Introduction
وتستخدم الكلاب كنموذج الحيوانات الكبيرة لأبحاث أمراض القلب والأوعية الدموية ويمكن أيضا تعاني من وراثي (الوراثية) تشوهات الأوعية الدموية 1 و 2. ولدراسة هذه الأمراض غالبا ما تستخدم خطوط الخلايا البطانية التجارية لتقييم الخلايا البطانية وظيفة (EC). للكلاب هناك خط الخلية البطانية تجاري واحد متاح (CnAOEC)، والمستمدة من الشريان الأورطي الكلاب. يستخدم هذا الخط خلية معظمها في دراسات عن التحكم العادي ECS 3-5. في مجال البحوث القلب والأوعية الدموية البشري خطوط الخلايا البطانية الأكثر شيوعا هي خلايا الحبل السري الإنسان الوريد غشائي (HUVECs) والسري الإنسان الشريان الخلايا البطانية (HUAECs) المستمدة من الوريد البشري الحبل السري والشريان، على التوالي. وقد استخدمت HUVECs كمعيار ذهبي في مجال البحوث الأوعية الدموية منذ 1980s 6. وهي تعتبر أن النظام النموذج التقليدي لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية والتكيف مع المرض. الخلايا البطانية معزولة من الأوعية الدموية المختلفة تختلف في المظهره وظيفة بسبب الخلفية الوراثية والتعرض لالمكروية 7. وبالإضافة إلى ذلك، وتستمد HUVECs وHUAECs من الحبل السري، وهيكل الأوعية الدموية التنموية التي قد لا الأوعية الدموية الكبار تقليد تماما فيما يتعلق الظروف التي يتعرضون لها والاستجابة للمرض. وبالتالي، ترجمة نتائج في HUVECs وHUAECs لمرض القلب والأوعية الدموية بشكل عام غير كافية.
عند دراسة التكيف وسلوك الكبار ECS، ECS الأولية من السفينة من الاهتمام ينبغي أن تستخدم باعتبارها نهجا أكثر مباشرة. لعزل هذه الخلايا، وقد تم الإبلاغ عن العديد من الطرق. وهناك طريقة وصفها على نطاق واسع، والذي يستخدم أيضا لHUVECs، وفلاشينغ السفينة مع حل الهضم الأنزيمي 8. هذا غالبا ما يؤدي إلى تلوث مع غير ECS مثل خلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية 9. آخر الطريقة المستخدمة في كثير من الأحيان لعزل هو الهضم الأنزيمي من الأنسجة سفينة مفروم تليها fluorescence-خلية تنشيط الفرز (FACS) بناء على البطانية العنقودية خلية علامة على التمايز (CD) 31 7، 8. FACS الفرز وزراعة الخلايا اللاحقة تتطلب كميات كبيرة نسبيا من الخلايا وبالتالي فهي ليست مناسبة لعزل البطانة من الأوعية الدموية الصغيرة. وبالتالي فإننا تهدف إلى تطوير وسيلة قوية جديدة لعزل محض السكان الخلية البطانية من مختلف الأوعية الدموية الكلاب مع نقاء عالية. لاختبار كفاءة أسلوب العزلة جديد، ونحن عزل وحصل نقية الثقافات الناب الابتدائية الخلية البطانية (CaPEC) من الشرايين والأوردة الكلاب مختلفة، كبيرها وصغيرها. يتيح هذا الأسلوب أيضا ثقافة الخلايا البطانية التي تنشأ من المريضة و / أو الأوعية الشاذة مثل يحول بوابية مجموعية داخل الإقليم أو خارج الكبد وراثي، وهو مرض شائع في الكلاب 2. يسمح طريقة عزل أنواع الخلايا ذات الصلة إضافية من السفينة نفسها مثل خلايا العضلات الملساء الوعائية منذ أكثر من السفينة لا تزال كثافة العملياتالتصرف أثناء العملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم حصاد الأوعية الدموية المستخدمة في هذه الدراسة كمادة فائض تم الحصول عليها من الجثث الكلاب طازجة (ن = 4) من الكلاب صحية الموت الرحيم للبحث لا علاقة لها (سياسة جامعة 3R) الأخرى: الأخلاق بيان. تم حصاد الأوعية الدموية الشاذة (يحول بوابية مجموعية البينية وخارج الكبد، ن = 1 لكل منهما) بعد الوفاة بعد الموافقة المسبقة من أصحابها من الكلاب التي قدمت إلى عيادة الجامعة للحيوانات مدللة من جامعة أوتريخت.
