Introduction
Собаки используются в качестве большой животной модели для исследования сердечно - сосудистых заболеваний , а также может страдать от врожденных (генетических) сосудистых аномалий 1, 2. Для изучения этих болезней коммерческие клеточные линии эндотелиальные часто используются для оценки эндотелиальных клеток (EC) функциональные возможности . Для собак есть одна коммерческая линия эндотелиальные клетки доступны (CnAOEC), полученный из собачьей аорты. Эта клеточная линия в основном используется в исследованиях в качестве контроля нормального Écs 3-5. В исследовании сердечно-сосудистой системы человека наиболее часто используемые клеточные линии эндотелиальные являются пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs) и человеческого пупочной артерии эндотелиальных клеток (HUAECs), полученные из пупочной вены человека мозга и артерии, соответственно. HUVECs были использованы в качестве золотого стандарта в сосудистых исследований с 1980 года 6. Они считаются классическая модель системы для изучения эндотелиальной функции и адаптации к болезни. Эндотелиальные клетки, выделенные из различных кровеносных сосудов варьируются в appearancе и функциональные возможности из - за генетического фона и воздействия микросреды 7. Кроме того, HUVECs и HUAECs получают из пуповины, а с развитием сосудистой структуры, которая, возможно, не в полной мере имитируют взрослых кровеносные сосуды, в отношении условий, которым они подвергаются, и реакция на болезнь. Следовательно, перевод результатов поиска в HUVECs и HUAECs сердечно-сосудистых заболеваний в целом является недостаточным.
При изучении адаптации и поведение взрослых КЭ, первичные КЭ из емкости интереса следует использовать в качестве более прямой подход. Для того, чтобы изолировать эти клетки, были зарегистрированы несколько методов. Широко описан метод, который также используется для HUVECs, является промывка сосуда с раствором ферментативного расщепления 8. Это часто приводит к загрязнению с не КЭ , таких как клетки гладких мышц и фибробластов 9. Другим часто используемым способом выделения является ферментативное переваривание измельченной ткани сосуда с последующим флуоресцентные-Активированный сортировки клеток (FACS) на основе эндотелиального клеточного маркера кластер дифференцировки (CD) 31 7, 8. FACS сортировочного и последующей клеточной культуры , требует относительно больших количеств клеток , и поэтому не подходит для выделения эндотелием из мелких кровеносных сосудов. Поэтому мы нацелены на разработку нового надежного способа выделения чистого эндотелиальной популяции клеток из различных собачьих кровеносных сосудов с высокой степенью чистоты. Для того, чтобы проверить эффективность нового метода изоляции, мы выделили и получили чистые Собачий Первичные эндотелиальные клетки (ЦАТЭК) культуры из различных собачьих артерий и вен, как больших, так и малых. Этот метод также позволяет культуре эндотелиальных клеток , происходящих из больных и / или аберрантных сосудов , таких как врожденными интра- или экстра-печеночной портосистемных шунтов, распространенное заболевание у собак 2. Метод позволяет выделение дополнительных соответствующих типов клеток одного и того же сосуда, таких как гладкомышечные клетки сосудов, так как большая часть сосуда остается ИНТдействовать во время процедуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика заявление: Кровеносные сосуды, используемые в данном исследовании, собирают способом, получают из свежих собачьих кадавров излишков материала (N = 4) от здоровых собак эвтаназии для неродственных исследований (политики университета 3R). Аберрантных кровеносных сосудов (внутри- и внепеченочных портосистемные шунты, п = 1 каждая) собирали посмертного после информированного согласия владельцев от собак, представленных в университетской клинике для домашних животных из Утрехтского университета.
1. Выделение и культуры первичных Собачий эндотелиальных клеток
- Предварительное покрытие 6-луночные планшеты с 2 мл / лунку 0,5% вес / об желатин и оставить в течение 2 ч в инкубаторе с увлажненной атмосфере 5% СО 2 при 37 ° С. Удалите избыток раствора желатина перед посевом первичные клетки.
