Introduction
Köpekler kardiyovasküler hastalık araştırmaları için büyük bir hayvan modeli olarak kullanılmaktadır ve aynı zamanda doğuştan (genetik) vasküler anormallikler 1, 2 muzdarip olabilir. Ticari endotel hücre hatları genellikle endotel hücre (EC) işlevselliğini değerlendirmek için kullanılan bu hastalıkların incelenmesi. köpekler için köpek aortundan alınan (CnAOEC) mevcuttur ticari bir endotelyal hücre hattı vardır. Bu hücre hattı çoğunlukla kontrol, normal EC 3-5 olarak çalışmalarda kullanılmaktadır. kan dolaşım araştırmada en yaygın olarak kullanılan endotel hücre çizgileri sırasıyla insan göbek kordonu damar ve arter türetilen insan Göbek Daman Endotel Hücreleri (HUVECs) ve İnsan Umbilikal Arter Endotel Hücreleri (HUAECs) vardır. HUVECler 1980'lerden 6 yılından bu yana damar araştırmalarda altın standart olarak kullanılmıştır. Onlar endotel fonksiyonu ve hastalık adaptasyonunu incelemek için klasik model sistem olarak kabul edilmektedir. Farklı kan damarları izole endotel hücreleri appearanc değişirE ve mikroçevresinin 7 genetik arka plan ve maruz kalma nedeniyle işlevsellik. Buna ek olarak, HUVECler ve HUAECs, göbek kordonu şartlarına göre tamamen taklit yetişkin kan damarlarının onlar ve hastalığa yanıt maruz olmayabilir gelişimsel vasküler yapı elde edilir. Bu nedenle, genel olarak kardiyovasküler hastalık için HUVEC bulunan sonuçları ve HUAECs tercüme yetersizdir.
adaptasyon ve yetişkin EC davranışını incelerken, ilgilenilen damarın birincil EC daha doğrudan bir yaklaşım olarak kullanılmalıdır. bu hücrelerin izole edilmesi için, çeşitli yöntemler bildirilmiştir. Ayrıca, HUVEC için kullanılan bir çok tarif edilen yöntem, enzimatik sindirim çözeltisi 8 kap yıkama edilir. Bu çoğu zaman, düz kas hücreleri, fibroblastlar ve 9 olmayan EC ile kontaminasyon sonuçlanır. izolasyon için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, Floresan-takiben kıyılmış damar doku enzimatik sindirimi olanFarklılaşma (CD) 31 7, 8. FACS ayıklama endotelyal hücre belirteci küme ve daha sonra, hücre kültürü göre (FACS) aktif hücre hücrelerin nispeten büyük miktarlarda gerektirir ve bu nedenle ince kan damarlarından endotelyumun izolasyon için uygun değildir. Bu nedenle yüksek saflıkta çeşitli köpek kan damarlarından saf endotel hücre popülasyonunu izole etmek için yeni bir sağlam bir yöntem geliştirmeyi amaçladık. Yeni izolasyon yönteminin etkinliğini test etmek için, izole ve büyük ve küçük her ikisi de farklı köpek arterler ve venler, saf Canine Primer endotel hücre (CapeC) kültürleri elde etti. Bu yöntem aynı zamanda doğuştan içi veya dışı hepatik portosistemik şant, köpekler 2 ortak bir hastalık olarak hastalıklı ve / veya anormal damarlardan kaynaklanan endotel hücrelerinin kültürü sağlar. kabın en int olarak kalmaktadır, bu yöntem, vasküler düz kas hücreleri gibi aynı geminin alakalı ek hücre tiplerinin izolasyonu sağlarİşlem sırasında hareket ederler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik bildirimi: Bu çalışmada kullanılan Kan damarları taze köpek kadavra elde edilen artı malzemesi olarak hasat edildi (n = 4), diğer ilişkisiz araştırma (Üniversite 3R politikası) için ötenazi sağlıklı köpeklerden. Anormal kan damarları (intra ve ekstrahepatik portosistemik şantlar, n = 1 adet) Utrecht Üniversitesi Companion Animals Üniversite Kliniği sunulan köpekler sahiplerinin bilgilendirilmiş onam sonra otopsi hasat edilmiştir.
