Abstract
炎症は、癌の発生やプロモーション、および転移に最終的に進行の基礎となるがん特徴です。したがって、標準的な癌連隊に抗炎症薬を追加して患者の転帰を改善することができます。そのような薬物、アスピリン（アセチルサリチル酸、ASA）は、癌の化学予防及び抗腫瘍活性のために検討されています。シクロオキシゲナーゼ2 - プロスタグランジン軸を阻害することに加えて、ASAの抗癌活性はまた、核因子ĸB（NFĸB）阻害に起因しています。長時間ASAの使用は、胃腸毒性を引き起こす可能性があるため、プロドラッグ戦略が成功裏に実施されています。このプロドラッグでは、ASAのカルボン酸はマスクされ、追加のファーマコフォアが組み込まれているデザイン。
このプロトコルは、我々はアスピリン - フマル酸プロドラッグ、GTCpFEを合成し、乳癌細胞とがん幹様適切なの減衰にNFĸB経路の阻害を特徴とする方法を説明しますネクタイ、重要なNFĸB依存表現型。 ASAは、ASA構造にフマル酸を添加すると有意にその活性に寄与することを示す、任意の阻害活性を欠いているのに対し、GTCpFEを効果乳癌細胞株においてNFĸB経路を阻害します。免疫表現-また、GTCpFEはマンモスフェアの形成を阻止し、がん幹細胞関連CD44 + CD24を減衰させることにより、有意な抗がん幹細胞の活性を示します。これらの結果は、化学的予防及び癌治療のための改良された抗炎症薬を開発するための実行可能な戦略を確立します。
Introduction
炎症は、転移1への入射とプロモーション、そして最終的に進行などの腫瘍形成の複数の側面を、基礎となる特徴です。乳癌では、これは、さらに古典的な非ステロイド系抗炎症薬、アスピリン（アセチルサリチル酸、ASA）の定期的な使用は、両方の乳癌発生率の低下、および転移および再発のリスクと関連していることを示す疫学的観察によって支持されます2,3。 ASAは、主に、多くの場合、乳癌4,5においてアップレギュレートされるシクロオキシゲナーゼ-2活性を阻害することによって作用します。しかし、ASAの抗癌効果はまた、異常な核因子κB（NFκB）6-8シグナリングを抑制することによって媒介され得ます。無秩序なNFκB経路は、腫瘍細胞の生存、増殖、遊走、浸潤、血管形成、および治療9-11に対する抵抗性を促進するので、これは重要です。 NFκB経路の活性化はまた、取り付けのために重要です免疫応答。したがって、長期のNFκB阻害が必要とされる抗癌治療のために、一方が長く持続する免疫抑制が関与する有害な副作用を考慮しなければなりません。そのため、ASAは、治療最適化のための良い出発点として働くことができます。
癌治療におけるASAのアプリケーションのための1つの制限は、このような潰瘍、胃が12,13の出血として、胃腸毒性と関連しているシクロオキシゲナーゼ2およびNFκB阻害に必要な上昇用量です。しかし、エステルプロドラッグにASAを変換する、ASAの胃腸毒性を低減することができます。さらに効力を増強する、および/または機能を追加するために、追加の構成要素または補助的なファルマコフォアはまた、エステルプロドラッグの設計に組み込むことができます。そのようなファーマコフォアは、NFκB経路に対するASAの効力を増強するために加え、我々は以前にNFκB経路阻害14,15のために重要であることが示されたフマル酸です。
15、GTCpFEを合成し、このようなハイブリッド分子はまだNFκB経路に対する強力な安全であろうという仮説を立てました。我々は、乳癌細胞におけるその抗NFκB活性およびNFκBの生存および増殖16-21ためのシグナリングに依存乳癌幹細胞（CSCを）15をブロックする能力を試験しました。私たちは、NFκB経路に対するGTCpFEの効力が大幅ASA 15に改善されていることがわかります。また、GTCpFEブロックマンモスフェア形成およびCSC表面マーカーCD44 + CD24減衰- GTCpFEはのCSC 15を根絶することが可能であることを示す、免疫表現を。また、これらの結果は、乳房のCSCを標的とすることができる有効な抗炎症薬としてアスピリン - フマル酸プロドラッグを確立します。乳癌治療の観点から、GTCpFEはアグレッシブと致命的な疾患を治療する可能性を有していてもよいです。
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Protocol
アスピリンフマル酸塩プロドラッグGTCpFEの1の合成
- プラスチックプランジャーシリンジを用いて、丸底フラスコ（10ml）中のメタノール0.81ミリリットル（20ミリモル）を測定し、水に混ぜます。氷水浴中でフラスコを配置することによって0℃まで得られた混合物を冷却します。 4-ヒドロキシベンジルアルコール（2.48ミリグラム、20ミリモル）を加え、溶液が透明になるまで、反応混合物を攪拌します。
