマイラをダウンロードし、インストールガイドに従ってください。
- 「生物物理学研究所」のウェブサイトにアクセスしてくださいウルム大学：https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html。高速NPSの現在のバージョンをダウンロードし、任意のフォルダに展開します。 「再頒布可能」サブフォルダを開き、システムに適したのVisual C ++再頒布可能パッケージをインストールします。
11. PDBファイルをセンタリング
- キメラの関心のPDBファイル（複数可）を開きます。高分子複合体の全ての原子を選択し、重心の座標計算（ツール|構造解析|軸/プレーン/重心|重心を定義... | [OK]を）。
- および変換ツール（ツール|運動|座標を変換）|返信ログ（ログを返信お気に入り）を開きます。座標を変換ウィンドウのテキストボックスに「シフト」への返信ログに示す重心の座標を入力し、すべての座標の符号を変更します。押して「適用」と「保存PDB」（ファイル|保存PDB）を使用してファイルを保存します。
12.設定ポジション事前確率アップ
注：すべての値はオングストロームで考慮されています。
- テクニカルコンピューティング言語を起動し、ローカルファーストNPSフォルダに現在のフォルダを変更します。コマンドウィンドウに入力します：FastNPSを。
- プロジェクトマネージャー（|新規プロジェクト）に新しいjobfileを作成します。
- 位置を設定する前に（[ツール|型式染料前）。
- パネルでは「先行基本は「その値を入力して、前の位置の空間分解能を定義する（2を推奨）。
- チェックボックスを活性化し、「ロード・PDB」ボタンをクリックすることで、高分子の内部を除外します。第11節で説明したように中心にPDBファイルを選択し、ロードします。
- その値を入力して、色素のおおよその直径を（13Åが推奨され、議論を参照）を指定します。
- スケルトンの距離を入力し、 すなわち、距離色素分子は、（2Åを推奨）、高分子に浸透することができます。
- の中に（：[-150150]で[-150150]中のx、[-150150]におけるy、zの推奨）のパネルは、「最大前サイズは、「位置の前の最小と最大の座標を入力します。
- 衛星を定義する場合、パネルに「先行基本を「チェックボックス」柔軟なリンカーを介して添付ファイルを「活性化し、パネル「リンカー」で色素分子が結合している（中心PDBファイル内の）原子の座標を入力します。さらに、（13Åと4.5Åが推奨され、議論を参照）の長さとその値を入力して、リンカーの直径を指定します。アンテナの場合にはこの点をスキップします。
- 「アクセス可能な体積を計算する」ボタンを押してください。
- 前の位置を保存し、必要に応じて、キメラなどのソフトウェアを使用して可視化の目的のためにそれをエクスポートします。
ネットワークジオメトリの定義13
- 定義計測ウィンドウ（|編集ジオメトリモード）を開きます。
- お尻を押して、新しい色素分子を作成します。パネルで「新規」「染料」について。
- 値を入力して、その蛍光異方性（第9節）を設定し、ドロップダウンメニュー「染料モデル」内の染料のモデルを選択します。
- ボタン「ロード」を押して、前に対応する位置を選択して、色素の活性化]チェックボックスをオンにします。すべてのアンテナだけでなく、すべての衛星のために、すなわち 、すべての色素について、この手順を繰り返します。
- すべての染料を作成した後、測定値を定義します。パネル「測定」で「新規」をクリックして、新しい測定値を作成します。
- ドロップダウンメニュー「Dye1」と以下の「Dye2」でのFRETパートナーを選択します。
- エラーとsmFRET効率と、この色素対の等方性のフェルスター半径を入力します。
- 最後に、測定のアクティブ化チェックボックスをオンにします。すべての測定について、この手順を繰り返します。
注：ユーザーが混乱する可能性がありますように、多くの場合、ネットワークは、ますます複雑になります。プリベンするために、トンのミスは、「チェックネットワーク」ボタンを押すことで、視覚的にネットワークを確認してください。図は、活性化された染料を表示し、FRET染料を相互接続線を介して測定値を示しています。
14.計算
- （|計算モード）計算ウィンドウを開きます。
- ネットワーク内のすべての染料が割り当てられた特定のモデルを持っている場合は、「ユーザー定義」を選択し、「計算」を押して計算を開始。同じモデル内のすべての色素を持っているために、5つのモデル（古典的な、イソ、meanposイソ、VAR-meanpos - イソおよびVAR-meanpos）のいずれかを選択して続行します。
注：コマンドウィンドウは、計算の進行状況を示します。計算が完了したときに高速NPSは、ポップアップメッセージでそうなります。
結果の15.可視化
- 染料の信頼できるボリュームをエクスポートするためには、結果の表示画面（|結果の表示モデル）を開きます。
- エクスポート色素濃度：
- 輸出する単独で、またはすべて同時に染料。単一の色素がパネル」が表示染料」を押して「エクスポート密度」で選択エクスポートするために。解像度（2をお勧めします）を入力し、輸出用のファイルの種類を選択します。右側の密度がプレビューされ、その数学的特性の一部が示されています。
- すべての色素をエクスポートするためには、同時に「バッチエクスポート」を押してください。
- キメラが生じ密度ファイルを開きます。
選択されたモデルの組み合わせの16整合性チェック
- ビューの結果ウィンドウを開きます（モデル|結果の表示）。パネル「計算情報」テキストボックスに「一貫性」の値よりも低い90％が表示された場合、現在のモデルは、十分に測定smFRET効率を表すため、矛盾していません。
- 矛盾の場合はボタン「詳細一貫性」を押してください。 90％以下の値を持つ測定を検索します。一つ以上の染料の場合sは主にこれらの測定に関与している、彼らのモデルは矛盾を引き起こす可能性があります。これらの色素のための異なる色素のモデルを検討し、高速NPS計算を再実行します。
Representative Results
