Summary
오징어 Doryteuthis pealeii 색소의 나노 입자에서 색소의 추출을위한 프로토콜이 표시됩니다.
Introduction
오징어, 오징어, 문어와 같은 두족류는 동적으로 위장 및 신호에 대한 자신의 모양을 변경할 수있는 기능을 가지고있다. 1-6이 기능은 색소로 알려진 착색 기관의 선택 면적 확장에 의해 부분적으로 지원됩니다. 4,7-9 색소는 이들이 작동되면 근섬유로 방사상 고정되는 cytoelastic sacculus 내에 한정 나노 안료 입자의 네트워크를 포함 소프트 액츄에이터. 1,3, 색소는 장기에 걸쳐 입자를 분산되게 표면적을 500 %로 확대. 3,7-을 이 작업은 색소 세포의 수 이상으로 행한 경우, 10, 11는, 동물의 전체 착색이 변경됩니다. 이 색소 과립이 색의 변화에 기여하는 것으로 알려져 있지만, 이들 조성물은 알려지지 않았다. 우리는 분리 및 미래 연구를 조성하도록 구성 될 수있다 안료 색소 포를 정제하는 방법을 설명한다.
3,12 색소 포 함유 조직은 두족류에서 조심 근절을 통해 수거된다. 소화 균질화 과정은 다음 색소 포 세포 주변 조직을 해리와 구분하기 위해 사용된다. 나노 구조 과립 반복 초음파 처리 및 원심 분리를 이용하여 남아있는 색소로부터 단리하고 정제한다. 정제시, 안료, 산성 메탄올 용액을 사용하여 나비 날개에서 보이는 색상의 추출에서 적응하는 과정에서 입자로부터 추출된다. (13) 주사 전자 현미경 (SEM) 및 측정법은 색소 포 안료가 성공적으로 사용하여 추출하는 것을 확인하기 위해 사용 이 과정.
이 방법은 C의 분자 기여를 탐구하는 데 사용되는 색소 포 과립의 분리를 설명oloration 두족류에. 전체 동물의 12 작은 분자 추출은 종종 길고 지루한 과정이 될 수 있습니다. 여기에 목표는 두족류의 나노 입자의 안료의 취득을위한 효과적이고 손쉬운 프로토콜의 미래 연구원을 알려드립니다.
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Protocol
미국에서 규제되지 않습니다 여기에 실시 무척추 동물 연구; 따라서 기관 동물 관리 및 사용위원회는 프로토콜의 검토에 대한 권한이 없습니다. 이러한 미국의 규제의 관할에 해당하지 않는 대신에, 저자는 이에이 연구는 진지한 윤리적 사용을 향해 노력, 관리, 및 동물의 치료, 개인의 수를 최소화하고, 이러한 노력으로 수행 하였다 상태 것을 바젤 선언과 실험 동물 과학을위한 국제위원회 (ICLAS) 윤리 지침과 일치한다.
1. Doryteuthis의 pealeii (D.의 pealeii) 해부
- 구매 참수 오징어 D. 우즈 홀, MA에있는 해양 생물 연구소의 해양 자원학과 또는 신선한 생선 시장에서 pealeii. 필렛 또는 이전에이 절차를 적용하기 위해 변경 한 시료를 사용하지 마십시오. 구체적으로는, 크로마tophore 층은 여전히 표본에 그대로 있어야합니다.
- 동물을 즉시 사용하지 않는 경우, 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관. 시료를 해동하기 전에 절개 1 시간 동안 실온의 물에 넣습니다.
- 동물의 후방 측을 따라 절단 스테인레스 스틸 직선 미세 점 해부 가위를 사용. 복부 맨틀의 기지에서 시작하고, 핀 영역에서 끝난다.
- 집게를 해부 및 해부 가위를 사용하여 결합 조직을 절단로 들어 올려 내부 장기 (위, 아가미, 잉크 선, 생식 기관, 전신 심장과 상완 마음)을 모두 제거합니다. 표본 가방에 장기를 폐기하십시오.
- 표준 11-1 / 2 (지느러미 쪽까지) 맨틀을 핀 T 핀을 해부 사용 "X 7-1 / 2"X 1-1 / 2 "유연한 해부 패드를 포함하는 알루미늄 해부 팬.에 조직을 잠수함 일회용 폴리스티렌 진공 여과 시스템을 통해 여과 된 해수 250 ml의0.2 ㎛의 세공 크기를 포함하는.
- 조심스럽게 그대로 색소 포 포함하는 피부 층을 유지, 해부 포셉 표피 피부 층 (불투명 한 색상)을 제거합니다. 표피층을 제거한 후에 시료 봉투에 버린다.