1. İzolasyon ve Kültür İlköğretim Köpek Endotel Hücreleri
- 2 ml / göz% 0.5 ağırlık / hacim jelatin ile ön-kat 6 oyuklu plakalar, 37 ° C'de% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde bir kuluçka makinesi içinde 2 saat süre ile bırakın. önce birincil hücrelerin ekim aşırı jelatin çözüm çıkarın.
- Aseptik taze köpek kadavra (Şekil 1A) kan damarı (ler) ilgi (örneğin, aort, vena kava, vena porta) çıkarın. damar sisteminin anatomisini korumakÇevrede kabın her iki ucunda, düz forseps koyarak. endotel hücrelerine zarar görmesini önlemek için forseps ile doku gereksiz manipülasyon kaçının.
- cerrahi makas ile her iki ucunda kenetlenmiş gemi kesin ve kadavra kaldırmak. buz üzerinde Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) taşınması.
Not: yaklaşık olarak 5 sm bir tekne uzunluğu, bu prosedür için tercih edilir, ancak 1 cm boyutlarında o da kültür için yeterli hücreleri sağlar.
- cerrahi makas ile her iki ucunda kenetlenmiş gemi kesin ve kadavra kaldırmak. buz üzerinde Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) taşınması.
- buz soğukluğunda HBSS ile dolu bir Petri kabı, kan damarı aktarın. Cerrahi makas kullanılarak, damar kendisi sağlam (Şekil 1B) tutmak kabın dışından yapışık doku ve yağ çıkarmak. Optimal görünüm için bir kelepçe veya forseps ile kenara çevredeki dokuyu çekin: keserken emin damar her zaman açıkça görünür olduğundan emin olun.
- Bitişik harfler ile her türlü tekne dalları kapatın (örneğin, 3-0 polyglactin) ve daha sonra bunları kaldırmakcerrahi makas veya neşter ile.
- Dikkatle, kavisli bir Halsted sivrisinek forseps ile bir gemi ucunu girmek geminin diğer ucundaki forseps ucu kelepçe ve dışarı (Şekil 1C-G) tamamen içine kadar sonra yavaş yavaş gemiyi tersini, geri çekin. dış artık endotel hücre tabakasını içermektedir. herhangi bir zorluk gemi tersini üzerine karşılaşılırsa, sürtünmeyi azaltmak için tekrar HBSS daldırın.
- Tamamen kapatmak için ve sindirim prosedürü (Şekil 1H) herhangi olmayan endotelyal damar dokusu maruz kalmasını önlemek için geminin her iki ucunda purse-string sütür koyun. ters gemi işlemek için bağ uçlarını kullanın.
- sindirim ve kültür daha sonra yapılırsa, sindirim protokolü (adım 1.7) öncesinde ters gemi cryopreserve.
- kriyotüpe içinde ters gemi yerleştirin ve hücre kültür ortamı dondurma ile doldurun. Bir dondurma co kullanarak aşağı -80 ° C'ye kadar Freezentainer. -80 ° C'de saklayın gemiler bir hafta içinde kullanılacak ise. Uzun süreli depolama, -180 ° C'de yer cryovials için. AT izolasyon gerçekleştirirken, bir su banyosu (37 ° C) hızla cryovials çözülme hemen buz soğukluğunda HBSS yerleştirin. 1.7 belirtildiği gibi devam edin.
Not: izolasyondan sonra EC toplam verimi sayesinde dondurma işlemi sırasında canlılığı kaybına daha düşük olacağı dikkate alacaktır.
- kriyotüpe içinde ters gemi yerleştirin ve hücre kültür ortamı dondurma ile doldurun. Bir dondurma co kullanarak aşağı -80 ° C'ye kadar Freezentainer. -80 ° C'de saklayın gemiler bir hafta içinde kullanılacak ise. Uzun süreli depolama, -180 ° C'de yer cryovials için. AT izolasyon gerçekleştirirken, bir su banyosu (37 ° C) hızla cryovials çözülme hemen buz soğukluğunda HBSS yerleştirin. 1.7 belirtildiği gibi devam edin.
- 50 ml'lik bir tüp gemi aktarın ve (Şekil 1I) (çözülme durumunda veya artık dondurma orta) eritrositler kaldırmak HBSS iki kez yıkayın.
- Aralıklı yumuşak olan 37 ° C 'de 1 saat boyunca köpek Endotel Hücrelerinde 30 mi kolajenaz tip II (0.15 U / ml) ve dispase (0.15 U / ml) içeren bir çözeltiye Gelişim Ortamı (CECGM) olan bir 50 ml tüp içinde damar Digest çalkalama.
