Summary
Un protocole pour l'extraction de pigments à partir des granulés nanostructurés dans squid Doryteuthis pealeii chromatophores est présenté.
Introduction
Céphalopodes tels que les calmars, seiches, poulpes et ont la capacité de modifier dynamiquement leur apparence pour le camouflage et la signalisation. 1-6 Cette capacité est prise en charge en partie par l'expansion zonale sélective des organes pigmentées appelées chromatophores. 4,7-9 Chromatophores sont actionneurs souples qui contiennent un réseau de granulés de pigment nanostructurés confinés dans un saccule cytoelastic qui est ancrée radialement par des fibres musculaires. 1,3 Comme ils sont actionnés, étendent des chromatophores de 500% dans la surface présentée à distribuer les granulés à travers l'organe. 3,7- , 10,11 Lorsque cette action est concertée sur un certain nombre de chromatophores, la coloration générale de l'animal est changé. Bien qu'il soit connu que les granulés de pigment contribuent à ce changement de couleur, leur composition reste inconnue. Nous décrivons une procédure pour isoler et purifier des pigments chromatophores qui peuvent être adaptés pour les futures études de composition.
3,12 Chromatophore tissu contenant est récolté par l' extirpation attention du céphalopode. Un procédé de digestion et de l'homogénéisation est ensuite utilisée pour dissocier le tissu environnant et séparer les cellules chromatophores. Les granulés nanostructurés sont ensuite isolés et purifiés à partir des chromatophores restantes en utilisant la sonication et centrifugation répétée. Après purification, les pigments sont extraits des granules dans un processus qui est adapté de l'extraction de couleur visible à partir des ailes de papillon en utilisant des solutions de méthanol acides. Microscopie électronique 13 à balayage (MEB) et spectrophotométrie sont utilisés pour confirmer que les pigments de chromatophores sont extraits avec succès en utilisant ce processus.
Cette méthode décrit l'isolement des granulés de chromatophores qui est utilisé pour explorer la contribution moléculaire à coloration dans les céphalopodes. 12 petites extractions de molécules provenant d' animaux entiers peuvent souvent être un processus long et fastidieux. Le but ici est d'informer les futurs chercheurs d'un protocole efficace et facile pour l'acquisition de pigments des granules nanostructurés en céphalopodes.
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Protocol
études sur les animaux invertébrés effectuées ici ne sont pas réglementés aux États-Unis; par conséquent, le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux n'a aucune autorité pour l'examen de ces protocoles. Au lieu de ceux-ci ne relevant de la compétence de la réglementation aux États-Unis, les auteurs, par les présentes affirment que ces études ont été menées avec un effort sincère envers l'utilisation éthique, les soins et le traitement de ces animaux, le nombre de personnes a été réduit au minimum et ces efforts sont conformes à la Déclaration de Bâle et le Conseil international pour l'expérimentation animale (ICLAS) Lignes directrices en matière d'éthique.
1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Dissection
- Achat calmar décapité D. pealeii du Département des ressources marines au Laboratoire de biologie marine de Woods Hole, MA ou d'un marché du poisson frais. Ne pas utiliser des échantillons qui ont été filetés ou préalablement modifiés afin d'appliquer cette procédure. Plus précisément, la chromiecouche tophore doit encore être intact sur le spécimen.
- Si les animaux ne sont pas utilisés immédiatement, les entreposer à -20 ° C jusqu'à utilisation. Pour décongeler les spécimens, placez-les dans de l'eau à température ambiante pendant 1 heure avant la dissection.
- Utilisation en acier inoxydable droites ciseaux de dissection pointes fines, coupées le long de la face postérieure de l'animal. Commencez à la base du manteau ventral, et se terminera à la région fin.
- Retirez tous les organes internes (estomac, des branchies, des glandes d'encre, les organes reproducteurs, le cœur systémique, et le cœur brachial) en les soulevant avec pince à disséquer et à rompre leur tissu conjonctif à l'aide des ciseaux de dissection. Jeter les organes dans un sac de spécimen.