- Oの -acetylsalicyloyl塩化所望の量を計量し、別のフラスコに、溶媒に溶解させて無水トルエン（10ml）中のO -acetylsalicyloylクロリド（3.77ミリグラム、19ミリモル）を準備します。プラスチック製プランジャー注射器を使用して、ステップ1.1で調製した混合物にこのソリューションを追加し、0℃で攪拌しながら反応を残します。
- 薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いて反応をモニターします。 TLCプレートは、固定相としてシリカを持っている必要があります。
- 20:80酢酸エチル（AcOEtを）/ヘキサンから成る移動相を準備します。 TLC室で（または小容器）チャンバの底部をカバーするために、移動相の5ミリリットルを追加します。
注：移動相の量は、選択された室に依存します。常に底をカバーするのに十分な追加が、TLCが内側に配置された後、溶剤ラインは化合物がスポットされる高さを超えてはなりません。 - 、シリンジ（0.2ミリリットル）との反応のサンプルを取り、小さなバイアルに置き、そして酢酸エチル（2-3滴）でそれを希釈します。 TLCスポッターで、慎重に希釈した反応混合物のサンプルを取り、TLCでそれを見つけます。
注：スポット1-2 mmであるべきであり、これはTLCプレートの下1/4インチで行われるべきです。 - 同じTLC上で、比較としてO-アセチルサリチロイルクロリド（酢酸エチル0.5ミリリットル中0.2ミリグラム）の溶液のスポットを配置します。スポットが乾燥したら、室内に置き、溶媒フロントがほぼTLCの上部に到達するまで、それが実行してみましょう。
- TLCを取り出し、それを乾燥させ、およびUVランプの下でそれを可視化します。 REACO -acetylsalicyloyl塩化スポットが反応混合物から消えたときションは完了です。
- 反応が完了したら、氷 - 水浴を取り外し、反応物を20時間室温で攪拌することを可能にします。
- 20:80酢酸エチル（AcOEtを）/ヘキサンから成る移動相を準備します。 TLC室で（または小容器）チャンバの底部をカバーするために、移動相の5ミリリットルを追加します。
- メディア多孔性のフリットディスクでブフナー漏斗を用いて沈殿物をフィルタリングします。シンチレーションバイアルに固体を配置し、室温でデシケーター中で一晩真空中で化合物を残します。乾燥剤として五酸化リン（P 2 O 5）を使用します 。
- この反応を設定する前に少なくとも2日間、80℃のオーブンの中に置くことによって丸底フラスコを乾燥させます。代替的に、セプタムでフラスコを密閉し、真空ポンプシステムに接続された針とそれを貫きます。上の真空ポンプの電源を入れ、ヒートガンを用いてフラスコを乾燥させます。 2回以上を冷却し、この手順を繰り返すことができます。
- アルゴンガスを用いてバルーンを膨張させる、及び（そのプランジャHプラスチックシリンジに接続針で）削除されました。真空ポンプの電源をオフにして、今で乾燥した丸底フラスコに挿入した、それに接続された針を取り除きます。丸底フラスコを密封する隔壁を通してアルゴンバルーンに接続された針を挿入します。
- 5（無水テトラヒドロフラン中にそれらを溶解し、その後、別のフラスコに2- acetyloxybenzoic酸（100 mgを、0.349ミリモル）、4-ジメチルアミノピリジン（4 mgを、0.033ミリモル）及びトリエチルアミン（53 mgを、0.523ミリモル）の4-ヒドロキシメチルフェノールエステルを追加ミリリットル）。針に取り付けられたプラスチック製のシリンジで、密封された丸底フラスコに、このソリューションを追加します。氷水浴にフラスコを置くことによって0℃まで混合物を冷却します。
- 前の混合物に、無水テトラヒドロフラン（5ml）中のエチルフマロイルクロリド（68 mgを、0.419ミリモル）の溶液を加え、滴下10分かけ。 2-4時間、0-5℃で得られた溶液を撹拌しました。
- 酢酸エチル（100ml）及びブライン（50ml）で反応混合物を抽出します。<BR />注：塩水は、塩化ナトリウム（NaCl）の飽和溶液です。それを製造するために、それはもはや溶解しなくなるまで（撹拌しながら）のNaClの追加を開始し、その後清浄なガラス容器に水200mlを配置します。
- 抽出後、水相を除去し、後者のステップをさらに2回繰り返します。
- ガラス製品を攪拌する際に固体が最大凝集しなくなるまで、有機相を硫酸ナトリウムを添加することにより混合物を乾燥させます。フリットディスクと別のブフナー漏斗を使用して、硫酸ナトリウムを除去するために、丸底フラスコに混合物を濾過し、40℃に設定された温度でロータリーエバポレーターを用いて乾燥するまで蒸発させます。
- TLCを使用して、カラムクロマトグラフィーで使用するための適切な移動相を決定します。
