هناك حاجة إلى طرق عزل جديدة للخلايا البطانية الأولية من الأوعية الدموية. يصف هذا البروتوكول تقنية جديدة تعكس الأوعية الدموية ذات الأهمية تماما ، وتعرض الجانب البطاني فقط للهضم الأنزيمي. يمكن استخدام ثقافة الخلايا البطانية النقية الناتجة لدراسة أمراض القلب والأوعية الدموية ونمذجة الأمراض وتكوين الأوعية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزلة والثقافة من الخلايا البطانية الأولية من الشرايين والأوردة الكلاب
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تمت دراسة أمراض القلب والأوعية الدموية في كل من الطب البشري والبيطري. تم استخدام الخلايا البطانية على نطاق واسع كنموذج في المختبر لدراسة تكوين الأوعية الدموية ، وتكوين الأوعية الدموية (الورم) ، وتصلب الشرايين. المعيار الحالي للبحث في المختبر على الخلايا البطانية البشرية (ECs) هو استخدام الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) والخلايا البطانية للشريان السري البشري (HUAECs). بالنسبة لأبحاث بطانة ، يتوفر خط خلوي واحد فقط (CnAOEC) ، وهو مشتق من بطانة الأبهر في. على الرغم من عدم فهمها تماما حاليا ، إلا أن هناك فرقا بين ECs التي تنشأ من الشرايين أو الأوردة. للحصول على نهج أكثر مباشرة لدراسات الوظائف في المختبر على ECs ، نصف طريقة جديدة لعزل الخلايا البطانية الأولية للكلاب (CaPECs) من مجموعة متنوعة من الأوعية. تقلل هذه التقنية من فرصة التلوث بالخلايا سريعة النمو مثل الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء ، وهي مشكلة شائعة في طرق العزل القياسية مثل شطف الوعاء الدموي بالمحاليل الأنزيمية أو فرم الوعاء الدموي قبل هضم الأنسجة التي تحتوي على جميع الخلايا. تم تحسين التقنية التي وصفناها لنموذج ، ولكن يمكن استخدامها بسهولة في الأنواع الأخرى مثل الإنسان.
المقدمة
وتستخدم الكلاب كنموذج الحيوانات الكبيرة لأبحاث أمراض القلب والأوعية الدموية ويمكن أيضا تعاني من وراثي (الوراثية) تشوهات الأوعية الدموية 1 و 2. ولدراسة هذه الأمراض غالبا ما تستخدم خطوط الخلايا البطانية التجارية لتقييم الخلايا البطانية وظيفة (EC). للكلاب هناك خط الخلية البطانية تجاري واحد متاح (CnAOEC)، والمستمدة من الشريان الأورطي الكلاب. يستخدم هذا الخط خلية معظمها في دراسات عن التحكم العادي ECS 3-5. في مجال البحوث القلب والأوعية الدموية البشري خطوط الخلايا البطانية الأكثر شيوعا هي خلايا الحبل السري الإنسان الوريد غشائي (HUVECs) والسري الإنسان الشريان الخلايا البطانية (HUAECs) المستمدة من الوريد البشري الح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم حصاد الأوعية الدموية المستخدمة في هذه الدراسة كمادة فائض تم الحصول عليها من الجثث الكلاب طازجة (ن = 4) من الكلاب صحية الموت الرحيم للبحث لا علاقة لها (سياسة جامعة 3R) الأخرى: الأخلاق بيان. تم حصاد الأوعية الدموية الشاذة (يحول بوابية مجموعية البينية وخارج الكبد، ن = 1 لكل منهما) بعد الوفاة بعد الموافقة المسبقة من أصحابها من الكلاب التي قدمت إلى عيادة الجامعة للحيوانات مدللة من جامعة أوتريخت.
1. العزلة والثقافة من الخلايا الابتدائية الناب غشائي
- قبل معطف 6 لوحات جيدة مع ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تعرض الأوعية الدموية المختلفة بنجاح إلى بروتوكول العزلة وصفها (الشكل 2). كان من الممكن لتشريح وعكس الشريان الأبهر، الوريد الأجوف، بورتا الوريد، والشريان التاجي من الكلاب صحية (جميع السفن من كل كلب، ن = 4). مع وعزل ECS النهج نفسه من اثنين يحول بوابية مجموعية الخلقية (خارج الكبد وداخل الكبد، ن = 1 لكل منهما). على الرغم من الشريان الأورطي ومقلوب بسهولة، كانت قطاعات الشريان الأورطي الصدري أكثر صعوبة من الشريان الأورطي البطني. في قطاعات.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في الدراسات التي تركز على الكلاب ECS يستخدم الخط الأساسي CnAOEC لنموذج الأنساب البطانية الكلب 3 و 12 و 13. في الدراسات الإنسانية، ثقافة HUVEC لا يزال يعتبر معيار الذهب. ومن الواضح أن مجرد التركيز على ECS المستمدة من الحبل السري هو تقييد راسخ في الأبحاث القلب والأوعية الدموية. الخلايا البطانية لديها نمط التعبير الجيني محددة تحديد مواصفات الشرايين والأوردة. وذلك لحساب هذه الاختلافات في الأوعية بعد الولادة فإننا نتقدم بهذه الطريقة العزلة رواية استنادا إلى موقع تشريحي معين .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم لهانز دي جراف وتوماس فينيندال لمساعدتهم الفنية في ثقافة ECs.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| تقنيات الكولاجيناز من النوع الثاني | Life | Technologies 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| نمو الخلايا البطانية للكلاب | تطبيقات الخلايا | Cn211-500 | |
| CnAOECs | تطبيقات الخلايا | Cn304-05 | |
| مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) ؛ | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| طقم توليف iScript | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| خلية الاسترداد التجميد المتوسطة | Gibco / Life Technologies | 12648-010 | حافظ على الجليد قبل استخدام |
| حاوية التجميد ، Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| مقص جراحي (Mayo أو Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| ملقط البعوض ؛ | ب. براون الطبية | FB440R | |
| ملقط البعوض منحني | ب. براون الطبية | FB441R | |
| بولي جللاكتين 3-0 | إيثيكون | VCP311H | |
| تريبان الأزرق | Bio-Rad | 145-0013 | |
| غرفة العد الآلي | Bio-Rad | 145-0102 | |
| العد ، غرفة مزدوجة | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | تذوب ببطء على الجليد |
| & -Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | لونزا | CC-4176 |
المراجع
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