1. العزلة والثقافة من الخلايا الابتدائية الناب غشائي
- قبل معطف 6 لوحات جيدة مع 2 مل / جيد 0.5٪ ث / ت الجيلاتين ويترك لمدة 2 ساعة في حاضنة مع جو مرطب من 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. إزالة حل الجيلاتين الزائد قبل البذر الخلايا الأولية.
- جو معقم و مطهر إزالة الأوعية الدموية (ق) من الفائدة (على سبيل المثال، الشريان الأبهر، الوريد الأجوف، الوريد بورتا) من جديد الكلاب جيفة (الشكل 1A). الحفاظ على تشريح الجهاز سفينةعن طريق وضع ملقط على التوالي على طرفي السفينة من الفائدة. تجنب التلاعب غير الضرورية من النسيج مع ملقط لمنع تلف الخلايا البطانية.
- قطع السفينة فرضت على طرفي مع مقص جراحي وإزالتها من جيفة. النقل في هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) على الجليد.
ملاحظة: طول السفينة حوالي 5 سم ويفضل لهذا الإجراء، ولكن تلك التي تقيس 1 سم أيضا توفير ما يكفي من الخلايا في الثقافة.
- قطع السفينة فرضت على طرفي مع مقص جراحي وإزالتها من جيفة. النقل في هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) على الجليد.
- نقل الأوعية الدموية إلى طبق بيتري مليئة HBSS الجليد الباردة. باستخدام مقص جراحي، وإزالة أي نوع من الأنسجة الملتصقة والدهون من خارج السفينة، والحفاظ على السفينة نفسها سليمة (الشكل 1B). تأكد من السفينة واضحة للعيان في جميع الأوقات عند قطع: سحب جانبا الأنسجة المحيطة بها مع المشبك أو الملقط لمشاهدة الأمثل.
- إغلاق أي فروع للسفينة مع الأربطة (على سبيل المثال، polyglactin 3-0) وبعد ذلك إزالتهامع مقص جراحي أو مشرط.
- بعناية إدخال نهاية السفينة مع منحني ملقط البعوض هالستيد، المشبك غيض من ملقط في الطرف الآخر من السفينة ومن ثم التراجع، عكس ببطء السفينة حتى هو تماما الداخل الى الخارج (الشكل 1C-G). يتكون الخارج الآن من طبقة الخلايا البطانية. إذا واجهت أي صعوبة على عكس السفينة، يغرق في HBSS مرة أخرى للحد من الاحتكاك.
- وضع الغرز صارة على طرفي السفينة لإغلاقه تماما ومنع التعرض للأي نوع من الأنسجة الوعائية غير البطانية لإجراء عملية الهضم (الشكل 1H). استخدام نهايات الربطة على التعامل مع السفينة المقلوبة.
- إذا تم تنفيذ عملية الهضم والثقافة في وقت لاحق، cryopreserve السفينة المقلوبة قبل بروتوكول الهضم (الخطوة 1.7).
- وضع السفينة المقلوبة في cryovial وملء مع ثقافة الخلية تجميد المتوسطة. تجميد أسفل إلى -80 درجة مئوية باستخدام شارك تجميدNTAINER. مخزن في -80 درجة مئوية إذا السفن التي ستستخدم خلال أسبوع واحد. للتخزين على المدى الطويل، cryovials مكان في -180 درجة مئوية. عند تنفيذ العزلة الأوروبية، ذوبان الجليد في cryovials بسرعة في حمام مائي (37 درجة مئوية) ووضع على الفور في الجليد الباردة HBSS. المضي قدما كما هو مبين في 1.7.