注記：この実験では、20：80のAcOEt /ヘキサンの勾配を使用しました。 - シリカゲルおよび適切な溶媒相でカラムを準備します。化合物が添加された後、PR硫酸ナトリウム（または砂）の層を追加otect溶媒としてのカラムが追加されます。
- 列を実行すると、TLCにより溶出液を監視します。それらはカラムから収集される他のすべての試験チューブを見つけます。目的の生成物が溶出する場合には、大きな丸底フラスコに純粋な生成物を含有する全てのサンプルを混合し、40℃に設定した浴温でロータリーエバポレーターを使用して乾燥させます。
注：製品が、白色固体として表示されます。
- 列を実行すると、TLCにより溶出液を監視します。それらはカラムから収集される他のすべての試験チューブを見つけます。目的の生成物が溶出する場合には、大きな丸底フラスコに純粋な生成物を含有する全てのサンプルを混合し、40℃に設定した浴温でロータリーエバポレーターを使用して乾燥させます。
- GTCpFEの構造を確認するために、（それぞれ、1 H及び13 C）を製造者の指示に従って、核磁気共鳴（NMR）スペクトルを、プロトン及び炭素を集めます。
注：この研究では400MHz FT NMR分光計は、1 H及び13 Cスペクトルを収集するために使用されました。十分なデータ分解能を得るために、室温で少なくとも25のスキャンを実行します。観察されたNMRピークは、以下の、1 H NMR（CDCl 3中）であった：1.29（T、3 H、J = 7.0 Hzで、CH 3）、δ。 2.31（S、3 H、CH 3）。 4.26（Q、2 H、J = 7.0 Hzの、COOCH 2）。 5.25（S、2 H、OCH 2）。 6.89（S、2 H、HC = CH）。 7.19（メートル、3 H、AR）。 7.42（M、3 H、AR）。 7.65（メートル、1 H、AR）。 8.22（ddの、1 H、J = 7.8、4 J = 1.2 Hzのは、Ar）。 13 C NMR（CDCl 3中）δ：169.70、164.86、164.75、162.89、151.28、150.69、134.76、134.32、133.26、133.16、132.25、129.81、126.26、124.11、122.47、122.04、66.40、61.43、21.05、14.15。 - 加えて、製造業者の説明書に従って、正確な質量測定のためのイオントラップと時間の飛行技術（LCMS-IT-TOF）と組み合わせて、液体クロマトグラフィー質量分析法を用いた高分解能質量スペクトルを収集します。
注：この研究では（M + NH 4 +）計算値：430.1496を。観察：430.1477。
2. GTCPFEは、乳癌細胞においてNFĸB活性を阻害します
- 細胞培養条件
- 、スタンダードセルCULに従って、MCF-7及びMDA-MB-231ヒト乳癌細胞株を維持しますチャ技術および5％CO 2、37℃の加湿インキュベーター中で伝播します。
- 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したフェノールレッド、1％非必須アミノ酸、2mMのL-グルタミン、1％抗生物質ペニシリン - ストレプトマイシンでロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地からのMCF-7細胞の培地を調製、および6 ngの/ mlのインスリン。 5％FBS、1％非必須アミノ酸、2mMのL-グルタミン、および1％抗生物質ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した改良最小必須培地（IMEM）からのMDA-MB-231細胞培地を準備します。
- 、スタンダードセルCULに従って、MCF-7及びMDA-MB-231ヒト乳癌細胞株を維持しますチャ技術および5％CO 2、37℃の加湿インキュベーター中で伝播します。
- NFκB-REルシフェラーゼレポーターアッセイ
- 37℃で5分間、0.25％トリプシンを用いてトリプシン処理、乳癌MCF-7細胞は、手動でウェル密度当たり90,000細胞で24ウェルプレートに血球計およびシードを用いて数えます。
- NFκB応答エレメント（NFκB-RE）ルシフェラーゼ構築物、1μgのプラスミドDNAと次の日、同時トランスフェクト細胞/ウェル、アルプロモーターのウミシイタケルシフェラーゼ構築物でオング、0.2μgの/ウェル。三重の各処置群についてトランスフェクションを実行します。
- PBSで2回細胞を洗浄し、プラスミドDNAの混合物および無血清培地でのトランスフェクション試薬（ 例えばリポフェクタミン）のウェルあたり1μlのインキュベート。 6時間後、（抗生物質ペニシリンおよびストレプトマイシンを含まない）、通常の培地1mlに培地を変更します。