- g tüpten gemi çıkarın ve x 250 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu santrifüj.
- CECGM a hücre pelletinind tohum 2 ml hücre süspansiyonu oyuk başına (1-3 kuyu damar boyutuna bağlı olarak). Kültür hava içinde% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C 'de hücreleri ve haftada iki kez kültür ortamı değiştirin.
- % 80 ulaşıldığında - 70 bir confluency Passage hücreleri.
- Ölü ya da olmayan bağlanmış hücreler uzaklaştırılmıştır önceden ısıtılmış HBSS hücreleri yıkayın. Her bir oyuğa 200 ul rekombinant hücre-ayrılma enzimi (1x) ilave edin ve 5 dakika boyunca ya da tüm hücrelerin müstakil kadar tekrar inkübatör yerleştirin.
- 15 ml'lik bir tüpe transfer hücreleri ve% 10 cenin buzağı serumu (FCS) içeren kültür ortamı 10 ml (CEGM) eklenerek tripsinizasyon durdurun. 250 x g hızında 5 dakika süreyle santrifüj. Jelatin önceden kaplanmış plaka veya şişede kültür devam edin.
2. Karakterizasyonu
- Kültür Köpek aort endotel hücreleri (CnAOECs) ve bir mikroskop ile haftada iki kez birincil ve ticari hücre hatlarının morfolojisi karşılaştırın.
NOT: TO, tipik>% 70 konfluansa ulaştığında iyi görülmektedir yamalar EC desen büyüyen.- % 0.5 ağırlık / hacim jelatin önceden kaplanmış T75 şişesinin üzerine CECGM Kültür CnAOECs. haftada bir kez Passage hücreleri confluency 70 -% 80.
- geçirilmesi için önceden ısıtılmış bir kez HBSS ile yıkama hücreleri, 1 ml yeniden birleştirici hücre ayrışma enzimi (1x) ekleyin. 5 dakika boyunca veya tüm hücreler müstakil kadar inkübatör geri şişeyi yerleştirin. % 10 FCS içeren 10 ml kültür ortamı (CEGM) eklenerek tripsin inaktive. 250 x g'de 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj süpernatan atılır ve 1 ml kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri.
- Hücre süspansiyonu, 10 ul bir kısım almak ve 1 seyreltin:% 0.4 tripan mavisi ile 1. Otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayımı ve yeni T75 şişesi içinde 4.0 x 10 5 canlı hücreleri plaka. % 5 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C'de bir şişeye ve kültür önceden ısıtılmış CECGM 10 ml ekleyin.
- % 0.5 ağırlık / hacim jelatin önceden kaplanmış T75 şişesinin üzerine CECGM Kültür CnAOECs. haftada bir kez Passage hücreleri confluency 70 -% 80.
- Kültür CaPECs ve CnAOECs geçişi 1 RNA izole edin.
- Bir pelet gibi en az 1 x 10 3 hücreleri toplamak örnek hazırlama reaktifi (SPR) 20 ul ekle ve hücreleri lize etmek için 1 dakika için inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, dikkatli bir şekilde -70 ° C'de, toplam RNA ve mağaza ihtiva eden hücre lizatı toplar.
- Üreticinin talimatları izlenerek bir cDNA sentez kiti (örneğin, iScript) kullanılarak cDNA'ya mRNA dönüştürün. qPCR gerçekleştirmek için hazır olana kadar uzun süre için 4 ° C'de bir hafta kadar ya da -20 ° C'de saklayın cDNA.
- endotel hücre kaynağını teyit etmek için endotelyal işaretleyici CD31 gen ifadesini ölçün. MIQE Özetleyerek yönergeleri 10 kullanılarak deney düzeneği ve kantifikasyonunu gerçekleştirin. Normalleşmesi için, referans genler GAPDH, RPS19 ve B2MG 11 ifadesini ölçmek.
- nükleaz içermeyen su elde edilen cDNA bir 10-kat seyreltme hazırlayın.
- hazırlamakStandart hattı için bir araya getirilmiş cDNA örnekleri bir 4-kat seyreltme ve şablon olmayan kontrol olarak nükleaz serbest su kullanın. qPCR reaksiyonları için 50 kat, toplam seyreltme ulaşmak için numune beş kez seyreltilir. 4 ul cDNA ve geri ve ileri doğru primer (Tablo 1) 20 pmol ile karıştırılmış fluorofor 6 ul kullanılarak 384 oyuklu bir formatta iki kez pipetle 10 ul reaksiyonları.
