Abstract
Immunoassays המשמשים לאיתור חלבונים המבוססת על נוכחות של נוגדנים הקשורים. בשל השימוש הנרחב שלהם במחקר במסגרות קליניות, תשתית גדולה של מכשירי immunoassay וחומרים ניתן למצוא. לדוגמא, 96 ו 384 גם צלחות קלקר זמינות מסחרית ויש תכנון סטנדרטי כדי להכיל מכונות ספקטרוסקופיה אולטרה סגולות-גלוי (UV-Vis) מיצרנים שונים. בנוסף, מגוון רחב של נוגדנים, תגי זיהוי, וסוכני חסימת עיצובי immunoassay אישית כגון מבחני immunosorbent enzyme-linked (ELISA) זמין.
למרות התשתית הקיימת, ערכות ELISA סטנדרטיים אינם לענות על כל הצרכים המחקר, המחייב פיתוח immunoassay אישית, אשר יכול להיות יקר זמן רב. לדוגמא, ערכות ELISA יש ריבוב נמוך (זיהוי של יותר אנליטי אחד בכל פעם) יכול כפי שהם תלויים בדרך כלל קרינה או colשיטות orimetric לגילוי. מדד-צבע וניתוחים פלורסנט מבוססת יש יכולות מוגבלות ריבוב בשל פסגות רפאים רחבות. לעומת זאת, ראמאן בשיטות מבוסס ספקטרוסקופיה יש יכולת הרבה יותר עבור ריבוב בשל פסגות פליטה צרות. יתרון נוסף של ספקטרוסקופיית ראמאן הוא שכתבי ראמאן לחוות photobleaching פחות משמעותי מאשר תגי פלורסנט 1. למרות היתרונות שכתבי ראמאן יש מעל תגי פלורסנט colorimetric, פרוטוקולים לפברק immunoassays המבוסס ראמאן מוגבל. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול להכין בדיקות פונקציונליות לשימוש בשילוב עם לוחות קלקר לגילוי ישיר של analytes ידי ניתוח UV-Vis ו ספקטרוסקופיית ראמאן. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לקחת עשה זאת בעצמך גישה לגילוי רב-אנליטי בעתיד תוך ניצול תשתית שנקבעה מראש.
Introduction
immunoassays כריך האופייני בעקיפין לזהות הנוכחות של אנטיגן באמצעות שני נוגדנים. הנוגדן ללכוד מאוגד משטח יציב ויוצר קומפלקס נוגדן-אנטיגן כשהוא קרוב אנטיגן המתאים. נוגדן זיהוי מכן הוא הציג נקשר אנטיגן. לאחר הכביסה, הנוגדן / אנטיגן / שרידי ההרכב נוגדן והוא זוהה על ידי נוגדן זיהוי שכותרתו כפי שמודגם באיור 1 א. זיהוי טיפוסי נעשה על ידי גלאי פלורסנט או colorimetric, הגבלת ריבוב עד 10 analytes בשל פסגות רפאים רחבות 2,3. לעומת זאת, מערכות מבוססות ראמאן יש הרבה פסגות פליטת צרה וכתוצאה מכך יכול ריבוב משופר עם מקורות בטענת זיהוי סימולטני של עד 100 analytes 2,3.
מקורות ספרות רבים זמינים אשר מכסים היבטים חשובים הקשורים Immunoassays 4 - 6 כגון צעד-אחר-צעדפרטים ליצירת ערכות ELISA אישית. למרבה הצער, פרוטוקולים אלה הם לגילוי פלורסנט או colorimetric, הגבלת יכולת ריבוב של immunoassays אישית. כדי לתת מענה לצורך זה, אנו מציגים נוהל מפורט לפברק את immunoassay UV-Vis / ראמאן שפורסמו בעבר 7 עבור immunoassay ישירה כפי שמודגם באיור 1B.