- 16時間後、各ウェルに車両やGTCpFEの異なる原液またはASA薬の1μlを添加します。 1,000倍の濃度でジメチルスルホキシド中の薬物のストック溶液（100、50、20、10及び1mM）を溶解します。薬を追加した後、37℃で2時間、細胞をインキュベートします。
- NFκB経路を活性化するために、10 ngの/ mlの最終濃度のために各ウェルに炎症性サイトカインTNFα（10 / mlのストック溶液）を追加し、4時間インキュベートします。 TNFα単独のコントロールを含めます。培地を吸引し、細胞を保存します-80℃での。
- 製造業者の説明書に従って、ルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを使用して、ルシフェラーゼを測定します。
注：最初に、ルシフェラーゼアッセイシステム（ 例えば、二重ルシフェラーゼアッセイシステム）を使用する場合、緩衝液10ml中に再懸濁し、1mlのアリコートで-80℃でそれを保存することにより、ルシフェラーゼアッセイ試薬の溶液を調製します。- 水で5倍ストック緩衝を希釈することによって1×溶解バッファーを準備します。各ウェル用い、100μlの1×溶解緩衝液中の溶解細胞。中速で、15分間、オービタルシェーカー上でプレートをインキュベートします。
- サンプルあたり1 1.5ミリリットルのチューブにラベルを付けます。室温（サンプルあたり50μlのが必要になります）に、ルシフェラーゼアッセイ試薬を解凍し、ホイルに保ちます。ガラスバイアルに1×消光試薬を準備し、バッファーとボルテックスで1：49希釈はそれ（サンプルあたり50μlのが必要になります）。
- ラベルされたマイクロ遠心チューブに細胞溶解液の10μLを加えます。そしてルシフェラーゼアッセイ試薬50μlのを追加し、優しく渦。直後、ホルダーにチューブを配置し、ルミノメーターでのデュアルルシフェラーゼプログラムを経由して発光を測定します。次の項目を選択し、キーを押します。ファイル名を指定して実行プロメガプロトコル→デュアルグロ→OK。
- 試験管に消光試薬を50μl加え、穏やかにボルテックス。ルミネセンスを測定します。各サンプルについて、上記の手順を繰り返します。
- ウミシイタケ内部統制（NFκB-RE /ウミシイタケ）にNFκB-REを正規化することにより、スプレッドシートを使用してデータを分析します。 TNFαのみのコントロールに対する阻害剤のデータを（TNFαのみを100％に設定されている）と比較してください。
- NFκB-標的遺伝子の転写
- 種子MCF-7セクション2.1に記載されるように調製2ミリリットルの培地容量でウェルあたり250,000細胞で6ウェルプレート中の細胞。
- 次の日は、前に別の2時間TNFαを10ng / mlに添加する2時間ごとに異なるGTCpFE 1,000倍の株式（100、50、20、10および1mM）の2μlを添加します。すべての処置を実行します。三重インチ車両およびTNFα単独のコントロールが含まれます。
- メーカー22の指示に従って、チオシアン酸グアニジニウム-フェノール-クロロホルム抽出法を用いてRNAを単離します。 RNA濃度（ジエチル中（DEPC）処理水）と分光光度計を用いてRNAの純度を決定します。 -80℃で氷や店舗のRNAサンプルを保管してください。 RNAを取り扱うときのみRNaseフリーの障壁のヒントを参考にしてください。
- モロニーマウス白血病ウイルス（M-MLV）逆転写酵素の市販のキットを用いて、0.5μgの全RNAを逆転写。
注：このキットは5倍が一緒のdNTP混合物、およびランダムヘキサマーの混合物と、バッファおよびジチオスレイトール（DTT）が含まれています。- M-MLVの200単位、0.5 mMのdNTPを、最終的な10μlの反応容量にランダムヘキサマー100ngの、10mMのDTT、バッファー（1x）及びDEPC水にRNA0.5μgのを追加します。 37℃で50分間、PCRサイクラーを用いて逆転写反応を行い、その後15分間70 AT＆＃176; Cは、熱不活性化する酵素を。
- 二重蒸留水100μlに得られたcDNA産物を希釈し、各後続の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）反応のために2μLを使用します。
- 前方に混合し、1.25μMの濃度ごとに目的の遺伝子のためのリバースプライマー。二本鎖DNAの検出を可能にするために、1.25μMプライマーミックスと染料の2倍の5μlに1μlを、2μlの二重蒸留水でマスターミックスを調製します。 96ウェルPCRプレートにcDNAを2μlのとマスターミックスの8μLをロードします。
- 製造業者の説明書に従ってリアルタイムPCRシステム（40サイクル、95から60°C）を用いた定量的PCRを実施し、データを手動で分析します。