- 포셉 및 해부 가위로 색소 포 층의 작은 (1cm X 1cm) 섹션을 해부하다. 1.5 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에서 샘플을 수집 (해부 조직과 각 빈 튜브의 절반을 채우기).
- 튜브를 포함하는 조직에 여과 해수의 500 μl를 추가합니다. 샘플을 4 ℃에서 하룻밤 동안 저장 될 수있다.
2. 분리 색소 포 안료 과립
- 조직 소화
- 파파인 / 콜라게나 제의 제조
- 종이의 무게 콜라게나 제 30 mg을하고, 4 "× 4"낮은 질소를 사용하여 파파인 5 ㎎을 무게. 스크류 캡으로 50 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 다음을 전송합니다.
- deioniz 10 ㎖를 측정눈금 피펫을 사용하여 에드 물. 파파인 / 콜라게나 제를 포함하는 유리 병에 직접 추가 할 수 있습니다. 솔루션까지 가장 높은 설정에 소용돌이는 분명하다.
- 세포 외 조직을 제거
- g X 14000에서 5 분 동안 단계 170에서 수집 된 색소 포 조직을 원심 분리기. 플라스틱 폐기물 통에 바닷물의 상단 층을 폐기하십시오.
- P1000 가변 볼륨 단일 채널 마이크로 피펫을 사용하여 조직에 파파인 / 콜라겐 용액 500 μl를 추가합니다. 가장 높은 설정에 1-2 분 동안 각각의 샘플을 소용돌이.
- 주변 조직으로부터 세포를 해리 40 kHz의 주파수에서 5 분 동안 샘플을 초음파 처리.
- 14,000 × g에서 5 분 동안 원심 분리기. 플라스틱 폐기물 통에 상층 액을 버린다.
- g X 14000에서 5 분 동안 수집 된 색소 포 조직을 원심 분리기. 플라스틱 폐기물 통에 바닷물의 상단 층을 폐기하십시오. 다시 한 번 반복합니다.
- 수동으로 남아있는 큰 조직 초를 제거다음 단계로 진행하기 전에 포셉이 과정에서 소화되지 않은 TIONS.
- 파파인 / 콜라게나 제의 제조
- 안료 과립을 분리
- 균질화 버퍼의 준비
- 2.38 g의 무게 (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산) (HEPES, 100 mM)을 염화 마그네슘 (10 mM)을, 칼륨 아스파 테이트의 0.856 g (50 mM)을 0.095 g, 0.015 g의 디티 오 트레이 톨 (1 mm)이다. 스크류 캡을 가진 150 ㎖ 폴리스티렌 용기에 옮긴다. 하나는 상용 미니 태블릿 프로테아제 억제제를 추가합니다.
- 눈금 실린더를 사용하여 100 ml의 탈 이온수를 측정한다. 균질화 염을 함유하는 용기에 직접적으로 추가한다. 솔루션까지 소용돌이는 분명하다.
- 안료 과립의 균질화
- 5 분 동안 14,000 XG에서 2.1 단계에서 각 샘플을 원심 분리기. 플라스틱 폐기물 통에 상층 액을 버린다. 이 샘플은 세포 조직의 무효합니다.
- 추가 500# 181; 1-2 분마다 각각의 튜브와 소용돌이에 균질화 버퍼의 난 철저하게 샘플을 혼합합니다. 30 분 (~ 40 kHz에서)에 대한 샘플을 초음파 처리하고 14,000 × g에서 원심 분리의 5 분에 따릅니다.
- 플라스틱 폐기물 통에 뜨는을 폐기하고, 색소 포의 sacculus 단백질 사슬의 완전한 소화를 보장하기 위해 이전 단계를 2 ~ 3 번 반복합니다. 남은 용액은 담황색 상청과 분리 된 안료 입자를 함유하는 붉은 색의 펠렛을 함유한다.
- 균질화 버퍼의 준비
3. 안료 추출
- 산성 메탄올의 제조 (염산 - 메탄올)
- 조심스럽게 메탄올 5 ㎖ (메탄올)로 농축 (36.5-38 % (/ w) w) 염산 (HCL)의 25 μl를 추가합니다. 스크류 캡 유리 샘플 유리 병에 염산 - 메탄올 용액을 저장합니다. 균일 용액을 섞어 부드럽게 소용돌이.
주 : 더 산성 용액 더 안료는 인터넷 동안 추출한다첫 번째 추출.
