Introduction
Cães são usados como modelo animal grande para a pesquisa da doença cardiovascular e também podem sofrer de anormalidades vasculares (genéticas) inatos 1, 2. Para estudar estas doenças linhas de células endoteliais comerciais são muitas vezes utilizados para avaliar a funcionalidade das células endoteliais (CE). Para os cães que há uma linha de células endoteliais comercial disponível (CnAOEC), derivadas da aorta canino. Esta linha celular é usado principalmente em estudos como controlo normal ECs 3-5. Na pesquisa cardiovascular humano as linhas de células endoteliais mais utilizados são células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e umbilical humano, Artéria células endoteliais (HUAECs) derivados da veia do cordão umbilical humano e artéria, respectivamente. HUVECs foram usados como o padrão de ouro na pesquisa vascular desde a década de 1980 6. Eles são considerados como sendo o sistema de modelo clássico para estudar a função endotelial e doença de adaptação. As células endoteliais isoladas a partir de diferentes vasos sanguíneos variam em appearance e funcionalidade devido às características genéticas e exposição ao microambiente 7. Além disso, células HUVEC e HUAECs são derivados a partir do cordão umbilical, uma estrutura vascular do desenvolvimento que não pode vasos sanguíneos adulto totalmente mímica com respeito às condições a que estão expostos e resposta à doença. Assim, traduzindo resultados encontrados em HUVECs e HUAECs a doenças cardiovasculares, em geral, é inadequada.
Ao estudar a adaptação e comportamento do adulto ECs, ECs primários do vaso de interesse deve ser usado como uma abordagem mais direta. Para isolar estas células, vários métodos têm sido relatados. Um método amplamente descrito, que também é usada para HUVEC, é a lavagem do recipiente com uma solução de digestão enzimática 8. Isto muitas vezes resulta na contaminação com não-CEs, tais como células de músculo liso e de fibroblastos 9. Outro método frequentemente utilizado para o isolamento é a digestão enzimática do tecido navio picada seguido por fluorescence-de células activadas (FACS) com base no marcador de células endoteliais de Cluster de diferenciação (CD) 31 7, 8. separação por FACS e cultura de células subsequente requer quantidades relativamente grandes de células e, portanto, não é apropriado para o isolamento do endotélio de pequenos vasos sanguíneos. Por conseguinte, objectivo desenvolver um novo método robusto para isolamento de uma população pura de células endoteliais a partir de vários vasos sanguíneos caninos com elevado grau de pureza. Para testar a eficiência do novo método de isolamento, foram isoladas e obteve culturas puras Canine primária de células endoteliais (Capec) de diferentes artérias caninas e veias, grandes e pequenas. Este método também permite a cultura de células endoteliais provenientes do doente e / ou vasos aberrantes, tais como desvios portossistêmicos intra ou extra-hepáticas inatos, uma doença comum em cães 2. O método permite o isolamento de tipos de células relevantes adicionais do mesmo recipiente, tais como as células do músculo liso vascular, uma vez mais da embarcação permanece intagir durante o procedimento.
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Protocol
Ética declaração: Os vasos sanguíneos utilizados neste estudo foram colhidas como material excedente obtido a partir de cadáveres caninos frescos (n = 4) a partir de cães saudáveis sacrificados para outras pesquisas independentes (a política Universidade 3R). vasos sanguíneos anormais (desvios portossistêmicos intra e extra-hepáticos, n = 1 cada) foram colhidas post-mortem após consentimento informado dos proprietários de cães apresentados com a Clínica Universitária de Animais de Companhia da Universidade de Utrecht.
1. Isolamento e Cultura de pilhas Canine endoteliais
- Pré-revestir placas de 6 cavidades com 2 ml / poço de 0,5% w / v de gelatina e deixar durante 2 horas num incubador com uma atmosfera humidif içada de 5% de CO2 a 37 ° C. Remova o excesso de solução de gelatina antes de semear as células primárias.