- Консерванта удалить кровеносный сосуд (ы) интерес (например, аорта, полая вена, полая Порте) из свежего собачьего трупа (рис 1А). Поддержание анатомии сосудистой системыпутем размещения прямых щипцов на обоих концах судна, представляющего интерес. Избегайте ненужных манипуляций ткани с щипцами, чтобы предотвратить повреждение эндотелиальных клеток.
- Обрежьте зажат сосуд на обоих концах с хирургическими ножницами и удалить из трупа. Транспорт в Хенка сбалансированный солевой раствор (HBSS) на льду.
Примечание: Длина судна примерно 5 см является предпочтительным для этой процедуры, но те, которые измеряют 1 см будет также обеспечить достаточное количество клеток для культуры.
- Обрежьте зажат сосуд на обоих концах с хирургическими ножницами и удалить из трупа. Транспорт в Хенка сбалансированный солевой раствор (HBSS) на льду.
- Перенести кровеносный сосуд в чашке Петри заполнены охлаждаемым льдом HBSS. Используя хирургические ножницы, удалите прилипший ткань и жир с внешней стороны сосуда, сохраняя само судно нетронутыми (рис 1b). Убедитесь, что судно хорошо видна во все времена при резке: тянуть в сторону окружающих тканей с помощью зажима или щипцов для оптимального зрения.
- Закройте все ветви сосуда с лигатур (например, полиглактином 3-0) , а затем удалить ихс хирургическими ножницами или скальпелем.
- Осторожно ввести конец сосуда с изогнутыми Хальстед противомоскитных щипцов, зажим кончик пинцетом на другом конце сосуда , а затем убирается, медленно переворачивая сосуд , пока он не будет полностью наизнанку (рис 1С-G). Внешняя сторона теперь состоит из слоя эндотелиальных клеток. Если какие-либо трудности встречается при переворачивания судна, погрузить в HBSS снова, чтобы уменьшить трение.
- Поместите кошелек-струнные швами на обоих концах судна , чтобы закрыть его полностью и для предотвращения воздействия любого не-эндотелиальной сосудистой ткани к процедуре пищеварения (рис 1H). Используйте лигатуры концы, чтобы манипулировать перевернутый сосуд.
- Если пищеварение и культура выполняется позже, криоконсервируют перевернутый сосуд перед тем протоколом переваривания (этап 1.7).
- Поместите перевернутый сосуд в криопробирку и залить клеточной культуры замораживания среды. Замораживание до -80 ° С с использованием замораживания COntainer. Хранить при температуре -80 ° C, если сосуды должны быть использованы в течение одной недели. Для длительного хранения, место криопробирок при -180 ° C. При выполнении изоляции EC, растаяйте криопробирки быстро на водяной бане (37 ° C) и сразу же место в охлажденном на льду HBSS. Продолжайте, как указано в пункте 1.7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Примите во внимание, что общий выход КЭ после выделения будет ниже из-за потери жизнеспособности в процессе замораживания.
- Поместите перевернутый сосуд в криопробирку и залить клеточной культуры замораживания среды. Замораживание до -80 ° С с использованием замораживания COntainer. Хранить при температуре -80 ° C, если сосуды должны быть использованы в течение одной недели. Для длительного хранения, место криопробирок при -180 ° C. При выполнении изоляции EC, растаяйте криопробирки быстро на водяной бане (37 ° C) и сразу же место в охлажденном на льду HBSS. Продолжайте, как указано в пункте 1.7.
- Передача судна в 50 мл пробирку и промойте его дважды в HBSS для удаления эритроцитов (или остаточной среды замораживания в случае размораживания) (рис 1I).
- Дайджест судна в 50 мл пробирку с раствором 30 мл коллагеназы типа II (0,15 ед / мл) и диспаза (0,15 ед / мл) в собачьих эндотелиальных клеток Рост среднего (CECGM) в течение 1 ч при температуре 37 ° С с прерывистым пологий агитация.