注：検証され、以前に23に報告されている使用されるすべてのPCRプライマー。 - リボソームタンパク質36と、ΔΔCT法を経由して、スプレッドシートを用いた遺伝子発現の変化倍率を計算します内部統制23としてB4のmRNA。
3. GTCpFEは、 インビトロで乳癌幹細胞を阻害します
- マンモスフェア形成アッセイ
- ダルベッコ改変イーグル培地を補充することによってマンモスフェア（MS）培地を調製：1％メチルセルロースを栄養混合物F-12（DMEM / F12）フェノールレッドを含まない培地。 4℃で一晩穏やかに振盪することによって溶解させます。フィルタ媒体を殺菌し、B27 1X、1％のペニシリンおよびストレプトマイシン、5μg/ mlのインスリン、を1μg/ mlのヒドロコルチゾン、および20 ng / mlの組換えヒト上皮増殖因子で補充します。
- 単層培養物（37℃で5分間0.25％トリプシン）トリプシン消化によりMDA-MB-231細胞株の単一細胞を調製し、メッシュの篩を通して濾過します。手動で400細胞/ウェルの密度で96ウェル超低接着プレートに単一の分離した細胞とプレートを数えます。翌日、GTCpの異なる濃度を追加FE（ 例えば 、最終GTCpFE濃度：1、10、20、50μM）最終容量は100μlです。三重のすべての処理を行います。
- インキュベーター内で培養の7日後に、倒立顕微鏡を用いて画像化ソフトウェアを介して画像を取得します。手動で直径が数MS> 75ミクロンを数えます。車両制御に薬物治療を比較してください。
注：MS> 75ミクロンの直径を画像化ソフトウェアを用いて決定されます。
- CD44 + CD24 - CSC免疫表現
- 37℃で5分間、0.25％トリプシンを用いてMDA-MB-231細胞をトリプシン処理。 2.1節で説明したように10ミリリットル培地中で皿あたり3万個の細胞で10cmの皿の中血球計数器とシードを使用してカウントします。 72時間細胞への車両（10μlのジメチルスルホキシド）またはGTCpFE（50 mMストックを10μl）を追加します。
- 車両またはGTCpFE処置グループの場合、トリプシン処理（ステップ3.2.1のように）細胞とは、Test＆＃ 'で100万個の細胞を分配します39;または1xハンクス平衡塩溶液（HBSS）2 mlを含む「コントロール5 'mlのポリスチレンチューブを、2％FBSを補充した緩衝液。
- 表面マーカーCD44とCD24、スピンダウン細胞を染色し、最終的に100μlの全体的なボリュームのチューブをテストするために20の各結合抗体μlのHBSS + 2％FBSを追加するには（1：5希釈）。チューブを制御するためにHBSS + 2％FBS100μlのを追加します。 CD44-APC結合抗体とCD24-PE抗体単一染色コントロールまたはIgGのimmunoisotypeコントロールを含めます。
- 30分間4℃で暗所で細胞をインキュベートします。 400×gで5分間、細胞をスピンダウンし、2％FBSを200μlのHBSS緩衝液に再構成します。暗所で氷上で細胞を保管してください。
- 製造業者の指示に従ってFACS解析装置を用いて生きた細胞の蛍光活性化細胞選別（FACS）を行います。各チューブのために少なくとも50,000イベントを収集します。三重での治療を実行します。
注：ゲーティングは株式会社（無染色のコントロールに基づいていますntrolチューブ）、IgGのimmunoisotypes、およびCD44-APCおよびCD24-PE、単一の汚れ。 - 利用可能なフローサイトメトリーソフトウェアを使用してデータを分析します。
注：GTCpFE処理されたCD44 + CD24を有する細胞の割合（％） -免疫表現が推定され、車両制御に比較されます。
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Representative Results
図1において、化学アスピリンフマル酸プロドラッグの構造、GTCpFE、および乳癌細胞においてNFĸB経路誘導されるサイトカインに対する阻害活性が示されています。 GTCpFEは、両方NFĸBエンドポイントを阻害NFĸB-REルシフェラーゼ活性（ 図1B）、そのような細胞間接着分子1（ICAM1）、ケモカインCCモチーフリガンド2（CCL2）、および腫瘍壊死因子（TNF）などのNFĸB標的遺伝子の発現を、（ 図 MCF-7乳癌細胞における1C）。両方のエンドポイント上の50％で計算された阻害濃度（IC 50）値は〜20μmです。 IC 50値は、グラフのソフトウェアを使用して計算されます。比較ASAそれ自体であっても、200μM（GTCpFEの10倍のIC 50）で乳癌細胞における阻害活性（ 図1B、青い線）を示していません。これは、ASA significaにフマル酸ファーマコフォアを追加することのプロドラッグ戦略を示し、ntlyその抗NFĸB活性を向上させることができます。