転写は全ての生物における遺伝子発現の最初のステップです。古細菌では、転写は、単一のRNAポリメラーゼ（RNAP）によって行われます。単純な転写機構を有しながら、真核生物と比較して、古細菌のRNAPは彼らの真核生物のカウンターパートへの印象的な構造似ています。このように、古細菌は、RNAポリメラーゼII（ポルII）の真核生物の転写開始を研究するためのモデル系として使用することができます。最近、古細菌RNAポリメラーゼオープン複合体の完全なアーキテクチャは、単一分子FRETおよびNPSから決定されています。 NPS分析からのデータは、転写開始のメカニズムに有益な洞察を提供し、完全な古細菌オープンプロモーター複合体のモデルを構築するために使用されました。
この構造を解明するために、smFRET効率がオープンプロモーターコム内に位置する未知のアンテナ色素分子間で測定しました。プレックスとポジション結晶構造（PDB-ID：2WAQ）から知られているRNAP、の5つの参照サイトで組み込まれたいくつかの既知の衛星色素分子37。アンテナ色素は、非鋳型DNA、TFB、TBPまたはTFEの異なる位置のいずれか一方に取り付けられました。本研究で用いた完全なネットワークは、60以上の測定された距離から成っていました。
図7は、NPS分析から構築された完全な古細菌オープンプロモーター複合体のモデルを示しています。これは、二本鎖プロモーターDNA（光とダークブルー）、RNAポリメラーゼ（灰色）および転写開始は、TBP（紫）、TFB（緑）、TFE（黄色）の係数を備えます。モデルは、古典的なモデル（A）、ISOモデル（B）、meanposイソモデル（C）、VAR-meanposイソモデルを用いて計算したNPS分析の結果、信頼性の高いボリュームと重畳されます（D）とVAR-meanposモデル（E）。
図1： ファスト-NPS計算に必要なパラメータの取得および処理のワークフロー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：smFRET イベントの代表的な蛍光強度の時間トレース。ドナー（緑色）の蛍光強度と3つの特徴の段階、すなわちI示すアクセプター分子（赤）：smFRET、II：アクセプター光退色後のドナー蛍光、III：バックグラウンド蛍光ドナー退色後を。g2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：smFRET 実験のためのフローチャンバの模式図。フローチャンバーは、アクリルガラスホルダーでカスタマイズ金属ホルダに取り付けられます。フローチャンバーのサンドイッチ設計は、石英ガラス（溶融シリカ）入口および出口チューブを取り付けるための2つの穴を有するスライド、封止膜とフローチャンバーを閉鎖カバースリップを含みます。 TIRF照明のためのプリズムは、フローチャンバの下半分に取り付けられます。中空タブねじはフローチャンバーのための入口と出口を提供します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 石英ガラススライドの調製及び封止膜。 （ミリメートル単位で与えられる）の穴の位置を示す石英ガラススライドの機械的な図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： フローチャンバーの機械製図。アルミプリズムホルダのための対策は、アクリルガラスホルダーとアルミ取付枠の単位はmmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図6：smFRET 実験に使用したプリズム型TIRFセットアップの模式図。光学部品用略語：A、開口; DM、ダイクロイックミラーと、 F、発光フィルター; L、レンズ; M、ミラー; O、客観; P、プリズム。 PSD、位置敏感型フォトダイオード。 S、サンプル; PS、位置決めステージ。 T、望遠鏡。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7： 異なるモデルの仮定のシミュレーション結果。 、（それぞれ、青、シアンでTDNAとntDNA）プロモーターとともにDNAのためのモデルとTBP（紫）、TFB（緑）、TFE（黄色）：全ての写真は古細菌RNAポリメラーゼ（2WAQ、上面図PDB-ID）を表示します古細菌に複雑な30を開きます。信頼できるボリュームは、（A）の古典的モデル、（B）は、ISOモデル（C）meanposイソモデル、（D）VAR-meanposイソモデル及び（E）のNPSのシミュレーション結果をVARのために重畳されます-meanposモデル。すべてのボリュームは68％の信頼性で示されています。クラシックとVAR-meanposネットワークはsmFRETデータと一致しています。これとは対照的に、すべての染料のISO、meanpos - イソまたはVAR-meanpos - イソモデルが選択されているネットワークは、測定したデータと矛盾しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
私たちは、正確に生体高分子に柔軟なリンカーを介して結合している染料、 すなわち 、核酸および/またはタンパク質間のFRET効率を決定するためのセットアップおよび実験手順を提示します。
精密smFRET測定（セクション3）を確保するためには、測定中の任意の時点でフローチャンバーから空気を排除することが重要です。さらに、蛍光体でフローチャンバーに過負荷をかけないようにしてください。フルオロフォアは明らかに正しい分析を確実にするために分離されなければなりません。ドナーの漂白を示さないsmFRETペアは、分析から除外されなければならないように、視野内の分子の> 80％は映画の終わりに漂白されていることを確認してください。サンプルβ-因子およびγ-ファクタの不均一性を考慮するために、ドナーとアクセプターチャネルのクロストークと相対検出効率を補正し、それぞれ、個別に各FRET対に対して計算されています。
蛍光分光計（セクション7〜9）の測定のための信号強度と記録されたデータのスペクトル分解能との間の良好な妥協点を見つける必要があります。この目的のために蛍光分光計の励起および発光経路のスリットを用いる機器、サンプル濃度に依存するように適合されなければなりません。