- Извлеките сосуд из трубки и центрифугирование клеточной суспензии в течение 5 мин при 250 х г.
- Ресуспендируют осадок клеток в CECGM ай семян 2 мл клеточной суспензии на лунку (1 - 3 скважины в зависимости от размера судна). Культуры клеток при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 в воздухе и изменение культуральной среды дважды в неделю.
- Прохождение клетки, когда конфлуэнтности 70 - 80% достигается.
- Вымойте клетки с подогретого HBSS для удаления мертвых или не присоединенные клетки. Добавить 200 мкл рекомбинантной клеточной диссоциации фермента (1x) в каждую лунку и поместить обратно в инкубаторе в течение 5 минут или пока все клетки отсоединяются.
- Передача клеток в 15 мл трубки и прекратить трипсинизации путем добавления 10 мл культуральной среды (CEGM), включая 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Центрифуга в течение 5 мин при 250 х г. Продолжить культуру в тарелку или колба желатина, предварительно покрытые.
2. Характеристика
- Культура Собачий аортального эндотелиальные клетки (CnAOECs) и сравнить морфологии первичных и коммерческих клеточных линий, два раза в неделю с помощью микроскопа.
Примечание: Tон типичный растущий образец КЭ в виде пятен может быть лучше всего наблюдается при конфлуэнтности> 70% достигается.- Культура CnAOECs в CECGM на 0,5% вес / об желатин, предварительно покрытых T75 колбу. Прохождение клетки один раз в неделю, когда конфлуэнтности составляет 70 - 80%.
- Для пассирования, промыть клетки один раз с подогретого HBSS и добавляют 1 мл рекомбинантного клеточной диссоциации фермента (1x). Поместите колбу обратно в инкубаторе в течение 5 минут или пока все клетки отсоединяются. Деактивировать трипсина путем добавления культуральной среды 10 мл (CEGM), включая 10% FCS. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 250 мкг, отбросить супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл культуральной среды.
- В 10 мкл аликвоты клеточной суспензии и разбавить 1: 1 с 0,4% трипановым синим. Граф клеток с использованием автоматизированного счетчика клеток, и осаждаются 4.0 х 10 5 жизнеспособных клеток в новой T75 колбу. Добавьте 10 мл предварительно подогретой CECGM в колбу и культуры при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2.
- Культура CnAOECs в CECGM на 0,5% вес / об желатин, предварительно покрытых T75 колбу. Прохождение клетки один раз в неделю, когда конфлуэнтности составляет 70 - 80%.
- Изолировать РНК из прохода 1 из культивируемых CaPECs и CnAOECs.
- Соберите по крайней мере , 1 × 10 3 клеток в виде гранул, добавляют 20 мкл реагента для подготовки проб (ППР) и инкубировать в течение 1 мин для лизиса клеток. После инкубации, необходимо тщательно собрать клеточный лизат, содержащий тотальную РНК, и хранят при -70 ° С.
- Преобразование мРНК в кДНК с использованием набора для синтеза кДНК (например, iScript) , следуя инструкциям изготовителя. кДНК Хранить при температуре 4 ° C до одной недели или при -20 ° С в течение длительного времени, пока не готова к выполнению КПЦР.
- Мера экспрессии гена эндотелиальной маркера CD31, чтобы подтвердить эндотелиальных клеток происхождение. Выполнение экспериментальной установки и количественной оценки с использованием руководящих принципов ПРЕСИС MIQE 10. Для нормализации, измерения экспрессии генов эталонных GAPDH, RPS19 и B2MG 11.
- Готовят 10-кратное разведение полученной кДНК в нуклеазная свободной воды.
- Подготовить4-кратное разбавление из проб кДНК, объединенных по стандартной линии и использовать нуклеазы свободной воды в качестве контроля нешаблонном. Развести образцов пять раз, чтобы достичь 50-кратного общего разбавления для реакции КПЦР. Пипетка 10 мкл реакции в двух экземплярах в формате 384-луночного с использованием 4 мкл кДНК и 6 мкл флуорофора , смешанного с 20 пмоль обратного и прямого праймера (таблица 1).