פרוטוקול זה כולל ייצור של בדיקות מבוססות ננו-חלקיק זהב פונקציונלי, באיור 2. ההליך לעשות בדיקות ראמאן / UV-Vis מתחיל באמצעות קשירה לכתבי ראמאן אל פני השטח של ננו-חלקיקי זהב (AuNPs). AuNPs הם פונקציונלי אז עם נוגדנים הקשורים פוליאתילן גליקול (PEG). אתרי קישור היא נשאר על AuNPs חסומים באמצעות קשירת תיאול פוליאתילן גליקול methoxy (MPEG-SH) כדי AuNPs למנוע עוקב חייב הלא ספציפי במהלך ניתוח. בדיקות AuNP המוכנות נבדקות באמצעות קשירה אנטיגניםמקובע בארות צלחת קלקר כפי שמודגם באיור 1B. לאחר שטיפת הצלחת, חלליות AuNP מזוהות באמצעות ספקטרוסקופיית UV-Vis בעוד כתבי ראמאן הקשורים מזוהים עם ספקטרוסקופיית ראמאן. שילוב נתונים ספקטרליים UV-Vis ראמאן מספק שתי שיטות של ניתוחים, שיפור היכולות של immunoassay זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת Buffers
- פוספט שנאגר מלוח (PBS)
- לדלל 50 מ"ל של 10x PBS עם 450 מ"ל מים כיתה HPLC לבצע ריכוז 1x PBS. סינון סטרילי הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
- פתרון חנות בטמפרטורת החדר.
- הכנת טריס בופר + Tween 20 (TBST)
- לדלל 50 מ"ל של 10x טריס בופר (TBS) עם 450 מ"ל מים כיתה HPLC לבצע ריכוז 1x. הוסף 250 μl של Tween-20 עבור 0.05% (v / v) של Tween-20. סינון סטרילי הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
- חנות בטמפרטורת החדר.
- הכנת האדם סרום אלבומין (HSA) פתרון חסימת
- לשקול 0.45 גרם של HSA לתוך 15 מ"ל של PBS 1x מסונן סטרילי לבצע 3% w / v פתרון HSA. הפתרון וורטקס עד HSA נמס לגמרי.
- חנות פתרון HSA על 4 מעלות צלזיוס.
הערה: שור סרום אלבומין(BSA) יכול לשמש גם כפתרון חסימה.
- הכנת נוגדן PEGylated (PEG-Ab) פתרון
הערה: פתרון הנוגדן חייב להיות חופשי מחלבונים מובילים או ייצוב כגון BSA, אשר יפריעו עם תגובות נטייה ידי מתחרה על n-hydroxysulfosuccinimide (NHS) אתרי קישור. אם הנוגדן מגיע פתרון טריס או חיץ גליצין, הוא חייב לעבור חילופי חיץ כדי למנוע אמינים או מלחי אמוניום מלהפריע תגובת נטיית NHS. אם הנוגדן הוא בצורה lyophilized, זה יכול להיות resuspended פי המלצת היצרן בריכוז של 1-10 מ"ג / מ"ל.- עבור נוגדנים חיץ טריס או גליצין, לבצע חילופי חיץ סודיום ביקרבונט 100 מ"מ באמצעות טור desalting. השתמש חיץ 100 מ"מ להעלות את ה- pH ל 8.5 כ לזרז את התגובה נטיה.
- סודה אורתו-pyridyl דיסולפיד-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) עם 100 מ"מ שלביקרבונט הגנות לנפח של 1 מ"ל בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל או יותר.
הערה: OPSS-PEG-NHS צריכה להיעשות טרי בשימוש בתוך כ -20 דקות. קבוצת NHS על יש OPSS-PEG-NHS זמן מחצית חיים של כ 20 דקות בתמיסה מימית ב- pH 8.5. - להוסיף OPSS-PEG-NHS לפתרון נוגדן בבית 2: 1 יחס (PEG: נוגדן) יחס נטיה לשמש דגימות הבדיקה. בתוך צינור microcentrifuge נפרד, להוסיף OPSS-PEG-NHS לפתרון אנטיגן בבית 2: יחס נטיה 1 לשמש עבור שליטה.