さらに、我々は、一過性または動的MACROMの構造情報を得るために高速NPS分析法を提示しますolecular複合体。 NPSは、非鋳型DNA鎖と古細菌RNAポリメラーゼオープン複合体における転写開始因子の位置の経路を明らかにするために適用されています。 60以上の異なる距離測定のネットワークを使用して、我々はその新しく実装されたサンプリング・エンジン（準備中Eilert、T.、ベッカー、M.、・ドレクスラー、F.、＆ミカエリス、J）を装備した高速NPS、示しました元のグローバルNPS法27に比べて、大きさの≈2オーダーすることによって、この複雑なsmFRETネットワークの解析に必要な時間を短縮します。アルゴリズムの堅牢性は、レプリカ交換法のスキームと組み合わせメトロポリス-内-ギブスサンプラーに根ざしています。高速NPSは、ネットワークの結果の正確な再現性を示し、30以前公開された結果と一致しています。
いくつかの異なる方法がsmFRET測定11から構造情報を推測することを目指して公開されています>、12、13、14、15、16、17、18。これらのアプローチの全ては、1つの特定の色素のモデルを提供します。このように、それぞれのモデルによって作られた仮定を満たしていない染料は、使用されるか、または虚偽の構造情報に導くことはできません。高速NPSは、逆に、各色素分子のための別のモデルを選択することができます。これは、異なるコンホメーションの両方の行動、色素分子自体、ならびにその結合のために使用されるリンカーを説明するために役立ちます。色素分子の局所分子周囲だけでなく、その物理的性質が最も適切であるモデルを決定します。
古細菌の開始複合体の分析smFRETネットワークでは、すべての色素分子のための等方性の仮定は大幅な減少の私につながりますnは信頼できるボリュームのサイズ古典的なモデルと比較して。すべての色素のための平均動的位置との組み合わせで（95％で）すべての信頼できるボリュームサイズの中央値が0.5nm未満3に減少する分子。しかし、これらの色素分子の事後は仮定が偽構造情報とリードを作っていることを示す、そのsmFRET測定値ともはや一致していません。これとは対照的に、古典的なモデルで決定された事後が決定smFRET効率と一致しています。
等方性および/または全ての染料のための平均動的位置の仮定が矛盾につながるように、高速NPSは、各色素が5モデルのいずれかを割り当てることが可能な色素分子の事前確率を可能にします。各モデルは、同じアクセス可能なボリュームを使用しています。色素のAVを計算するためのアルゴリズムは、いくつかの仮定を行います。最初は、フルオロフォアの空間的形状は球で近似されます。このように、直径が考慮フォアのWIDを取ります番目、高さと厚さは、（第12節）を使用する必要があります。また、リンカの形状は、柔軟なロッドで近似されます。第12節で提示値は12-Cリンカーを介して結合した色素アレクサ647用に計算しました。今日まで、実験のジオメトリを考慮すると、正確なモデルが最も適している事前に決定することは不可能であり、したがって、すべてのモデルは、試験されるべきです。静止画データと一致しながら、一般的に、人は、可能な最小後方サイズを与えるモデルを選択します。モデルの選択はsmFRETデータと一致しているかどうかをテストするために、我々は事後尤度の両方を計算します。一貫性は、後方から採取した試料の90％以上は、可能性の95％信頼区間内にあることを意味します。
それが真である間、色素分子のsmFRETネットワークにおいて、距離不確定小さく、異方性低い幾何学的配置も考慮しなければならないこと。したがって、R一方典型的な最初の選択肢は、ISOモデルと低蛍光異方性と染料分子をさepresenting、一貫性のテストは、正しい染料モデルを選択するためのより直接的な手段を提供します。染料モデルの最適な選択は、ローカリゼーション精度の大幅な増加をもたらすと同時に、そのFRETのデータとネットワークの整合性を保持することができます。
要約すると、高速NPSは、大きな高分子複合体の構造や動的な情報を得ることができます。例えば、X線結晶学または低温電子顕微鏡法などの一般的な構造的方法とは対照的に、これは大幅に複雑な生物学的プロセスの我々のメカニズムの理解を広げ、非常に柔軟なまたは一過性の複合体をモニターすることを可能にします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowchamber preparation | |||
| Customized metall sample holder | self-built | n/a | |
| quartz-glass slides, 76 mm x 26 mm | Technical Glass Products | 26007 | |
| coverslips, 60 mm x 24 mm | Marienfeld | 101242 | |
| detergent, Hellmanex II | Hellma | 320.001 | |
| ultra-pure water from Synergy UV | Millipore | 2512600 | |
| Zepto plasma cleaner | Diener | n/a | |
| (3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a. | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | |
| biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | BIOTIN-PEG-SVA-5000 | |
| Sodium biocarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 Sigma | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S2127 Sigma-Aldrich | |