- 조심스럽게 메탄올 5 ㎖ (메탄올)로 농축 (36.5-38 % (/ w) w) 염산 (HCL)의 25 μl를 추가합니다. 스크류 캡 유리 샘플 유리 병에 염산 - 메탄올 용액을 저장합니다. 균일 용액을 섞어 부드럽게 소용돌이.
- 안료의 추출
- 14,000 XG에서 5 분 (2.2.2)에서 색소 과립 현탁액을 원심 분리기 및 플라스틱 쓰레기 통에 상층 액을 버린다.
- HCL에 - 메탄올 용액 500 μl를 추가하고 3-4 분 ~ 각 샘플을 소용돌이. 10 분 (~ 40 kHz에서)를위한 샘플을 초음파 처리 한 후 14,000 × g에서 5 분간 원심 분리.
- 전송 피펫을 사용하여, 1 DRAM 나사 최고 유리 병에 뜨는를 수집합니다. 상층 액은 색상 진한 빨간색이어야한다.
- 더 색 (~ 4-5 세척) 추출되지 않을 때까지 추출 단계 3.2.2를 반복합니다.
참고 : 각 추출 ~ 안료의 1.5 ml를 얻을 것입니다. 남아있는 무색의 펠릿 안료 추출 과립이다. 주 : 무색 과립 추출 안료 모두 더 사용할 때까지 39 ° C의 물에 저장 될 수있다.
추출 과정에서 4. 특성
- 스캔 엘ectron 현미경
- 추출 처리의 순도를 확인하기 위해 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용한다 (단계 2.2.1 안료 추출 단계 3.2.3부터 미 반응 된) 이미지 과립.
- 14,000 XG에서 5 분 동안 영상, 최초의 원심 분리기 모두 반응 과립 및 안료 추출 과립을위한 과립 샘플을 준비하고 플라스틱 폐기물 통에 뜨는을 취소합니다. 1 ml의 에탄올 및 예금 전송 피펫을 사용하여 알루미늄 SEM 스텁 상 과립 현탁액을 2 ~ 3 방울에이를 다시 일시 중지합니다.
- 밤새 샘플을 건조시킨 후, 15 nm의 코팅을 얻기 위해 3 분 동안 금 - 백금 코팅 피막 스퍼터.
- 쇼트 키 방출하고 2 차 전자 검출기와 SEM을 사용하여 이미지. 5-7 kV의 광 전압 및 이미지 8 9mm 이들 물질 사이의 작동 거리를 사용한다.
- 자외선 - 가시 광선 (UV-힘) 분광 측정
- 흡광도 프로 모니터200-800 nm의에서 듀얼 빔 분광 광도계를 사용하여 3 조건 파일 (2.2.2에서 미 반응 과립, 3.2.3에서 추출 색소 및 3.2.4에서 색소를 추출 과립).
- 미 반응 과립 및 안료 추출 과립 1 ml의 큐벳에 탈 이온수를 사용하여 빈 측정 값을 수집합니다. 두 샘플에 대한 UV-마주 흡수 스펙트럼을 수집합니다.
- 추출 된 안료 1 mL를 큐벳에서 산성 메탄올 용액을 사용하여 블랭크 측정을 수집한다. 샘플에 대한 UV-마주 흡수 스펙트럼을 수집합니다.
- 흡광도 피크의 최대 상대 높이에 도달하는 파장을 식별함으로써, 각 시료의 최대 파장을 결정한다.
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Representative Results
색소는 D.에서 해부하는 pealeii 등의 맨틀 (그림 1A, 1B). 그들은이 제거되면 색소 세포가 용해 및 색소 과립 (도 2A, 2B)를 밖으로 분리하는 원심 분리 및 세척주기를 사용하여 정제한다. 산성 메탄올 용액 (염산 - 메탄올)는 수용성 색소 추출물과 불용성 무색 안료 추출 과립을 산출, 과립 (그림 2C)에서 색소를 추출하는 데 사용됩니다.
추출 공정은 입자의 평균 직경을 감소시킨다. 이 작업은 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 관찰된다. (도 3A N = 100, 에러 표준 편차) 과립 염산 - 메탄올에 노출되기 전에, 그들은 (527.3 ± 91.8) nm의 평균 직경을 갖는다. 안료는 입자로부터 추출하고, 크기 감소s의 (202.6 ± 32.2) 내지 (N = 100, 오류가 표준 편차도 3B). 이 소형화을 HCl-MeOH로 처리 된 과립에서 색소의 추출에 의한 것으로 가정한다.