ההערה: 2: יחס 1 בהנחה יעילה נטיית 50%. המטרה היא לתייג כל נוגדן עם שרשרת PEG אחד. בשלב זה, על-תיוג עדיף תחת התיוג. השתמש המשוואה הבאה כדי לקבוע את הכמויות המתאימות של פתרון OPSS-PEG-NHS נוגדנים:
כאשר V הוא נפח, C הוא ריכוז לידי ביטוי מולקולות אוtibodies לכל מיליליטר. תחתי PEG וא.ב. הם OPSS-PEG-NHS נוגדנים, בהתאמה. ההיקף הסופי צריך להיות כ 250 μl. - דגירת פתרון PEG-Ab ב 4 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות או למשך הלילה. פתרון חנות בעבודת aliquots של כ 25 μl ב -20 ° C כדי להגביל את מחזורי הפשרת ההקפאה הקפד להשתמש צינורות מחייב נמוכים.
2. כן UV-Vis / ראמאן בדיקות
- כן פתרון AuNP חשוף
- כן פתרון 2 מיליליטר של AuNPs עם בריכוז של כ 1 x 10 11 חלקיקים לכל מיליליטר.
- אם AuNPs צריך להיות מרוכז, למלא צינורות צנטריפוגות מחייב נמוכים עם 2,000 μl של מניית AuNP צנטריפוגות ב 5000 XG במשך 20 דקות או עד supernatant ברור. הסר את supernatant ידי pipetting, נזהר שלא להפריע גלולת AuNP.
- מערבבים את פתרונות AuNP הנותרים לתוך צינור אחד ולהעריך את Concentration על ידי קבלת מדידת UV-Vis והשוואת ערכים לריכוזים המכונים זה הוא קשר ליניארי.
- כן פתרון 2 מיליליטר של AuNPs עם בריכוז של כ 1 x 10 11 חלקיקים לכל מיליליטר.
- קבע את יחס תיוג כתב ראמאן המתאים
- כן פתרון עבודה של כתב ראמאן מומס מתנול. ריכוז זה יהיה תלוי הכתב בשימוש. בעבודה זו, להכין יודיד 3,3'-diethylthiatricarbocyanine (DTTC) בשעה פתרון עבודה של 200 מיקרומטר.
- בהנחת נפח סופי של 100 μl לכל היטב, להוסיף מספיק של פתרון כתב עבודה היטב כל בשורה הראשונה של צלחת 96-היטב כך כתב ראמאן ינוע בריכוזים מ -0.2 מיקרומטר עד 10 מיקרומטר. להוסיף מספיק מים HPLC כיתה היטב כל כך שהעוצמה היא 80 μl. הוסף 20 μl של AuNP היטב כל מה שהופך נפח סופי של 100 μl עבור כל טוב. דוגמא מסופקת בלוח 1.
- מדוד את UV-Vis הספקטרום מ -400 ל700 ננומטר באמצעות UV-Vis קריאת-צלחת ספקטרופוטומטר. הריכוז המתאים הוא הריכוז הגבוה ביותר עם פסגות שהוגדרו עבור ספקטרום UV-Vis. חזור על שלב 2.2.2 להגדיל ריכוזים עד יחס הריכוז הגבוה ביותר של כתבי ראמאן כדי AuNPs נמצא.
הערה: הצבע ואת הצורה AuNP, גודל, והיצרן להשפיע על הריכוז המתאים. לכן, על פי הצעדים הרשומים חייבים להיות מוערכים שינו תלוי הרכיבים המשמשים. פרוטוקול זה מעורב השימוש לצבוע בעלי מטען חשמלי חיובי. ככזה, מחייב בין AuNP והכתב היה לשפר את המצב באמצעות AuNPs טעונים שלילית. הדבר נעשה באמצעות AuNPs כתרים ציטראט. עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים.