-乳がん24で免疫表現、 善意 CSC表面マーカーマンモスフェア（MS）形成アッセイおよびCD44 + CD24を発現する細胞の集団：抗CSCの活性を測定するために、我々は2つのアッセイを使用していました。 GTCpFEは、 図2Aに示す用量依存的にMDA-MB-231乳癌細胞のMSの形成を阻害します。接着培養でNFĸB経路阻害と同様に、マンモスフェア形成のためのIC 50値は、〜20μmです。この一貫性は、CSCの生存と繁殖16-21のためのシグナリングNFĸBに依存していることを考えると、期待されています。また、GTCpFE前処理は、CD44 + CD24の著しい枯渇をもたらし- MDA-MB-231細胞における集団（ 図2B）。一緒に、これらの結果は、効果的に乳房のCSCを標的とするGTCpFEの能力を確立します。
図1：GTCpFEは乳癌細胞におけるNFĸB経路を阻害します。 （A）アスピリンフマル酸プロドラッグ、GTCpFEの化学構造。 （B - C）MCF-7細胞を、2 GTCpFE種々の濃度の時間、ASA、または車両用前処理TNFα（10ng / ml）で処理した2-4時間インキュベート。 （B）NFκB-REの活性は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにより測定しました。 （C）NFκB標的遺伝子の発現は、ICAM1、CCL2およびTNFは、RT-QPCRによって測定しました。薬物の阻害活性は、単独で、TNFαの％としてプロットします。データは、平均±SEMとして提示されています。この図は、基準15から変更されています。 このfiguの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。再。
図2： - 乳癌細胞における免疫表現 GTCpFEはマンモスフェア形成およびCD44 + CD24を 阻害 します 。 MDA-MB-231細胞の（A）マンモスフェア（MS）形成GTCpFE種々の濃度で処理した後に測定しました。 MSの成長（左）と20XでMSの代表的な写真（右）の定量化が示されています。 GTCpFEの効果は、％ビヒクル対照としてプロットされています。 （B）CD44 + CD24 -集団は、72時間50μMGTCpFEで処理されたMDA-MB-231細胞のFACS分析により決定しました。各集団の割合（左）とFACSからの代表的な散布図（右）の定量化が示されています。データは、SEMおよび2ウェイANOVA follの統計解析平均値±として提示されていますテューキーの事後テストによって負っ。 *** P <0.001。この図は、基準15から変更されています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Red Medium | Life Technologies | 11875-093 | Warm up to 37 °C before use |
| IMEM | Corning | 10-024-CV | Warm up to 37 °C before use |
| DMEM / F12 Medium | ThermoFisher | 21041-025 | Warm up to 37 °C before use |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| L-Glutamine 100x | Life Technologies | 25030-081 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Trypsin 2.5% 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| Methyl Cellulose | Sigma | M0262 | |
| B27 Supplement 50x | Gibco | 17504-044 | |
| EGF | Gibco | PHG0311L | |
| NFκB-RE Luciferase Construct | Clontech | pGL4.32 | |
| Renilla Luciferase Construct | Promega | pGL4.70 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668-019 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay | Promega | 120000032 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Eppendorf Mastercycler | Eppendorf | ||