- Assepticamente remover do vaso sanguíneo (s) de interesse (por exemplo, da aorta, da veia cava, da veia porta) a partir de um cadáver fresco canino (Figura 1A). Manter a anatomia do sistema de vasoscolocando fórceps rectas em ambas as extremidades do vaso de interesse. Evitar a manipulação desnecessária do tecido com uma pinça para evitar danos nas células endoteliais.
- Cortar o navio fixada em ambas as extremidades com tesouras cirúrgicas e remover a partir do cadáver. Transporte em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) em gelo.
NOTA: Um comprimento do vaso de cerca de 5 cm é preferida para este procedimento, mas aqueles que medem 1 cm também proporcionará número suficiente de células para a cultura.
- Cortar o navio fixada em ambas as extremidades com tesouras cirúrgicas e remover a partir do cadáver. Transporte em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) em gelo.
- Transferir o vaso sanguíneo para uma placa de Petri cheio com HBSS arrefecida em gelo. Utilizando uma tesoura cirúrgica, remover todo o tecido aderente e gordura a partir do exterior do recipiente, mantendo o vaso em si intacta (Figura 1B). Certifique-se o navio está claramente visível em todos os momentos durante o corte: puxe de lado o tecido circundante com uma pinça ou fórceps para visualização ideal.
- Feche todos os ramos do navio com ligaduras (por exemplo, poliglactina 3-0) e, posteriormente, removê-loscom tesoura cirúrgica ou bisturi.
- Cuidadosamente inserir uma extremidade navio com um fórceps curvo mosquito Halsted, prender a ponta do fórceps, na outra extremidade do recipiente e, em seguida, retrai, lentamente, invertendo o recipiente, até que esteja completamente dentro para fora (Figura 1C-G). O exterior consiste agora a camada de células endoteliais. Se alguma dificuldade é encontrada em cima invertendo a embarcação, submergir em HBSS novamente para reduzir o atrito.
- Coloque suturas em bolsa de nas duas extremidades do recipiente para o fechar completamente e para evitar a exposição de qualquer tecido vascular endotelial não para o procedimento de digestão (Figura 1H). Use as pontas da ligadura para manipular o recipiente invertido.
- Se a digestão e a cultura é realizada mais tarde, o navio de criopreservar invertida antes da digestão protocolo (passo 1.7).
- Colocar o recipiente invertido num criotubo e encher com meio de cultura de células de congelação. Congelamento até -80 ° C utilizando um co congelaçãontainer. Armazenar a -80 ° C, se os recipientes forem para ser usado no prazo de uma semana. Para armazenamento a longo prazo, cryovials lugar a -180 ° C. Ao realizar o isolamento CE, descongelar as criotubos rapidamente num banho de água (37 ° C) e colocar imediatamente em HBSS arrefecido com gelo. Prosseguir como indicado em 1.7.
NOTA: Ter em conta que o rendimento total de ECs após o isolamento será menor devido à perda de viabilidade durante o processo de congelamento.
- Colocar o recipiente invertido num criotubo e encher com meio de cultura de células de congelação. Congelamento até -80 ° C utilizando um co congelaçãontainer. Armazenar a -80 ° C, se os recipientes forem para ser usado no prazo de uma semana. Para armazenamento a longo prazo, cryovials lugar a -180 ° C. Ao realizar o isolamento CE, descongelar as criotubos rapidamente num banho de água (37 ° C) e colocar imediatamente em HBSS arrefecido com gelo. Prosseguir como indicado em 1.7.
- Transferir o navio para um tubo de 50 ml e lave-o duas vezes em HBSS para remover os eritrócitos (ou meio de congelamento residual em caso de degelo) (Figura 1I).
- Digerir o recipiente em um tubo de 50 ml com uma solução de 30 mL de colagenase tipo II (0,15 U / ml) e dispase (0,15 U / ml) em células caninas endoteliais Meio de Crescimento (CECGM) durante 1 h a 37 ° C com suave intermitente agitação.