- כריכת כתב רמן PEG-Ab כדי AuNP
- כן שני 1.5 מיליליטר אצוות של AuNP וכתב ראמאן בריכוז נקבע בעבר, המאפשר כתב ראמאן להיקשר AuNPs למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- מוסיפים את הנוגדן PEGylated (PEG-Ab) אצווה אחת של הפתרון הכתב AuNP ראמאן ליצור 200: 1 יחס של נוגדנים לחלקיקים. פתרון זה יהיה עבור דגימות הבדיקה. בתוך צינור microcentrifuge נפרד, מוסיפים את אנטיגן PEGylated אל אצווה השני של פתרון הכתב AuNP ראמאן בבית 200: 1 של נוגדן לחלקיקים כדי לשמש מלאה. דגירה הפתרונות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: היחס בין נוגדנים לחלקיקים יהיה ספציפי AuNPs לצבוע משומשים צריך להיות מותאם עבור כל מקרה ומקרה. המטרה פה היא לקבל את היחס הגבוה ביותר של נוגדנים עבור בדיקות AuNP להיקשר תוך מניעת אגרגציה של החלקיקים. השתמש המשוואה הבאה כדי לקבוע את הכמויות המתאימות להוסיף יחד:
כאשר V הוא נפח, C הוא ריכוז לידי ביטוי חלקיקים או נוגדנים לכל מיליליטר. הסנפירנפח אל צריך להיות כ 1.5 מ"ל.
- בלוק הנותרים אתרים על פני השטח AuNP עם MPEG-SH.
- כן MPEG-SH ידי המסת תיאול פוליאתילן גליקול methoxy המוצקה לריכוז 200 מיקרומטר באמצעות מים. הפתרון וורטקס עד-SH MPEG נמס לגמרי.
- להוסיף MPEG-SH בכל 40,000: 1 יחס לפתרון AuNP-PEG-Ab עשה צעד 2.3. דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות על מנת להבטיח את האתרים הנותרים על ננו-חלקיקים מזהב חסומות. השתמש המשוואה הבאה כדי לקבוע את הכמויות המתאימות להוסיף יחד:
כאשר V הוא נפח, C הוא ריכוז לידי ביטוי חלקיקים או נוגדנים לכל מיליליטר. ההיקף הסופי צריך להיות כ 1.5 מיליליטר.
- שחזור בדיקות ראמאן פונקציונליות.
- חלקיקים צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 20 דקות ב ג לאגד נמוךצינורות entrifuge או עד supernatant ברור. הסר את supernatant ידי pipetting נזהר שלא להפריע את AuNPs.
- Resuspend חלקיקים עם 1 מ"ל של תמיסת 1x PBS שנעשה בעבר. להעריך את ריכוז AuNP ידי לקיחת מדידת UV-Vis של נפח קטן של הפתרון (3 μl) ולהשוות את התוצאות על מדידות של ריכוז AuNP ידוע. כוון את עוצמת הקול כך הפתרון הסופי הוא לפחות 1 x 10 11 חלקיקים לכל מיליליטר.
- פתרונות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד שהוא משמש functionalizing של הצלחת immunoassay. השתמש פתרונות בתוך שבוע.
| כרכים להוסיף של כל רכיב (מ"ל) | |||
| לריכוז סופי DTTC (מ"מ) | הפתרון עובד DTTC (200 מ"מ) | AuNP | מַיִם |
| 0.2 0.1 | 20 | 79.9 | |
| 0.6 | 0.3 | 20 | 79.7 |
| 1 | 0.5 | 20 | 79.5 |
| 2 | 1.0 | 20 | 79 |
| 5 | 2.5 | 20 | 77.5 |
| 7 | 3.5 | 20 | 76.5 |
| 10 | 5.0 | 20 | 75 |
טבלה 1. דוגמה דילול DTTC. דילולים שונים של DTTC והיקפי כלולות של המניה DTTC, פתרון ננו-חלקיקים מזהב, ומים.
3. פלייט Immunoassay כן
- לאגד אנטיגן הרצוי לצלחת immunoassay.
- הכינו מספיק אנטיגן מדולל (50 מיקרוגרם / מ"ל) כדי למלא את בארות קלקר. הפתרון וורטקס,ומייד להוסיף פתרון בארות הצלחת. אפשר האנטיגן להיקשר הצלחות במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- לשטוף אנטיגנים מאוגדים.