| sealing film (Nescofilm) | Fisher Scientific | 12981805 | |
| Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD | Saint-Gobain Performance Plastics | 720958 | |
| Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical) | Fisher Scientific | 12665497 | |
| Neutravidin | Life Technologies | A2666 | |
| Total internal reflection fluorescence microscope | |||
| Nd:YAG Laser, 532 nm | Newport Spectra-Physics | EXLSR-532-100-CDRH | |
| diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso | Cobolt | 904010050 | |
| diode laser 643 nm, iBeam smart | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | |
| dichroic mirror, 532 RDC | Chroma | F33-540 | |
| dichroic mirror, 476 RDC | Chroma | F33-476z | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic | AOTFnC-VIS | |
| plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm | Thorlabs | LJ1703L1-A | |
| plano-concave cylindrical, f = -300 mm | Thorlabs | ||
| prism, PS 991 | Thorlabs | PS991 | |
| focusing lens, f = 75 mm | Thorlabs | LA1608-B | |
| syringe pump, PHD 2000 | Harvard Apparatus | 70-2002 | |
| 2 stepper motors, Z812B | Thorlabs | Z812B | |
| piezoelectric actuator, PE4 | Thorlabs | PE4 | |
| IR diode laser | Edmund Optics | CPS808 | part of the autofocus system |
| dichroic mirror, 775 DCXR | Chroma | 775 DCXR | |
| position-sensing detector (PSD), PDP90A | Thorlabs | PDP90A | part of the autofocus system |
| water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2 | Nikon | MRD07601 | |
| dichroic mirror, 645 DCXR | Chroma | 645 DCXR | part of the emission pathway |
| emission filter, 3RD550-510 | Omega Optical | 3RD550-510 | green channel in the emission pathway |
| emission filter, 3RD660-760 | Omega Optical | 3RD660-760 | red channel in the emission pathway |
| EMCCD camera, iXon+ DU897EBV | Andor | AND-20-00032 | |
| EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV | Andor | AND-20-000141 | |
| Miscellaneous | |||
| Varian 50 | Cary | UV-VIS spectrometer | |
| Fluorolog2 | SPEX | fluorescence spectrometer | |
| Solis (V4.15) | Andor | control software for the EM-CCD camera | |
| Apt user utility (V1.022) | Thorlabs | control software for the piezo-motors | |
| Norland Optical Adhesive 68 | Thorlabs | adhesive | |
| PC-AFN-0.8 Nile red | Kisker Biotech | avidin-coated fluorescent multispec beads | |
| Matlab | Mathworks | technical computing language for custon written software | |
| Origin (V9.0) | Originlab | scientific graphing and data analysis software | |
| Hellma 105-202-15-40 | Hellma | 105-202-15-40 | absorption cuvette of 1 cm path length |
| Hellma 105-251-15-40 | Hellma | 105-251-15-40 | fluorescence cuvette with 3 mm path length |
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