- Retirar o recipiente do tubo e centrifuga-se a suspensão de células durante 5 min a 250 x g.
- Ressuspender o sedimento de células em um CECGMND semente 2 ml de suspensão de células por poço (1 - 3 poços dependendo do tamanho do recipiente). Cultura das células a 37 ° C em uma atmosfera humidificada com 5% de CO 2 em ar e alterar o meio de cultura duas vezes por semana.
- A passagem das células quando uma confluência de 70-80% é atingido.
- Lavam-se as células com HBSS pré-aquecido para remover células mortas ou não-ligados. Adicionou-se 200 células-enzima recombinante dissociação ul (1x) a cada poço e colocar de volta na incubadora durante 5 min ou até que todas as células são separadas.
- Transferir as células para um tubo de 15 ml e parar tripsinização adicionando 10 ml de meio de cultura (CEGM) incluindo 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS). Centrifugar durante 5 minutos a 250 x g. Continuar a cultura numa placa pré-revestida de gelatina ou balão.
2. Caracterização
- Culturas células caninas aórtica endoteliais (CnAOECs) e comparar a morfologia das linhas celulares primárias e comerciais, duas vezes por semana com um microscópio.
NOTA: Tele típica crescente padrão de ECs em manchas pode ser melhor observado quando uma confluência de> 70% é atingido.- Cultura CnAOECs em CECGM em um frasco T75 0,5% w / v de gelatina, pré-revestido. células de passagem, uma vez por semana, quando a confluência é de 70 - 80%.
- Para Passaging, lave as células uma vez com HBSS pré-aquecido e adicionar 1 ml de enzima celular recombinante de dissociação (1x). Colocar o balão de volta na incubadora durante 5 min ou até que todas as células são separadas. Inactivar a tripsina por adição de meio de cultura de 10 ml (CEGM) incluindo 10% de FCS. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 250 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura de 1 ml.
- Tomar uma aliquota de 10 uL da suspensão de células e diluir 1: 1 com 0,4% de azul de tripano. Contar as células utilizando um contador de células automatizado, e placa para 4,0 x 10 5 células viáveis em um novo frasco T75. Adicionar 10 ml de CECGM pré-aqueceu-se ao balão e cultura a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2.
- Cultura CnAOECs em CECGM em um frasco T75 0,5% w / v de gelatina, pré-revestido. células de passagem, uma vez por semana, quando a confluência é de 70 - 80%.
- Isolar RNA de passagem 1 dos CaPECs cultivadas e CnAOECs.
- Recolher pelo menos 1 x 10 3 células como um sedimento, adicionar 20 ul de reagente de preparação da amostra (SPR) e incubar durante 1 min para lisar as células. Após a incubação, recolher cuidadosamente o lisado celular contendo o ARN total e armazenar a -70 ° C.
- Converter o ARNm em ADNc utilizando um kit de síntese de ADNc (por exemplo, iScript) seguindo as instruções do fabricante. ADNc Armazenar a 4 ° C até uma semana, ou a -20 ° C durante a longo prazo até estar pronto para executar o qPCR.
- Medir a expressão do gene do marcador endotelial CD31 para confirmar a origem das células endoteliais. Faça a configuração experimental e quantificação utilizando as diretrizes Precis MIQE 10. Para a normalização, medir a expressão de genes de referência GAPDH, RPS19 e B2MG 11.
- Prepara-se uma diluição de 10 vezes do ADNc obtido em água isenta de nuclease.
- Prepararuma diluição de 4 vezes a partir de amostras de cDNA reunidos para a linha de padrão e usar a água livre de nuclease, como um controlo não-molde. Dilui-se as amostras cinco vezes para obter um total de diluição de 50 vezes para as reacções qPCR. Pipetar 10 ul reacções em duplicado em um formato de 384 poços utilizando 4 ul de cDNA e 6 uL do fluoróforo misturada com 20 pmol de iniciador directo e inverso (Tabela 1).