ملاحظة: خذ بعين الاعتبار أن العائد الكلي للECS بعد العزلة سيكون أقل بسبب فقدان الجدوى خلال عملية التجميد.
- وضع السفينة المقلوبة في cryovial وملء مع ثقافة الخلية تجميد المتوسطة. تجميد أسفل إلى -80 درجة مئوية باستخدام شارك تجميدNTAINER. مخزن في -80 درجة مئوية إذا السفن التي ستستخدم خلال أسبوع واحد. للتخزين على المدى الطويل، cryovials مكان في -180 درجة مئوية. عند تنفيذ العزلة الأوروبية، ذوبان الجليد في cryovials بسرعة في حمام مائي (37 درجة مئوية) ووضع على الفور في الجليد الباردة HBSS. المضي قدما كما هو مبين في 1.7.
- نقل السفينة إلى أنبوب 50 مل وشطفه مرتين في HBSS لإزالة كريات الدم الحمراء (أو المتوسطة تجميد المتبقية في حالة الذوبان) (الشكل 1I).
- هضم السفينة في أنبوب 50 مل بمحلول مكون من 30 مل نوع كولاجيناز الثاني (0.15 U / مل)، وdispase (0.15 U / مل) في خلايا الناب غشائي النمو المتوسطة (CECGM) لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية مع متقطعة لطيف الإثارة.
- إزالة وعاء من الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 250 × ز.
- resuspend الكرية خلية في CECGM لالثانية البذور 2 تعليق خلية مل لكل بئر (1-3 الآبار اعتمادا على حجم السفينة). ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO 2 في الهواء وتغيير مستنبت مرتين في الأسبوع.
- مرور الخلايا عندما confluency من 70 - يتم التوصل إلى 80٪.
- غسل الخلايا مع حرارة ما قبل HBSS لإزالة الخلايا الميتة أو غير المرفقة. إضافة 200 ميكرولتر المؤتلف انزيم الخلية تفارق (1X) إلى كل بئر والمكان مرة أخرى في الحاضنة لمدة 5 دقائق أو إلى أن يتم فصل كل الخلايا.
- نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل ووقف trypsinization بإضافة 10 مل من وسائل الاعلام والثقافة (CEGM) بما في ذلك 10٪ الجنين العجل المصل (FCS). أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 250 × ز. تواصل الثقافة في الجيلاتين قبل المغلفة لوحة أو قارورة.
2. توصيف
- ثقافة الخلايا الناب الأورطي غشائي (CnAOECs) والمقارنة بين التشكل من خطوط الخلايا الأولية والتجارية مرتين أسبوعيا مع المجهر.
ملاحظة: Tانه نموذجية تزايد نمط ECS في بقع يمكن أن يكون أفضل لاحظ عندما يتم التوصل إلى confluency من> 70٪.- ثقافة CnAOECs في CECGM على قارورة T75 0.5٪ ث / ت الجيلاتين قبل المغلفة. خلايا مرور مرة واحدة في الأسبوع عندما confluency هو 70-80٪.
- لالركض، وغسل خلايا مرة واحدة مع درجة حرارة ما قبل HBSS وإضافة 1 مل المؤتلف خلية التفكك انزيم (1X). ضع قارورة مرة أخرى في حاضنة لمدة 5 دقائق أو إلى أن يتم فصل كل الخلايا. تعطيل التربسين بإضافة مستنبت 10 مل (CEGM) بما في ذلك 10٪ FCS. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 250 x ج، تجاهل طاف و resuspend الخلايا في مستنبت 1 مل.
- اتخاذ قسامة 10 ميكرولتر من التعليق الخلية وتمييع 1: 1 مع 0.4٪ التريبان الأزرق. عد الخلايا باستخدام عداد الخلية الآلي، ولوحة من 4.0 × 10 5 خلايا قابلة للحياة في قارورة T75 الجديدة. إضافة 10 مل من CECGM قبل تحسنت إلى قارورة والثقافة في 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO 2.
- ثقافة CnAOECs في CECGM على قارورة T75 0.5٪ ث / ت الجيلاتين قبل المغلفة. خلايا مرور مرة واحدة في الأسبوع عندما confluency هو 70-80٪.