| StepOne Real Time PCR System | Thermo Scientific | ||
| Eclipse Microscope | Nikon | ||
| CyAn ADP Analyzer | Beckman Coulter | ||
| QCapture Software | QImaging | ||
| Summit Software | Beckman Coulter | ||
| GraphPad Software | Prism | ||
| TRIzol | ThermoFisher | 15596-018 | |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-013 | |
| 100 mM dNTP Set | Invitrogen | 10297-018 | |
| Random Hexamers | Invitrogen | 48190-011 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4385612 | |
| Costar 96W, ultra low attachment | Corning | 3474 | |
| HBSS, 1x | ThermoFisher | 14025134 | |
| CD44-APC conjugated antibody | BD Pharmingen | 560990 | Store at 4 °C, protect from light |
| CD24-PE antibody | BD Pharmingen | 560991 | Store at 4 °C, protect from light |
| Recombinant Human TNFα | Fisher | 210TA100 | |
| CCL2 Primer Forward Sequence | AGAATCACCAGCAGCAAGTGTCC | ||
| CCL2 Primer Reverse Sequence | TCCTGAACCCACTTCTGCTTGG | ||
| ICAM1 Primer Reverse Sequence | TGACGAAGCCAGAGGTCTCAG | ||
| ICAM1 Primer Forward Sequence | AGCGTCACCTTGGCTCTAGG | ||
| TNF Primer Forward Sequence | AAGGGTGACCGACTCAGCG | ||
| TNF Primer Reverse Sequence | ATCCCAAAGTAGACCTGCCCA | ||
| 36B4 Primer Forward Sequence | GTGTTCGACAATGGCAGCAT | ||
| 36B4 Primer Reverse Sequence | GACACCCTCCAGGAAGCGA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 4-Hydroxybenzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 20806-10G | |
| O-Acetylsalicyloyl Chloride | Sigma-Aldrich | 165190-5G | |
| Phosphorous Pentoxide | Sigma-Aldrich | 79610-100G | |
| Ethyl Fumaroyl Chloride | Sigma-Aldrich | 669695-1G | |
| Sodium Sulfate | Sigma-Aldrich | 246980-500G | |
| 4-Dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 714844-100ML | 0.5 M in tetrahydrofuran |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886-100ML | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | |
| Ethyl Acetate | Sigma-Aldrich | 270989-100ML | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757-2L | |
| 400 MHz FT NMR spectrometer | See Bruker’s Avance User’s Manual, version 000822 for details |
References
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