- Definir o programa a 95 ° C durante 5 min para a activação da polimerase Taq, seguido por 39 ciclos de 10 seg a 95 ° C para desnaturação, 30 segundos e a Tm para o emparelhamento e alongamento. A Tm para cada conjunto de iniciadores está mostrado na Tabela 1.
- Executar derretendo curva analisa a seguir a cada corrida para garantir que apenas um produto é amplificado. Normalizar os níveis das amostras utilizando o valor médio relativo dos genes de referência da expressão, e calcular a eficiência da reacção ΔCt se estiver compreendida entre 95% e 105%.
- Avaliar a funcionalidade CE, com um angiensaio ogenesis.
- Adicionar 10 ul de matriz extracelular em cada cavidade de uma lâmina pré-arrefecida a angiogénese e espalhar com uma ponta de pipeta para cobrir a superfície do poço. Manter a matriz extracelular em gelo e evitar a introdução de bolhas de ar no gel. Solidificar o gel, colocando a lâmina numa placa de Petri com água embebido toalhas de papel numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 30 min.
- Adicionar 1,0 x 10 4 primário ECs em 50 ul de Crescimento Endotelial de meio por poço. Incubar a lâmina durante 6 h a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Após 6 horas tirar fotografias com uma ampliação de 20X, certificando-se de incluir todo o bem na imagem.
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Representative Results
Vasos sanguíneos diferentes foram submetidas com sucesso para o protocolo de isolamento descrito (Figura 2). Foi possível dissecar e inverter aorta, veia cava, veia porta e artéria coronária em cães saudáveis (todos os vasos de cada cão, n = 4). Com os mesmos ECs abordagem foram isolados a partir de dois desvios portossistêmicos congênitos (extra-hepáticas e intra-hepática, n = 1 cada). Embora aorta foi facilmente invertida, segmentos da aorta torácica foram mais desafiador do que aorta abdominal. Em segmentos da aorta torácica tem muitas artérias intercostais ramificação a partir dele, que precisam de ser ligada individualmente para assegurar a exposição estritamente endotelial para a solução de digestão. O segmento dissecada da veia cava caudal incluído o ponto de ramificação das veias renais, que precisavam ser ligado antes da inversão. Para a veia portal do ramo contribuindo do gastroduodenalis cava foi ligada antes da inversão do vaso sanguíneo. o coronary artéria em cães é um vaso sanguíneo muito menor (aproximadamente 1 - 2 mm de diâmetro num cão de tamanho médio), a partir do qual a excisão de um segmento da artéria circunflexa. Porque tem um diâmetro pequeno, ele provou ser mais fácil para inverter uma bastante curto segmento de 1 cm, porque as pinças mosquito não pode ser inserido muito mais longe.
pós isolamento células aderidas um dia eram visíveis na placa de cultura. Em cultura, CaPECs tinha uma forma poligonal e exibida uma tendência para crescer em placas, como mostrado na Figura 3 numerosas colónias de células endoteliais pode ser observada. 3 - 6 dias após o isolamento. Depois de aproximadamente 10 dias em cultura uma confluência de 80% foi atingido e células podia ser ultrapassado. Em média, as culturas endoteliais primárias poderiam ser mantidos por um período máximo de 8 passagens (uma vez por semana a uma taxa de divisão de 1: 4) em que ponto eles pararam de crescer.
Isolacélulas endoteliais Ted expresso endotelial CD31 marcador de células, tal como indicado por qPCR (Figura 4). A expressão em células endoteliais derivadas da aorta, da veia cava, e veia porta a partir de quatro cães foi comparada com uma cultura de controlo CnAOECs. As células primárias em cultura tinha uma expressão de CD31 comparável com o controlo de ECs (Kruskall-Wallis, p = 0,856).
CaPECs derivadas da aorta, a veia cava e veia porta mostrou ramificação após a incubação de 6 horas no slide angiogénese tal como mostrado na Figura 5.