- عزل الحمض النووي الريبي من مرور 1 من CaPECs مثقف وCnAOECs.
- جمع لا يقل عن 1 × 10 3 خلايا باعتباره بيليه، إضافة 20 ميكرولتر من كاشف إعداد العينات (SPR)، واحتضان لمدة 1 دقيقة لليز الخلايا. بعد مرور فترة الحضانة، وجمع بعناية المحللة خلية تحتوي على الحمض النووي الريبي مجموع ومخزن في -70 درجة مئوية.
- تحويل مرنا إلى كدنا] باستخدام عدة توليف [كدنا (على سبيل المثال، iScript) تنفيذا لتعليمات الشركة المصنعة. متجر كدنا] في 4 درجات مئوية تصل إلى أسبوع واحد، أو في -20 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل حتى على استعداد لأداء QPCR.
- قياس التعبير الجيني للCD31 علامة البطانية لتأكيد أصل الخلايا البطانية. أداء الإعداد التجريبية والكمي باستخدام المبادئ التوجيهية المحاضر الموجزة MIQE 10. للتطبيع، وقياس التعبير عن الجينات إشارة GAPDH، RPS19، وB2MG 11.
- إعداد التخفيف 10 أضعاف من كدنا] التي تم الحصول عليها في المياه الحرة نوكلياز.
- إعدادالتخفيف 4 أضعاف من عينات كدنا] تجميع للخط القياسية واستخدام المياه مجانا نوكلياز كعنصر تحكم غير القالب. تمييع عينات خمس مرات للوصول إلى التخفيف الكلي 50 ضعفا عن ردود الفعل QPCR. ماصة 10 ميكرولتر ردود الفعل في مكررة في شكل 384 جيدا باستخدام 4 ميكرولتر [كدنا و 6 ميكرولتر من fluorophore مختلطة مع 20 بمول من الاتجاه المعاكس والتمهيدي إلى الأمام (الجدول 1).
- وضع برنامج ل95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتنشيط البلمرة طق، تليها 39 دورات من 10 ثانية في 95 درجة مئوية لمدة تمسخ، و 30 ثانية في تيم لالصلب واستطالة. يظهر تيم لكل مجموعة التمهيدي في الجدول 1.
- أداء ذوبان منحنى تحليل بعد كل شوط لضمان منتج واحد فقط يتم تضخيمه. تطبيع مستويات التعبير من العينات باستخدام متوسط الكمية النسبية للجينات مرجعية، وحساب ΔCt إذا كانت فعالية رد الفعل ما بين 95٪ و 105٪.
- تقييم الأداء الوظيفي EC مع أنجيogenesis الفحص.
- إضافة 10 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية إلى كل بئر من شريحة الأوعية الدموية تبرد قبل وانتشرت مع طرف ماصة لتغطية سطح البئر. الحفاظ على المصفوفة خارج الخلية على الجليد وتجنب إدخال فقاعات الهواء في هلام. ترسيخ هلام عن طريق وضع شريحة في طبق بيتري مع الماء المنقوع المناشف الورقية في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 1.0 × 10 4 الابتدائي ECS في 50 ميكرولتر غشائي النمو المتوسطة لكل بئر. احتضان الشريحة لمدة 6 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- بعد 6 ساعات التقاط الصور مع التكبير 20X، والتأكد من أن تشمل البئر كله في الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تعرض الأوعية الدموية المختلفة بنجاح إلى بروتوكول العزلة وصفها (الشكل 2). كان من الممكن لتشريح وعكس الشريان الأبهر، الوريد الأجوف، بورتا الوريد، والشريان التاجي من الكلاب صحية (جميع السفن من كل كلب، ن = 4). مع وعزل ECS النهج نفسه من اثنين يحول بوابية مجموعية الخلقية (خارج الكبد وداخل الكبد، ن = 1 لكل منهما). على الرغم من الشريان الأورطي ومقلوب بسهولة، كانت قطاعات الشريان الأورطي الصدري أكثر صعوبة من الشريان الأورطي البطني. في قطاعات الصدري الشريان الأبهر لديه العديد من الشرايين الوربية المتفرعة منه، والتي تحتاج إلى أن ligated بشكل فردي لضمان التعرض البطانية بدقة إلى حل الهضم. شمل الجزء تشريح الوريد الأجوف الذيلية نقطة تفرع شرايين الكلى، والتي تحتاج إلى ligated قبل انقلاب. للبوابة الوريد فرع المساهمة من المعدي الوريد كان ligated قبل انعكاس للاوعية الدموية. وcoronarذ الشريان في الكلاب هو وعاء أصغر بكثير الدم (حوالي 1-2 مم في كلب متوسطة الحجم)، من الذي نحن رفعه جزء من فرع المنعطف. لأنه يحتوي على القطر الصغير، ثبت أن يكون من الأسهل إلى عكس قطعة قصيرة بدلا من 1 سم لأنه لا يمكن إدراج ملقط البعوض أبعد من ذلك بكثير.