- denatürasyon için 95 ° C de 10 saniye 39 döngü, ardından Taq polimeraz aktivasyonu için 5 dakika, tavlama ve uzama için Tm 30 saniye boyunca 95 ° C'ye kadar bir program ayarlama. Her bir primer grubu için Tm Tablo 1 'de gösterilmiştir.
- erime eğrisi gerçekleştirin yükseltilir tek bir ürün sağlamak için her çalıştırmak aşağıdaki analiz eder. Referans genlerin ortalama bağıl miktarda kullanarak numunelerin ifade düzeylerini normale ve reaksiyon verimi% 95 ile% 105 arasında ise ACt hesaplayın.
- Bir Angi EC işlevselliğini değerlendirmekogenesis deneyi.
- önceden soğutulmuş bir anjiyojenez sürgünün her çukuruna hücre dışı matrisin 10 ul ilave edilip iyice yüzeyini kaplayan bir pipet ucu ile yayılır. buz üzerinde hücre dışı matris tutmak ve jele hava kabarcıklarının giriş önlemek. 30 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de, bir kuluçka makinesi içinde suda ıslatılmış kağıt havlu ile bir Petri kabındaki slayt koyarak jel katılaşmaya.
- 1.0 x 10 4 birincil ekle EC 50 ul Endotel Gelişim Ortamı ile sabitleştirilir. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de 6 saat süre ile slayt inkübe edin.
- 6 saat sonra görüntüdeki tüm kuyu içerdiğinden emin yapma, 20X büyütme ile fotoğraf çekmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklı kan damarları başarıyla açıklanan izolasyon protokolü (Şekil 2) tabi tutuldu. Teşrih ve sağlıklı köpeklerden aort, vena kava, vena porta ve koroner arter ters mümkün olmuştur (her köpekten tüm damarları, n = 4). Aynı yaklaşım EC iki doğumsal portosistemik şant (ekstrahepatik ve intrahepatik, n = 1 adet) izole edilmiştir ile. Aort kolayca ters olmasına rağmen, aort segmentleri abdominal aorta daha zorlu idi. göğüs segmentlerde aort sindirim çözüm kesinlikle endotel pozlama sağlamak için ayrı ayrı bağlandı gerekir ondan dallanma çok interkostal arterleri vardır. kaudal vena kava disseke segmenti ters önce bağlandı gereken böbrek damarlarında, dallanma noktasını dahil. vena gastroduodenalis ve katkı dalı damar portal için kan damarının ters önce bağlandı. olarak koronerBu inceltme dalı bir bölümünü eksize olan - (orta boy bir köpekte 2 mm çapında yaklaşık olarak 1), köpeklerde Y arter çok daha küçük bir kan kaptır. küçük bir çapa sahip olduğundan, Sivrisinek forseps daha da ileri takılı değil çünkü 1 cm oldukça kısa bir segment ters çevirmek için daha kolay olduğunu kanıtladı.
Bir gün sonra izole yapışmış hücreler kültür plakasına görünür. Kültüründe CaPECs çok köşeli bir şekil vardı ve Şekil 3'te gösterildiği gibi, yer yer büyüme eğilimi görüntülenen endotelyal hücrelerin çok sayıda koloni 3 gözlenebilir -. 6 gün sonra, izolasyon. kültür içinde yaklaşık 10 gün sonra,% 80 bir birleşik hale gelmiş ve hücreler aştı edilebilir. hangi noktada onlar büyüyen durdu: Ortalama birincil endotel kültürleri (4 1 bölünmüş hızında haftada bir kez) 8 pasajların en fazla muhafaza edilebilir.
IsolaqPCR (Şekil 4) ile belirtildiği gibi ted endotel hücreleri, endotelyal hücre belirteci CD31 ifade edilmiştir. Dört köpeklerden aort, vena kava, ve vena porta türetilen endotel hücrelerinde sentezleme CnAOECs bir kontrol kültürü ile karşılaştırılır. kültürlü birincil hücreler kontrol EC (Kruskall-Wallis, p = 0.856) ile karşılaştırılabilir CD31 ifadesi vardı.