Figura 1: Dissecando e invertendo vasos sanguíneos para o isolamento de células endoteliais. A) O vaso sanguíneo de interesse é removido assepticamente a partir de um cadáver canino fresco. B) do tecido aderente e / ou de gordura em torno do vaso deve ser removed cuidadosamente com uma tesoura cirúrgica, sem danificar o próprio (canino veia cava, segmento abdominal de 5 cm). C navio) Com curvas forceps Halsted Mosquito, o navio pode ser introduzido sem perfurar a camada endotelial. DG) Fixe a pinça na outra extremidade do vaso sanguíneo e suavemente retrair, invertendo assim completamente o vaso sanguíneo. A camada endotelial é agora do lado de fora do recipiente. H) suturas em bolsa de são colocados nas extremidades de fecho para fora da superfície não endotelial do vaso invertido. I) O vaso sanguíneo é transferida para um tubo de 50 mL para lavagem e digestão subsequente. Barras de escala indicam 2 cm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:.. Morfologia celular imagens foram tiradas duas semanas após a digestão dos vasos FR A) ECs derivadoaorta om canino na passagem 2. B) ECs derivadas de veia cava canino na passagem 2. C) ECs derivadas de veia porta canino na passagem 2. Todas as imagens são tiradas com uma ampliação de 4X originais. As barras de escala indicam a 500 uM. Inserir mostra aumento de 10x. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Gene Expression de CD31. A expressão de CD31 em células endoteliais em uma passagem derivadas da aorta, da veia cava, e veia porta (n = 4 cães). Não foram observadas diferenças significativas entre a expressão CaPECs eo CnAOECs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Angiogenesis fotografias de CnAOECs e CaPECs de aorta, veia cava e veia porta após incubação de 6 horas em um slide de angiogênese (20x). Formação Branch é visível após 6 horas em b) CaPECs cultura. A) CnAOECs. Derivadas de aorta. C) CaPECs derivadas de veia cava. D) CaPECs derivado de veia porta. Todas as células foram na passagem 3. As barras de escala indicam 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| GOI | Direção | 5'-Sequence-3 ' | Tm de recozimento | Tamanho do produto (pb) | número Genebank | |
| CD31 | para a frente | GTTCTGCGTGTCAAGGTG | 59 ° C | 85 | XM_005624261.1 | |
| Reverso | TGTCCTTCCCAAACTCCA | |||||
| beta-actina | para a frente | GATATCGCTGCGCTTGTGGTC | 58 ° C | 384 | NM_001195845 | |
| Reverso | GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC | |||||
| RPS19 | para a frente | CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG | 63 ° C | 95 | XM_005616513 | |
| Reverso | GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG | |||||
| B2MG | para a frente | TCCTCATCCTCCTCGCT | 63 ° C | 85 | AB745507 | |
| Reverso | TTCTCTGCTGGGTGTCG | |||||
Tabela 1: qPCR Primer Define iniciadores de qPCR para genes de referência caninos e CD31..
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Discussion
Em estudos com foco em ECs canino a linha primária CnAOEC é usado para modelar as linhagens endoteliais do cão 3, 12, 13. Em estudos humanos, a cultura HUVEC ainda é considerada o padrão-ouro. Claramente, concentrando-se apenas em ECs derivadas do cordão umbilical é uma restrição firme na investigação cardiovascular. As células endoteliais têm um padrão de expressão de genes específicos de determinar especificação arteriovenosa. A fim de levar em conta essas diferenças nos vasos pós-natal apresentamos este método de isolamento de romance com base na localização anatômica específica das células endoteliais. Os métodos vulgarmente utilizados para o isolamento CE primário são a lavagem do vaso com uma solução de enzima ou picagem do recipiente antes da digestão, dois métodos que ambos têm um risco de contaminação por não-CEs. Nós estabelecemos uma técnica para o isolamento de células endoteliais Canino primária (CaPECs) com um menor risco de contaminação, que também pode ser usado em pequenos vasos. Este isolamento método de células endoteliais é baseado na inversão do recipiente, o que evita a digestão de todos os outros tipos de células recipiente. É importante remover os recipientes em condições assépticas, como ilustrado na Figura 1A, para evitar a contaminação bacteriana ou fúngica das culturas endoteliais. No caso de crescimento bacteriano um agente antimicrobiano adicional (por exemplo, gentamicina) pode ser adicionado ao meio de cultura. Em caso de tratamento de infecção fúngica não é frequentemente bem sucedidos em nossa experiência.