كانت يوم واحد بعد عزل خلايا الالتزام مرئية في لوحة الثقافة. في الثقافة، وكان CaPECs شكل متعدد الأضلاع واتجاها للنمو في تصحيحات كما هو مبين في الشكل (3) العديد من مستعمرات الخلايا البطانية ويمكن ملاحظة 3 - بعد 6 أيام العزلة. بعد ما يقرب من 10 أيام في الثقافة تم التوصل إلى confluency من 80٪، ويمكن تجاوز الخلايا. في المتوسط يمكن الحفاظ على الثقافات البطانية الابتدائية لمدة أقصاها 8 ممرات (مرة واحدة أسبوعيا بمعدل انقسام 1: 4) توقفوا عند هذه النقطة المتنامية.
ايزولاأعربت الخلايا البطانية تيد البطانية CD31 علامة الخلية كما يتضح من QPCR (الشكل 4). وتمت مقارنة التعبير في الخلايا البطانية المستمدة من الشريان الأبهر، الوريد الأجوف، وبورتا الوريد من أربعة كلاب مع ثقافة السيطرة على CnAOECs. كانت الخلايا الأولية مثقف تعبير CD31 قابلة للمقارنة مع السيطرة ECS (Kruskall-اليس، ع = 0.856).
CaPECs المستمدة من الشريان الأورطي، والوريد الأجوف بورتا الوريد أظهرت المتفرعة بعد الحضانة 6 ساعات على الشريحة الأوعية الدموية كما هو مبين في الشكل (5).
الشكل 1: تشريح وتحويل التيار الأوعية الدموية لعزل الخلايا البطانية. أ) يتم إزالة الأوعية الدموية في المصالح جو معقم و مطهر من جيفة الكلاب طازجة. ب) الأنسجة منتسب و / أو الدهون المحيطة السفينة يجب أن يكون ازالتهاإد بعناية مع مقص جراحي دون الإضرار السفينة نفسها (الكلاب الوريد الأجوف، شريحة البطن من 5 سم). C) مع منحني ملقط هالستيد البعوض، السفينة يمكن إدخالها دون ثقب طبقة البطانية. DG) تأمين ملقط من جهة أخرى ينتهي في الأوعية الدموية وسحب بلطف، وبالتالي عكس تماما الأوعية الدموية. الطبقة البطانية الآن على السطح الخارجي للسفينة. H) توضع خيوط محفظة سلسلة في نهايات اغلاق سطح غير البطانية من السفينة المقلوبة الأول) يتم نقل الأوعية الدموية إلى أنبوب 50 مل لغسل و الهضم لاحق. الحانات على نطاق وتشير 2 سم. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3):.. خلية الصرف أخذت صور بعد أسبوعين الهضم الأوعية الاب أ) ECS المشتقةتؤخذ الشريان الأورطي OM الكلاب في مرور 2. ب) ECS المستمدة من الوريد الأجوف الكلاب في مرور 2. C) ECS المستمدة من بورتا الوريد الكلاب في مرور 2. جميع الصور مع 4X التكبير الأصلي. وتشير الحانات مقياس 500 ميكرون. إدراج يظهر 10X التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التعبير الجيني من CD31. التعبير عن CD31 في الخلايا البطانية في ممر 1 المستمدة من الشريان الأبهر، الوريد الأجوف، وبورتا الوريد (ن = 4 الكلاب). لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية بين التعبير CaPECs وCnAOECs. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: الأوعية الدموية صور من CnAOECs وCaPECs من الشريان الأورطي، والوريد الأجوف بورتا الوريد بعد الحضانة 6 ساعات على شريحة الأوعية الدموية (20X التكبير). تشكيل فرع مرئيا بعد 6 ساعات في الثقافة. أ) CnAOECs. CaPECs ب) المستمدة من الشريان الأورطي. C) CaPECs المستمدة من الوريد الأجوف. D) CaPECs المستمدة من بورتا الوريد. وكانت جميع الخلايا في مرور 3. أشرطة النطاق تشير 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الحكومة الإسرائيلية | اتجاه | 5'-تسلسل 3 " | تيم الصلب | حجم المنتج (بي بي) | عدد البنوك الوراثية | |
| CD31 | إلى الأمام | GTTCTGCGTGTCAAGGTG | 59 ° C | 85 | XM_005624261.1 | |
| عكسي | TGTCCTTCCCAAACTCCA | |||||
| بيتا الأكتين | إلى الأمام | GATATCGCTGCGCTTGTGGTC | 58 ° C | 384 | NM_001195845 | |
| عكسي | GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC | |||||
| RPS19 | إلى الأمام | CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG | 63 ° C | 95 | XM_005616513 | |
| عكسي | GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG | |||||
| B2MG | إلى الأمام | TCCTCATCCTCCTCGCT | 63 ° C | 85 | AB745507 | |
| عكسي | TTCTCTGCTGGGTGTCG | |||||
الجدول 1: QPCR التمهيدي مجموعات التمهيدي QPCR لجينات مرجعية الكلاب وCD31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الدراسات التي تركز على الكلاب ECS يستخدم الخط الأساسي CnAOEC لنموذج الأنساب البطانية الكلب 3 و 12 و 13. في الدراسات الإنسانية، ثقافة HUVEC لا يزال يعتبر معيار الذهب. ومن الواضح أن مجرد التركيز على ECS المستمدة من الحبل السري هو تقييد راسخ في الأبحاث القلب والأوعية الدموية. الخلايا البطانية لديها نمط التعبير الجيني محددة تحديد مواصفات الشرايين والأوردة. وذلك لحساب هذه الاختلافات في الأوعية بعد الولادة فإننا نتقدم بهذه الطريقة العزلة رواية استنادا إلى موقع تشريحي معين من الخلايا البطانية. الأساليب المستخدمة عادة لعزل EC الابتدائية وفلاشينغ السفينة مع محلول أنزيم أو تنميق السفينة قبل الهضم، طريقتين لديهما مخاطر التلوث غير ECS. أنشأنا تقنية لعزل خلايا الناب الابتدائية غشائي (CaPECs) مع وجود فرصة أقل من التلوث التي يمكن أن تستخدم أيضا على السفن الصغيرة. هذه العزلة مويستند ethod من الخلايا البطانية على انقلاب السفينة، والذي يتجنب هضم جميع أنواع الخلايا سفينة أخرى. ومن المهم لإزالة الأوعية جو معقم و مطهر، كما هو موضح في الشكل 1A، لمنع التلوث البكتيري أو الفطري للثقافات البطانية. في حالة نمو البكتيريا وكيل المضادة للجراثيم إضافية (على سبيل المثال، الجنتاميسين) يمكن أن تضاف إلى ثقافة المتوسط. في حالة معالجة العدوى الفطرية غالبا ما تكون غير ناجحة في تجربتنا.