- הסר את פתרון אנטיגן העודף ידי השלכת פתרון לתוך מיכל אטום לסילוק ולהכות על הצלחת כנגד שולחן נייר מגבת מכוסית.
- להוסיף TBST אל הבארות לשטוף את המשטח ואז להסיר בכביסה באותו אופן כאמור. חזור על פעולה זו עוד פעמיים.
- בלוק נותר אתרי קישור על הצלחת כדי למנוע הלא ספציפי מחייב.
- להוסיף 70 μl של פתרון חסימת HSA היטב כל הצלחת דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- הסר ולשטוף את הצלחת באמצעות אותו נוהל כמו שצוין בשלב 3.2. מכסה את הצלחת ויבשה ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש נוסף.
- Functionalize צלחת immunoassay.
- להוסיף 70 μl של tהוא לחקור חלקיקים מוכנים בסעיף 2 לעמודה הראשונה של צלחת 96-היטב לדלל עמודות עוקבות באמצעות 1: דילול סדרה 2. אפשר הצלחת כדי לדגור במשך לפחות שעה 1. דוגמה כיצד להכין את צלחת immunoassay ניתנת באיור 3.
- לשטוף את הצלחת עם TBST חמש פעמים כמפורטות צעדים 3.2, מוודא להיפטר AuNPs כראוי. לאחר שטיפה של דבר, להוסיף 70 μl של 1x PBS היטב כל ומכסים חותם צלחת.
הערה: דגימות הבקרה צריכות להיות ברורות. אם הלא ספציפי מחייב התרחש, דגימות השליטה תהיינה בצבע דומה כמו דגימות הבדיקה.
- רגישות assay בדיקה על-ידי UV-Vis ו ספקטרוסקופיית ראמאן.
- עבור כל טוב, למדוד את UV-Vis הספקטרום החל 400 כדי 700 ננומטר באמצעות UV-Vis קריאת-צלחת ספקטרופוטומטר.
- באמצעות מיקרוסקופ ראמאן הפוכה, למקד את המטרה על פני השטח של הבאר כי יש חלליות AuNP. אובטיין ספקטרום ראמאן של הבאר. אסוף ספקטרום החל 1,800 -1 ס"מ עד 400 ס"מ -1. חזור על שלב זה עבור כל הבארות.
- באמצעות תוכנת ספקטרלי מתאימה, לבצע תיקון בסיס פולינום -11 על מנת ספקטרום רמן פולינום כדי 3 rd עבור ספקטרום UV-Vis.
- באמצעות תוכנת ספקטרלי מתאימה, לנרמל את רמן UV-Vis ספקטרום. הגדר את הערך המקסימאלי ל 1 ו לדרג את כל הערכים האחרים בהתאם. כדי לנרמל את ספקטרום ראמאן, בחר לשיא קלקר ייחודי ולהגדיר אותו שווה ל 1 ו לדרג את כל הערכים האחרים בהתאם.
- באמצעות תוכנת ספקטרלי מתאימה, לבצע אינטגרצית שיא עבור כל ספקטרום. עבור ספקטרום ראמאן, השיא המייצג את כתב ראמאן חייב להיות נעדר באזור של פסגות קלקר. כדי לבצע אינטגרצית שיא, לציין את הגבולות הנפרדים עבור השיא הרצוי ולהקליט את אזור השיא הרצוי עבור כל הדגימות כולל הבקרות.
- Plהכבושים על אזור השיא הממוצע של ריבית כפונקציה של היומן של ריכוז AuNP עם סרגלי שגיאות עבור כל נקודה המציינת סטיית ההתקן הקשורה אליו. התאם נקודות כיול אלה עקומים לוגיסטיים 4-פרמטר.
- לקבוע את הערך הממוצע של ריק על ידי ממוצעים באזור השיא של ריבית מדגם ריק. קבע את סטיית התקן של התחומים הללו, זה הוא סטיית התקן של ריק.
- מאותה השיא ניתח בשלב הקודם, למצוא את סטיית התקן של אזור השיא של הריכוז הנמוך ביותר.