Para que a inversão de sucesso, é essencial para se obter um recipiente que é de aproximadamente 5 cm de comprimento. Um segundo passo importante para facilitar a inversão do vaso sanguíneo é a remoção de qualquer tecido aderente e gordura com tesouras cirúrgicas. Invertendo a embarcação é feita cuidadosamente por aperto da pinça na extremidade oposta e, lentamente, invertendo o recipiente. Ao colocar a bolsa-corda suturas certifique-se de tocar a camada endotelial tão pouco quanto possível. Damage do endotélio pode resultar num fraco rendimento de células endoteliais viáveis e acesso da mídia a digestão ao tecido subjacente. Isso também pode acontecer se o navio não está completamente fechada. O recipiente pode ser facilmente manuseado por pegá-la na extremidade de uma ligadura.
Em casos específicos, pode ser aplicada uma modificação da técnica. Em vasos sanguíneos com um diâmetro pequeno às vezes é impossível para inserir uma pinça mosquito, a fim de inverter a embarcação. Uma solução consiste em colocar suturas de ancoragem numa extremidade do recipiente e empurrar as suas ligaduras através do vaso sanguíneo usando os fórceps. Na outra extremidade, em seguida, eles podem ser protegidos com um fórceps e puxada contra mosquitos, invertendo desse modo o vaso. Às vezes, o navio vai rasgar como consequência das suturas extras, por isso esta modificação não é a abordagem preferida. Outro problema que pode surgir é quando muitos eritrócitos estão presentes nas placas de cultura de sementeira em cima das células primárias. Isto pode ser o resultado delavagem insuficiente do vaso sanguíneo antes da digestão. Quando isto ocorre, a lavagem dos poços no dia 2 com HBSS quente é muitas vezes suficiente para remover a maioria dos eritrócitos. Em qualquer caso, os eritrócitos não persistirá na cultura e são perdidos Após passagem dos CaPECs.
Os CaPECs isolados expressaram CD31, indicando que a população de células que foi digerida a partir do vaso sanguíneo é na verdade, de origem endotelial. Como foi recentemente publicado, este marcador é também expresso em células endoteliais a partir da válvula mitral canino 14. A formação de colónias em cultura indica as culturas começam a partir de qualquer células individuais ou de grupos de células pequenas. O crescimento rápido em mídia específica endotelial também é indicativo do tipo de célula correta. As células primárias podem ser cultivadas durante oito passagens, após o que as culturas cessar expansão. Esta é uma indicação de senescência e torna menos provável que as células-tronco / progenitoras são cultivadas com este protocol. Num ensaio de angiogénese, CaPECs a partir da aorta, a veia cava e veia porta mostrou ramificação dentro de 6 horas. Esta funcionalidade endotelial fornece sólida evidência para a sua origem.
Com base na disponibilidade único material canino foi estudado, mas o método de isolamento tem aplicações possíveis para o isolamento de células endoteliais primárias humanas ou de células endoteliais a partir de outros organismos. A técnica também é possível para vasos muito pequenos (1 cm de comprimento), mas irá produzir menos células isoladas. Por esta razão CaPECs obtidas a partir de pequenos vasos exigirá uma passagem extra antes de terem atingido um número suficiente para experiências.
A capacidade de executar o método de isolamento em pequenos vasos é uma grande vantagem para os estudos na doença vascular. ECs poderia ser isolado a partir de vasos doentes ou aberrantes como desvios portossistêmicos. Estes são vasos de ligação da veia porta e da circulação sistémica, que faz com que o sangue se desvie do fígado 2 15, 16.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
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