من أجل انعكاس للنجاح، من المهم جدا للحصول على السفينة التي هي حوالي 5 سم في الطول. والخطوة الثانية المهمة لتسهيل انعكاس للاوعية الدموية هو إزالة أي نوع من الأنسجة الملتصقة والدهون مع مقص جراحي. قلب السفينة ويتم بعناية من قبل لقط ملقط في الطرف المقابل وعكس ببطء السفينة. عند وضع سلسلة محفظة الغرز تأكد من لمسة الطبقة البطانية أقل قدر ممكن. داماجنرال الكتريك البطانة يمكن أن يؤدي إلى العائد الفقراء من الخلايا البطانية قابلة للحياة وصول وسائل الإعلام الهضم إلى الأنسجة الكامنة. يمكن أن يحدث هذا أيضا إذا لم يتم إغلاق السفينة تماما. السفينة يمكن بسهولة التعامل معها عن طريق التقاط ما يصل في نهاية ضمد.
في حالات محددة تعديل هذه التقنية يمكن تطبيقها. في الأوعية الدموية التي يبلغ قطرها صغير بل هو أحيانا من المستحيل لإدراج ملقط البعوض من أجل عكس السفينة. والحل هو وضع الغرز البقاء على نهاية واحدة من السفينة، ودفع الحروف المركبة من خلال الأوعية الدموية باستخدام ملقط. في الطرف الآخر ويمكن بعد ذلك أن المضمون مع ملقط البعوض وسحبت، وبالتالي قلب السفينة. في بعض الأحيان سوف السفينة المسيل للدموع نتيجة الغرز اضافية، وحتى هذا التعديل ليس هو النهج المفضل. مشكلة أخرى التي يمكن أن تنشأ هي عندما تكون موجودة في لوحات ثقافة على البذر من الخلايا الأولية العديد من كريات الدم الحمراء. وهذا يمكن أن يكون نتيجة لغسل كافية من الأوعية الدموية قبل الهضم. عندما يحدث هذا، وغسل الآبار في يوم 2 مع HBSS الدافئ غالبا ما يكون كافيا لإزالة الغالبية العظمى من كريات الدم الحمراء. في أي حال، فإن كريات الدم الحمراء لا تزال قائمة في الثقافة وتضيع على الركض من CaPECs.
وأعرب CaPECs معزولة CD31، مشيرا إلى أن عدد السكان من الخلايا التي تم هضمها من الأوعية الدموية هو في الواقع من أصل البطانية. كما نشرت مؤخرا، وأعرب عن هذه العلامة أيضا في الخلايا البطانية من الصمام التاجي الكلاب 14. تشكيل مستعمرات في الثقافة يدل على الثقافات تبدأ إما من الخلايا واحد أو من مجموعات الخلايا الصغيرة. النمو السريع على البطانية وسائل الإعلام معين هو أيضا يدل على نوع من الخلايا الصحيح. الخلايا الأولية يمكن تربيتها لمدة ثماني فقرات، وبعد ذلك تتوقف على الثقافات التوسع. هذا يعد مؤشرا على الشيخوخة ويجعلها أقل احتمالا أن الخلايا الجذعية / السلف يتم تربيتها مع هذا بروتوالعقيد. في فحص الأوعية الدموية، وأظهرت CaPECs من الشريان الأورطي، والوريد الأجوف بورتا الوريد المتفرعة في غضون 6 ساعة. توفر هذه الوظيفة البطانية أدلة دامغة عن مصدرها.
وبناء على توافر تمت دراسة المواد الكلاب فقط، ولكن الأسلوب العزلة ديه التطبيقات الممكنة لعزل الخلايا البطانية الإنسان الأساسية أو الخلايا البطانية من الكائنات الحية الأخرى. هذه التقنية هي أيضا ممكنة للسفن الصغيرة جدا (1 سم طول)، ولكن سوف تسفر خلايا أقل عزلة. لهذا السبب CaPECs تم الحصول عليها من السفن الصغيرة سوف يتطلب مرور إضافية قبل أن تصل إلى عدد كاف لإجراء التجارب.
القدرة على أداء وأسلوب العزل على متن سفن صغيرة هي ميزة كبيرة للدراسة في أمراض الأوعية الدموية. ECS يمكن عزلها من السفن المريضة أو الشاذة مثل يحول بوابية مجموعية. هذه هي السفن ربط الوريد البابي وجهاز الدورة الدموية الذي يسبب الدم لتجاوز الكبد 2 15 و 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