- חשב את הגבול של הגבול ריק והתחתון של זיהוי כמפורט בסעיף נציג התוצאות. השתמש בערכים אלה עם עקומות כיול 4PL לקבוע את LLOD מבחינת ריכוז AuNP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה, 60 חלקיקי זהב ננומטר שימשו ספקטרוסקופיה UV-Vis. UV-Vis ספקטרום קליטה מן 400 כדי 700 ננומטר נאספו אזורי השיא עבור כל ריכוז AuNP נקבע באמצעות תוכנת ניתוח ספקטרלי קוד פתוח 8. לפני לשיא אינטגרציה, ספקטרה שנאספה עברה תיקון בסיס באמצעות התאמה פולינום שלוש נקודות. באזורי שיא שמשו כדי ליצור עקומת כיול לוגריתמים כפי שמודגם באיור 4. יצוין כי איורים 4 ו -5 משולב עקומות כיול לוגריתמים. השימוש עקום כיול שאינו ליניארי יכול להרחיב את הטווח הדינמי משמעותי של assay הפך מקובל עבור immunoassays השונה הדורש יכול זיהוי בטווח נמוך 9,10.
כדי להעריך את הרגישות כמותית של assay, המגבלה של ריק (LOB) והגבול התחתון של זיהוי (LLOD) חושב כדלקמן 
סטייה שבו התקן של ריק ושל ריכוז המדגם הנמוך ביותר היא σ בלנק σ נמוך, בהתאמה, בעוד 
הוא הערך הממוצע של 11,12 הריק. לפי הגדרות אלה, כמו גם את עקומת כיול לוגיסטי 4-פרמטר שנוצרה, LLOD עבור UV-Vis היה 3.5 ראש ממשלת חלקיקי זהב.
באמצעות התקנה ספקטרוסקופיית ראמאן כמפורט לעיל 7, מיקרוסקופ ראמאן הפוך 785 ננומטר שימש לאיסוף ספקטרום מן הכתב DTTC ראמאן הקשורים צלחת immunoassay פונקציונליות. פרמטרים הפעלה כללו כוח לייזר 7 mW ו ac 10 שניותזמן quisition. ספקטרה עברה תיקון בסיס (11 th פולינום הסדר) ואינטגרצית שיא. איור 5 מראה את עקומת הכיול לוגיסטי 4-פרמטר שנוצרה על אזורי שיא DTTC עבור 493 הסנטימטר -1 ו 508 סנטימטר -1 פסגות DTTC. ככל הריכוז המדויק של כתב ראמאן כבול אל פני שטח AuNP היה ידוע, עקומת הכיול התבססה על ריכוז AuNP. באמצעות משוואות שתוארו לעיל, LLOD נקבע לעמוד על 1.7 ראש ממשלת AuNP.
איור 1. איור של ניתוח immunoassay ישיר ועקיף. איור של (א) העקיף וישירות (B) תוכניות גילוי immunoassays. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Nanoparticle ייצור בדיקת המחשה. תהליך של functionalizing ראמאן / UV-Vis בדיקות עבור immunoassays. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. צלחת immunoassay מוכנה. תמונה של צלחת immunoassay מוכנה. שורות A עד E הן דוגמאות בדיקות תוך שורות F דרך H הן דגימות בקרה. טור 1 מכיל חלקיקים העמוקים וחסר כל עמודה עוקבת יש חצי הריכוזשל בדיקות AuNP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. עקומת כיול-Vis UV עבור immunoassay באמצעות בדיקות ננו-חלקיקים. עקומת כיול לוגריתמים עבור אזורי השיא-Vis UV ריכוז ננו-חלקיקים. השורה המצוידת עקומה 4-פרמטר לוגיסטי (4PL). ברי שגיאה לציין את אזור שיא סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. ראמאן עקום כיול עבור בדיקות ננו-חלקיקים באמצעות immunoassay. עקומת כיול התאמת ראמאן כתב אזור שיא ריכוז ננו-חלקיקים מהזהב. השורה המצוידת עקומה 4-פרמטר לוגיסטי (4PL). ברי שגיאה לציין את אזור שיא סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול המפורט, ישנם מספר נקודות קריטיות לכתובת. נושא אחד הוא הבחירה של כתב רמן ננו-חלקיקים מזהב. אף על פי הפרוטוקול נכתב כדי להיות מותאם לשימוש אישי, כתב ראמאן DTTC שמש כדוגמא. DTTC הוא כתב מטען חשמלי חיובי ונקשר טיעונים שליליים משטחים כגון AuNPs כתרי ציטראט. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור כתבים טעונים שלילי באמצעות חלקיקי זהב עם מטען משטח חיובי. לדוגמה, polyethyleneimine (PEI) כתרים AuNPs לספק מטען משטח חיובי וטוב יותר מחייב עם כתבים-טעונים שלילית.