- Установите программу до 95 ° С в течение 5 мин для активации полимеразы Taq, а затем 39 циклов 10 сек при 95 ° С в течение денатурации и 30 с при Tm для отжига и удлинения. Тт для каждого праймера набора приведен в таблице 1.
- Perform кривой плавления анализа после каждого бежать, чтобы обеспечить только один продукт усиливается. Осуществить нормировку уровни экспрессии образцов, используя среднее относительное количество эталонных генов, и вычислить & Delta; CТ если эффективность реакции составляет от 95% до 105%.
- Оценка функциональных возможностей ИС с Angiogenesis анализ.
- Добавьте 10 мкл внеклеточного матрикса в каждую лунку предварительно охлажденный ангиогенеза горкой и намазать наконечником пипетки, чтобы покрыть поверхность скважины. Держите внеклеточный матрикс на льду и избежать введения пузырьков воздуха в гель. Затвердеть гель, помещая стекло в чашку Петри с водой замачивают бумажных полотенец в термостате при температуре 37 ° С с 5% CO 2 в течение 30 мин.
- Добавить 1,0 × 10 4 первичных КЭ в 50 мкл эндотелиального роста среднего на лунку. Инкубировать слайд в течение 6 ч при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
- Через 6 ч фотографировать с увеличением 20X, убедившись в том, чтобы включить все хорошо в изображении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Различные кровеносные сосуды были успешно подвергнуты описанному протоколу изоляции (рисунок 2). Можно было препарировать и инвертировать аорта, полая вена, полую и Порта, коронарной артерии от здоровых собак (все сосуды от каждой собаки, п = 4). С того же подхода КЭ были выделены из двух врожденных портосистемные шунты (внепеченочных и внутрипеченочных, п = 1 каждый). Хотя аорту легко инвертировать, грудные сегменты аорты более сложной, чем брюшной аорты. В грудных сегментах аорта имеет много межреберные артерии разветвлений от него, которые должны быть лигированы по отдельности, чтобы обеспечить строго эндотелиальную воздействия раствора пищеварения. Рассеченные сегмент хвостового полая вена включал точку ветвления почечных вен, которые необходимо лигируют перед тем инверсии. Для портала вены способствующего ветви полую gastroduodenalis сшили перед тем инверсией кровеносного сосуда. coronarу артерии у собак гораздо меньше кровеносного сосуда (приблизительно 1 - 2 мм в диаметре в собака среднего размера), из которых мы иссекают сегмент огибающую ветви. Поскольку она имеет небольшой диаметр, это оказалось легче инвертировать довольно короткий отрезок 1 см, так как пинцет москитные не мог быть вставлен намного дальше.
Один день после изоляции прилипшие клетки были видны в культуральной пластине. В культуре, CaPECs имели многоугольную форму и проявляли тенденцию к росту в виде пятен , как показано на рисунке 3 , многочисленные колонии эндотелиальных клеток можно было наблюдать 3 -. 6 дней после изоляции. Примерно через 10 дней в культуре была достигнута конфлуэнтности 80% и клетки могут быть превзойден. В среднем первичные эндотелиальные культуры можно поддерживать в течение не более 8 проходов (один раз в неделю в дозе разделенным скоростью 1: 4), и в этот момент они перестал расти.
IsolaTed эндотелиальные клетки экспрессируют эндотелиальный клеточный маркер CD31 , как показано кПЦР (рисунок 4). Выражение в эндотелиальных клетках, полученных из аорты, полой вене, и полую из четырех-портала собак по сравнению с контрольной культурой CnAOECs. Культивируемые первичные клетки имели сравнимую экспрессию CD31 с контролем КЭ (Крускала-Уоллиса, р = 0,856).
CaPECs , полученные из аорты, полая вена и полую разветвленности показали - портала после 6 часов инкубации на ангиогенеза слайде , как показано на рисунке 5.