Şekil 5'te gösterildiği gibi, aort, vena kava ve vena porta türetilen CaPECs anjiyojenez slayt üzerinde 6 saat inkübasyondan sonra dallanma gösterdi.
Şekil 1: Diseksiyon ve Endotel Hücre İzolasyon için kan damarlarını ters çevirme. A) ilgi damar aseptik olarak taze bir köpek kadavra b.) Yapışkan doku ve / veya remov olmalıdır kabı çevreleyen yağ kaldırılıred dikkatle kavisli Halsted Sivrisinek forseps ile geminin kendisi (5 cm köpek vena kava, karın kesimi). C) zarar vermeden cerrahi makas ile, damar endotel tabakası delme olmadan girilebilir. DG) diğer yandan forseps Güvenli kan damarlarının bitirmek ve yavaşça böylece tamamen kan damarı tersini, geri çekin. Endotel tabakası Cüzdan telli dikişler damar yıkama için 50 ml'lik bir tüpe aktarıldı ters kap. I) 'in endotel dışı yüzey kapama uçlarına yerleştirilir) damar. H dışında hemen ve sonraki sindirim. Ölçek çubukları 2 cm göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:.. Hücre Morfolojisi Resimler iki hafta gemilerin sindirim sonra alınmıştır A) EC türetilmiş frgeçit 2. B om köpek aorta) EC geçit 2. C köpek vena kava türetilmiş) geçit 2. Tüm resimler de köpek vena porta türetilen EC 4X orijinal büyütme ile alınır. Ölçek çubukları 500 mikron göstermektedir. Ekle 10X büyütme gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: CD31 gen ifadesi. aort, vena kava, ve vena porta (n = 4 köpek) elde edilen geçit 1 endotel hücrelerinde CD31 ekspresyonu. Anlamlı ifade farklılıklar CaPECs ve CnAOECs arasında gözlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. Bir anjiyogenez slayt (20x büyütme) 6 saat kuluçkalamadan sonra, aort, vena kava ve vena porta gelen CnAOECs ve CaPECs anjiyojeneze fotoğrafları. Aorta. C türetilen kültür. A) CnAOECs. B) CaPECs) vena kava. D'sinden türetilir CaPECs) CaPECs 6 saat vena porta türetilen sonra Şube oluşumu görünür. Tüm hücreler 3. Ölçek çubukları 1 mm işaret geçit vardı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| GOI | yön | 5'-Dizi-3 ' | tm tavlama | Ürün boyutu (bp) | Gen bankası numarası | |
| CD31 | ileri | GTTCTGCGTGTCAAGGTG | 59 ° C | 85 | XM_005624261.1 | |
| Ters | TGTCCTTCCCAAACTCCA | |||||
| p-aktin | ileri | GATATCGCTGCGCTTGTGGTC | 58 ° C | 384 | NM_001195845 | |
| Ters | GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC | |||||
| RPS19 | ileri | CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG | 63 ° C | 95 | XM_005616513 | |
| Ters | GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG | |||||
| B2MG | ileri | TCCTCATCCTCCTCGCT | 63 ° C | 85 | AB745507 | |
| Ters | TTCTCTGCTGGGTGTCG | |||||
Tablo 1: qPCR Primer Setleri qPCR primerler köpek referans genler ve CD31 için..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Köpek EC odaklanan çalışmalarda CnAOEC birincil hat köpek 3, 12, 13 endotel soy modellemek için kullanılır. İnsan çalışmalarında, HUVEC kültürü hala altın standart olarak kabul edilmektedir. Açıkçası, göbek kordonu elde edilen EC üzerinde sadece odaklanan Kardiyovasküler araştırmalarda bir firma kısıtlama olduğunu. Endotel hücreleri arteriovenöz özelliklerinin belirlenmesiyle belirli bir gen ifade desen var. Doğum sonrası damarlarda bu farklılıkların hesaba katmak için biz endotelyal hücrelerin spesifik anatomik yere göre bu yeni izolasyon yöntem mevcut. yaygın birincil AK izolasyonu için kullanılan yöntemler, hem olmayan EC ile kontaminasyon riski var iki yöntem bir enzim solüsyonu ile gemi ateş basması ya da sindirim önce geminin kıyma vardır. Ayrıca küçük damarlarda kullanılabilir kirlenme daha az şans köpek primer endotel hücrelerinin izolasyonu (CaPECs) için bir teknik tesis. Bu izolasyon mendotel hücrelerinin yöntemde, diğer kap hücre tipleri sindirim önler kap, bir dönüşümünü esas almaktadır. Şekil 1A 'de gösterildiği gibi, aseptik damarları kaldırmak için endotel kültürlerin bakteriyel veya fungal bulaşmasını önlemek için önemlidir. Bakteri büyümesi durumunda ek bir antimikrobiyel madde (örneğin, gentamisin) kültür ortamına ilave edilebilir. mantar enfeksiyonu tedavi durumunda genellikle bizim deneyim başarılı değildir.