שמירה על האיזון בין חלבוני חלקיקים היא שלב קריטי של פרוטוקול זה. איזון זה נעשה על ידי הוספת נוגדני PEGylated ב נוגדן מותאם יחס ננו-חלקיקי זהב של 200: 1. אם נוגדני PEGylated מתווספים פתרון ננו-חלקיקי זהב לפי יחס גבוה משמעותי תיים, אגרגציה הנגרמת יון עלולה להתרחש. לחלופין קטן מדי של יחס, חלבון צבירת insolubility יתרחש. יחס זה חייב להיקבע בכל מקרה ומקרה.
עוד צעד פרוטוקול קריטי הוא הנטייה של OPSS-PEG-NHS כדי הנוגדן. צעד זה קדמו השעיית OPSS-PEG-NHS ב סודיום ביקרבונט בהם הקבוצה NHS נקשר הנוגדן. צעד נטיה זו מתחרה עם התגובה הידרוליזה שלילי כמפורט לעיל 7. התגובה הידרוליזה היא צפויה לקרות לאורך זמן, וככזה, את OPSS-PEG-NHS כדי נוגדן מחייב צריכה להתבצע באופן מיידי.
התוצר הסופי של פרוטוקול הוא immunoassay אשר יכול להיבדק על הרגישות על ידי בנייה של עקומת כיול באמצעות UV-Vis ו ספקטרוסקופיית ראמאן. תוצאות המחקר מראות כי immunoassay ניתן להשוות bioassays אחרים 17 - 13 אשר יש לתחום הגילוי of 1 PM. לא רק את רגישות immunoassay ראמאן התחרותית עם bioassays אחר, יש לו את הפוטנציאל עבור רגישות משופרת באמצעות משופרת משטח ספקטרוסקופיית ראמאן (SERS). SERS משלבת את השימוש בננו-חלקיקי זהב או משטח זהב מחוספס כדי לשפר את פליטת ראמאן. כמו פרוטוקול זה כבר כולל את השימוש של בדיקות זהב-חלקיקים, הוא גם מתאים לפיתוח לתוך immunoassay SERS. בעתיד, טכניקה זו יכולה לשמש לפיתוח של immunoassay פיזור אור שיכול לשמש כדי לזהות analytes חלבון רב בו זמנית. כפי פרופיל סמן ביולוגי הופך להיות חשוב יותר ויותר עבור באבחון והטיפול של מגוון רחב של מחלות, טכניקה זו עשויה להיות יישומים קליניים עמוקים.