Рисунок 1: Анатомический и переворачивая Кровеносные для эндотелиальной выделения клеток. A) интерес кровеносный сосуд асептически удален из свежей собачьей трупе. B) Адгезивная ткани и / или жир , окружающий судно должно быть УДАЛред тщательно с хирургическими ножницами без повреждения самого (собачий полая, брюшной сегмент 5 см). C сосуд) с изогнутым пинцетом Хальстед комаров, судно может быть введено без перфорации эндотелиальной слоя. DG) Закрепите щипцов с другой стороны конца кровеносного сосуда и осторожно убирается, тем самым полностью переворачивая кровеносный сосуд. Эндотелиальный слой теперь находится на внешней стороне сосуда. H) Кошелек-струнные Швы расположены на концах перекрывая не-эндотелиальной поверхности перевернутого судна. I) кровеносный сосуд переносят в 50 мл пробирку для промывки и последующее пищеварение. Масштабные полоски указывают на 2 см. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3:.. Морфология клеток Фотографии были взяты через две недели после того, как переваривание сосудов A) КЭ полученные фром собачьей аорту в канал 2. В) КЭ получен из собачьего полая вена в канал 2. C) КЭ , полученные из собачьей полую в проходе - портала 2. Все фотографии взяты с 4 - кратным увеличением первоначального. Масштабные полоски указывают на 500 мкм. Вставка показывает 10 - кратное увеличение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Генная экспрессия CD31. Экспрессия CD31 в эндотелиальных клетках, в проходе 1, полученных из аорты, полой вене, и полую (п-портала = 4 собаки). Не было обнаружено существенных различий экспрессии между CaPECs и CnAOECs. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: ангиогенез. Фотографии CnAOECs и CaPECs от аорты, полая вена и полую после 6 - портала ч инкубации на ангиогенеззависимое слайде (20х увеличение). Образование Отделение видна после 6 часов в культуре. А) CnAOECs. B) CaPECs , полученных из аорты. C) CaPECs , полученные из полая. D) CaPECs полученный из полую Порте. Все клетки были в проходе 3. Масштабные полоски указывают на 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| ГОИ | направление | 5'-последовательность-3 ' | Tm отжига | Размер продукта (пар оснований ) | номер Genebank | |
| CD31 | Вперед | GTTCTGCGTGTCAAGGTG | 59 ° C | 85 | XM_005624261.1 | |
| Задний ход | TGTCCTTCCCAAACTCCA | |||||
| бета-актина | Вперед | GATATCGCTGCGCTTGTGGTC | 58 ° C | 384 | NM_001195845 | |
| Задний ход | GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC | |||||
| RPS19 | Вперед | CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG | 63 ° C | 95 | XM_005616513 | |
| Задний ход | GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG | |||||
| B2MG | Вперед | TCCTCATCCTCCTCGCT | 63 ° C | 85 | AB745507 | |
| Задний ход | TTCTCTGCTGGGTGTCG | |||||
Таблица 1: КПЦР наборов праймеров КПЦР праймеров для собачьих эталонных генов и CD31..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В исследованиях , посвященных собачьего КЭ основной линии CnAOEC используется для моделирования эндотелиальные родословных собаки 3, 12, 13. В исследованиях на людях, культуре HUVEC по - прежнему считается золотым стандартом. Очевидно, ориентируясь только на КЧС, полученных из пуповины является фирма ограничение в сердечно-сосудистых исследований. Эндотелиальные клетки имеют специфический характер экспрессии генов, определяющий артериовенозной спецификации. Для того, чтобы учесть эти различия в послеродовых сосудах мы представляем этот новый способ изоляции на основе специфического метода анатомического расположения эндотелиальных клеток. Методы, обычно используемые для первичной изоляции ЕС промывка сосуда с раствором фермента или мясорубки сосуда до переваривания, два метода, которые оба имеют риск загрязнения с не-КЭ. Мы установили методику выделения собачьего первичного эндотелиальных клеток (CaPECs) с меньшей вероятностью загрязнения, которые также могут быть использованы на небольших судах. Эта изоляция меню эндотелиальных клеток основана на инверсии сосуда, что исключает перевариванию всех других типов клеток сосуда. Важно , чтобы удалить сосуды в асептических условиях , как это показано на рисунке 1А, для предотвращения бактериальной или грибковой контаминации эндотелиальных культур. В случае бактериального роста дополнительный антимикробный агент (например, гентамицин) могут быть добавлены в культуральную среду. В случае грибкового лечения инфекции часто не увенчались успехом в нашем опыте.