이 가설을 테스트하기 위해, 눈에 보이는 색상 전후 추출의 차이는 광학 현미경 및 분광 광도계를 사용하여 모니터링됩니다. 염산 - 메탄올을 첨가하면, 미 반응의 과립과 연관된 색상 가시적 (도 4A)을 감소시킨다. 이는 더 넓은 흡광 프로파일 (~ 280-800 nm의) 매우 낮은 강도이라도 예비 추출 과립 및 후 추출 과립 관찰 UV-힘 측정법 (도 4B)를 이용한 것을 특징으로한다; 동안은 수용성 안료 추출물 ~ 380 nm에서 어깨 ~ 500 nm에서 중심 람다 최대를 나타낸다. 종합적으로, 이러한 데이터가 성공적으로 과립에서 보이는 색상을 추출하는 방법을 제안한다.
그림 1 : 오징어 D.에서 색소 pealeii. (A) 오징어 D. pealeii 등의 맨틀. (B), 빨간색, 노란색, 갈색 색소의 밝은 필드 이미지입니다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 추출 과정의 그림 (A) 색소는 해부한다. (B) 안료 입자는 균질 색소 포 조직으로부터 제거하고, 원심 분리 세척 사이클의 시리즈를 사용하여 정제된다. (C) 전 안료 일 수있다 tracted은 무색 안료 추출 입자로부터 분리 된 수용성 안료 상층 액을 산출 염산 - 메탄올을 사용하여 과립에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : 나노 입자의 염산 - 메탄올 추출 달라져 직경 (A) 미리 산성 메탄올 추출 색소 과립의 주사 전자 현미경 사진 (B) 후, 산성 메탄올 추출 색소 과립.. 스케일 바 = 1 ㎛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도 4 :. 염산 - 메탄올 추출 나노 입자의 표시 색을 변경하는 추출 공정에 걸쳐 색소 과립의 (A) 시야 화상. (B) 전 (검은 색)의 흡광도 스펙트럼 - 포스트 (파란색) -. 안료 상층 액 (빨간색)와 함께 추출 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 오징어 색소 포 과립에서 색소를 추출하는 방법을 설명했다. 특히 과립을 대상으로, 우리의 목표는 적응 착색을 매개의 역할을 결정하는 것입니다. 이 방법은 대량 조직 샘플 (14) 또는 동결 건조 피부 (15)를 사용하여 두족류 안료의 특성을 설계 이전 보고서에서 다르다.
이 프로토콜은 색소 포 안료를 추출하는 데 효과적이지만, 이것은 작은 반응 규모로 제한된다. 한 오징어 수확량을 해부 ~ 정제 된 과립의 11 mg을. 약이 질량의 58 %는 염산 - 메탄올 용액을 사용하여 추출 된 수용성 안료를 포함한다. (12)을 시작 색소 포 조직의 순도는 직접 한 해부에서 제품 수율에 영향을 미친다. 샘플을 초과 표피 또는 해부 동안 수집 iridophore 조직에 의해 오염 나타날 경우, 샘플의 내용을 별도의 추가 버피에서 그들을 재현 탁하는 것이 가장 좋습니다FER, 그리고 균질화가 또 다시 단계를 시작합니다. 색소 포 조직에서 색소 과립의 순수한 인구를 분리하는 것은 사일에 걸쳐 수 많은 4, 여덟 시간의 초음파 사이클이 걸릴 수 있습니다. 또한, 안료 입자의 순수 집단을 확인하기 위해 분리되어 환자를 유지하는 것이 중요하다.
출발 과립의 순도 용액은 염산-MeOH로 안료 추출 단계에 영향을 미친다. 과립 조직 소화 단순히 와류에 의해 폐색 최대 1 시간에 샘플을 초음파 처리하고 다시 추출을 시작하기 전에 샘플을 균질화하는 경우. 샘플 당 염산 - 메탄올 500 μl를 사용하여 종종 4-5 세척은 과립에서 색소를 추출해야합니다. 제대로 경우이 절차는 샘플 당 수용성 안료의 2-3 ml의 사이에 얻을 것입니다. 추가의 정제는 박층 크로마토 그래피를 통해 사용되는 경우, 단리 된 안료 및 xanthommatin decarbo의 다양한 농도를 포함하는 4 개의 분획으로 분리하는 고유xylated xanthommatin. (12)
이 방법은보다 나은 색 변조 안료의 역할을 이해하기 위해 약제사 생물학 또는 엔지니어에 의해 사용될 수있다. 과립 내 안료의 존재는 나노 색소 포 안료 입자 내에 포함 된 분자 유래 성분과 두족류의 착색을위한 계층 적 메커니즘을 제안한다. 이러한 연구 결과는 사전 구성된 안료 나노 입자를 사용하여 두족류 표시 적응 색의 동적 범위를 모방하기 위해 고안된 시스템을 알릴 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
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