başarılı ters için, yaklaşık 5 cm uzunluğunda olan bir kap elde etmek için kritiktir. Kan damarının inversiyon kolaylaştırmak için bir ikinci önemli bir adım, cerrahi makas ile yapışık doku ve yağ atılmasıdır. gemi tersini karşıt ucunda forseps sıkma ve yavaş yavaş gemiyi tersini özenle yapılır. gırgır-dize yerleştirirken sütür mümkün olduğunca az endotel tabakası dokunmak emin olun. Damaendotel ge uygulanabilir endotel hücreleri ve alttaki dokuya sindirim medya erişim zayıf verimle neden olabilir. gemi tamamen kapalı değilse bu da olabilir. gemi kolayca ligature sonunda o toplayıp işlenebilir.
özel durumlarda, tekniğin bir modifikasyonu uygulanabilir. küçük çaplı kan damarlarında o gemiyi ters amacıyla bir Sivrisinek forseps eklemek için bazen imkansızdır. Bir çözelti kabının bir ucunda kalmak sütür yerleştirin ve forseps kullanılarak damar yoluyla birleşik harfleri bas etmektir. diğer ucunda onlar daha sonra bir Sivrisinek forseps ile güvenli ve böylece damar tersini, çekilebilir. Bazen kabı ilave dikişler bir sonucu olarak gözyaşı, bu nedenle bu modifikasyonu tercih edilen bir yaklaşım değildir. Birçok eritrosit primer hücre ekim sırasında kültür plakaları içinde mevcut olduğunda ortaya çıkabilir başka bir sorundur. Bu sonucu olabilirsindirim önce damar yetersizliği yıkandı. Bu durumda, sıcak HBSS ile 2 gün yıkanmasından eritrositlerin büyük bir kısmı bertaraf çoğu zaman yeterlidir. Her durumda, eritrositler kültüründe kalıcı olmaz ve CaPECs ve Pasajlanması üzerine kaybolur.
İzole CaPECs kan damarından sindirilmiş hücre popülasyonu gerçekten de endotel kaynaklı olduğunu belirtir, CD31 ifade edilmiştir. Son zamanlarda yayınlanan gibi, bu işaretçi de köpek mitral kapak 14 endotel hücrelerinde ifade edilir. kültürde kolonilerin oluşumu kültürleri tek hücre birinden veya küçük hücre kümeleri başlamak gösterir. endotelyal özel medya üzerinde hızlı büyüme aynı zamanda doğru hücre tipinin göstergesidir. Birincil hücreler, kültür genişlemesi sona sonra sekiz pasajlar için kültürlenebilir. Bu yaşlanma bir göstergesidir ve kök / progenitör hücreleri bu proto ile kültüre olduklarını daha az olası hale getirirCol. bir anjiyogenez deneyde, aort, vena kava ve vena porta gelen CaPECs 6 saat içinde dallanma göstermiştir. Bu endotel işlevsellik kökenlerine ispatıdır.
mevcudiyetine göre, sadece, köpek malzeme incelenmiştir, ancak izolasyon yöntemi insan primer endotel hücreleri veya diğer organizmalardan endotel hücrelerinin izolasyonu için olası uygulamalar vardır. Bu teknik çok küçük damarlarda (1 cm uzunluğunda) için de mümkündür, ancak daha az izole hücreler verecektir. onlar deneyler için yeterli sayıda ulaşmış önce bu nedenle küçük damarlarda elde edilen CaPECs ekstra geçit gerektirecektir.
küçük damarlarda izolasyon yöntemi gerçekleştirme yeteneği vasküler hastalık çalışmalar için büyük bir avantajdır. EC portosistemik şant gibi hastalıklı veya anormal damarlar izole edilebilir. Bu portal ven ve kan karaciğer bypass neden sistemik dolaşıma bağlayan damarlardır 2 15, 16 çalışma olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