בעיות נפוצות הקשורות פרוטוקול זה כוללות צבירה של ננו-חלקיקי זהב, מספיק מחייב של חסימת חלבונים, מחייב של חלבונים שאינם ספציפיים, ואת אות ראמאן חלשה. בעיות אלה מפורט בטבלה 2 יחד עם הגורם האפשרי צעדי הבעיה ופעולה לתת מענה לכל בעיה. בעיות אחרות יכולות להתעורר עקב מגבלות של הפרוטוקול. ראשית, פרוטוקול זה מוגבל לריכוזים AuNP עד 5 x 10 12 חלקיקים / מ"ל כמו ריכוזים גבוהים יותר נוטים לגרום צבירה. הטכניקה מתבססת על יציבה, חלקיקים לא מצטברים עבור להערכה הריכוזית ננו-החלקיקים. אם יש צבירה, להערכת ריכוז ננו-חלקיקים תהיה מוטה. הפרוטוקול מוגבל גם לכתבים ראמאן עם פסגות חזקות מספיק כדי להתגבר על רקע פוליסטירן ייחודי ושונה קלקר. לבסוף, השימוש 96-גם צלחות מסורתיות להגביל את הפרוטוקול שבו צריך להשתמש של מיקרוסקופ ראמאן הפוך בשל הגובה של הצלחות. אחרת, בהגדלה נמוכה חייבת לשמש מטרת מיקרוסקופ ראמאן כדי להתאים את גובה צלחת 96-היטב.
| סימפטום | סיבה סבירה | פעולה מתקנת |
| חלקיקי זהב לצבור לאחר צנטריפוגה ו resuspension. | ריכוז כתב ראמאן הוא גבוה מדי. | בחן מגוון של ריכוזי הכתב ראמאן כמפורט בסעיף 2.2 או בפרוטוקול זה. |
| נוגדן יחס AuNP הוא גבוה מדי. | צמצם את מספר נוגדני PEGylated כבול אל פני שטח ננו-החלקיקים כדי להגביר את יציבות חלקיקים. | |
| סוכן החסימה MPEG-SH אינו מחייב אל פני שטח AuNP. | כן פתרון MPEG-SH טרי לפני חסימת ננו-חלקיקים. | |
| שאינו ספציפי מחייב את פני צלחת immunoassay | צלחת immunoassay חסומה מספיק. | כן פתרון לחסימה טרי לפני צלחת כיףctionalization. |
| המשקל המולקולרי של MPEG-SH אינו גדול מספיק. | ודא כי מולקולת MPEG-SH המשמשת חסימה יש משקל מולקולרי של 5,000 kDa או יותר. | |
| אות ראמאן חלשה או נעדרה | כתב ראמאן אינו מחייב את פני חלקיקים. | ודא כתב ראמאן מותר לקשור לפחות 30 דקות לפני תוספת של נוגדן PEGylated. |
| המשקל המולקולרי של MPEG-SH אינו גדול מספיק. | ודא כי ננו-חלקיקי מכסת סוכן יש את המטען המתאים לכריכת הכתב היוני ראמאן. |
טבלה 2. פתרון בעיות עבור בעיות נפוצות. רשימה של בעיות נפוצות נתקלו במהלך הפרוטוקול עם הגורמים הקשורים ופריטי פעולה מתקנים.
בכתב היד הזה, והצגנו aprotocol עבור המצאה אישית של immunoassay מבוסס ננו-חלקיקים-בדיקה לניתוח באמצעות ספקטרוסקופיית UV-Vis / ראמאן. הפרוטוקול כולל functionalization של ננו-חלקיקי זהב עם כתבי רמן אימונוגלובולינים לגילוי ישיר של אנטיגנים חייב צלחת קלקר. הפרוטוקול ניתן להתאים כדי להתאים עיתונאי ראמאן מסוים גל העירור קשור. צורת וגודל ננו-חלקיקי זהב ניתן לשנות גם. עם זאת, יחסי פתרון מתאים המחייבים ישתנה בהתאם לכתב ראמאן משמש גם את גודל ננו-חלקיקים, צורה, ויצרן. הפרוטוקול נכתב כדי לסמן חוקרים כאשר יחסי פתרון צריכים להיקבע לכל הסדר ייחודי ובכך לאפשר המצאה אישית על פי צרכי מחקר. בניגוד פרוטוקולי immunoassay ניאון / colorimetric הטיפוסי, פרוטוקול זה הוא בעל הפוטנציאל עבור יכולות ריבוב יותר תוך ניצול תשתית קיימת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10x) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 ml | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 ml | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 | |
| In-house built 785 nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/ (2004).
- ELISA development guide. , [Accessed: 28-Mar-2016] https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.effemm2.de/spekwin/ (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