Для того, чтобы инверсии, чтобы добиться успеха, важно, чтобы получить судно, которое составляет около 5 см в длину. Второй важный шаг, чтобы облегчить инверсию кровеносного сосуда является удаление любого прилегающего ткани и жира с хирургическими ножницами. Обращая сосуд делается тщательно зажимая пинцетом на противоположном конце и медленно переворачивая сосуд. При размещении кошелек-строку Швы убедитесь, чтобы коснуться эндотелиальной слоя как можно меньше. DamaGE эндотелия может привести к снижению выхода жизнеспособных эндотелиальных клеток и доступ пищеварительным СМИ к основной ткани. Это также может произойти, если судно не полностью закрыта. Судно может быть легко обрабатывается поднять его в конце лигатуры.
В конкретных случаях модификация методики могут быть применены. В кровеносных сосудах с небольшим диаметром иногда невозможно вставить комар щипцов для того, чтобы инвертировать судно. Решение состоит в том, чтобы поместить пребывание швами на одном конце судна и толкать их лигатуры через кровеносный сосуд с помощью пинцета. На другом конце они могут быть закреплены с пинцетом москита и тянули, тем самым переворачивая сосуд. Иногда судно будет разорвать, как следствие дополнительных шовных материалов, так что эта модификация не является предпочтительным подходом. Другая проблема, которая может возникнуть, когда многие эритроцитах присутствуют в культуральных планшетах при внесении затравки первичных клеток. Это может быть результатомНедостаточная промывка кровеносного сосуда до начала пищеварения. Когда это происходит, промывки лунок на 2-й день с теплой HBSS часто бывает достаточно, чтобы удалить большую часть эритроцитов. В любом случае, эритроциты не сохраняются в культуре и теряются на пассажей из CaPECs.
Выделенные CaPECs выразили CD31, указывая, что популяция клеток, которые переваривают из кровеносного сосуда действительно эндотелиального происхождения. Как недавно опубликован, этот маркер также выражается в эндотелиальных клетках из собачьего митрального клапана 14. Образование колоний в культуре указывает на то, что культуры начинают либо из отдельных клеток или из небольших клеточных кластеров. Быстрый рост на эндотелиальную конкретного средства массовой информации также свидетельствует о правильном типе клеток. Первичные клетки можно культивировать в течение восьми проходов, после чего культуры прекращают расширение. Это свидетельствует о старении и делает его менее вероятно, что стволовые клетки / клеток-предшественников, культивируют с этим протоцвет В анализе ангиогенеза, CaPECs от аорты, полая вена и полую показали разветвленности-портала в течение 6 часов. Это эндотелиальной функции дает весомые доказательства своего происхождения.
В зависимости от доступности был изучен только собачий материал, но способ изоляции может найти применение для выделения первичных человеческих эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток из других организмов. Способ также возможно для очень маленьких сосудов (длина 1 см), но будет давать менее изолированных клеток. По этой причине CaPECs, полученные из небольших судов потребуется дополнительный проход, прежде чем они достигли достаточного количества для экспериментов.
Способность выполнять метод изоляции на небольших судах, является большим преимуществом для исследований в области сосудистых заболеваний. КЭ могут быть изолированы от больных или аберрантных сосудов, таких как портосистемных шунтов. Эти сосуды , соединяющие портальную вену и в системный кровоток , который вызывает крови обходить печень 2 15, 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