- Utilisez disséquant T-broches à la broche du manteau (côté fin vers le haut) dans une norme 11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "pan aluminium dissection contenant un tampon de dissection flexible. Immerger le tissu 250 ml d'eau de mer qui a été filtrée à travers un système de filtration sous vide en polystyrène à usage uniquecontenant 0,2 um taille des pores.
- Retirez délicatement la couche de peau épidermique (couleur opaque) avec une pince à disséquer, en gardant la couche de peau de chromatophores contenant intact. Une fois que la couche de l'épiderme est éliminé, le jeter dans un sac à échantillon.
- Disséquer petits (1 cm x 1 cm) sections de la couche de chromatophores avec des pinces et des ciseaux de dissection. Prélever des échantillons dans des tubes de 1,5 ml de micro-centrifugeuse (remplir la moitié de chaque tube vide avec le tissu disséqué).
- Ajouter 500 ul d'eau de mer filtrée au tissu contenant des tubes. Les échantillons peuvent être conservés pendant une nuit à 4 ° C.
2. Isolating Chromatophore Pigment Granules
- La digestion du tissu
- Préparation de la papaïne / collagénase
- Peser 30 mg de collagénase et 5 mg de papaïne en utilisant un "x 4" faible teneur en azote 4 peser papier. Transférer ces derniers dans un polypropylène tube de centrifugeuse de 50 ml avec un bouchon à vis.
- Mesurer 10 ml de deionizl'eau ed l'aide d'une pipette graduée. Ajouter directement au flacon contenant de la papaïne / collagénase. Vortex sur le réglage le plus élevé jusqu'à ce que la solution soit limpide.
- Retrait de tissus extracellulaires
- Centrifuger le tissu collecté de l'étape chromatophores 1,7 pendant 5 min à 14 000 x g. Jeter la couche supérieure de l'eau de mer dans un seau de déchets plastiques.
- Ajouter 500 ul de la solution de papaïne / collagénase dans le tissu en utilisant un volume variable P1000 canal unique micropipette. Vortex chaque échantillon pendant 1-2 min sur le réglage le plus élevé.
- Soniquer les échantillons pendant 5 minutes à une fréquence de 40 kHz à se dissocier des cellules provenant du tissu environnant.
- Centrifuger pendant 5 min à 14 000 x g. Jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques.
- Centrifuger le tissu collecté chromatophores pendant 5 min à 14 000 x g. Jeter la couche supérieure de l'eau de mer dans un seau de déchets plastiques. Répéter encore une fois.
- Supprimez manuellement tout en restant un grand sec de tissutions qui ne digèrent dans ce processus avec une pince avant de passer à l'étape suivante.
- Préparation de la papaïne / collagénase
- Isoler le Pigment Granules
- Préparation de Homogénéisation Buffer
- Peser 2,38 g de (4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic) (HEPES, 100 mM), 0,095 g de chlorure de magnésium (10 mM), 0,856 g de potassium-aspartate (50 mM) et 0,015 g de dithiothréitol (1 mM). Transférer dans un récipient en polystyrène de 150 ml avec un bouchon à vis. Ajouter une mini-comprimé inhibiteur de protéase commerciale.
- Mesurer 100 ml d'eau déminéralisée à l'aide d'une éprouvette graduée. Ajouter directement dans le récipient contenant les sels d'homogénéisation. Vortex jusqu'à ce que la solution est claire.
- Homogénéisation de Granules pigmentaires
- Centrifuger chaque échantillon de l'étape 2.1 à 14000 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques. Cet échantillon doit être vide de tissu extracellulaire.
- Ajouter 500 &# 181; l de tampon d'homogénéisation dans chaque tube et vortexer pendant 1 à 2 min chacun pour bien mélanger les échantillons. Soniquer les échantillons pendant 30 min (~ 40 kHz) et de suivre avec 5 min de centrifugation à 14000 x g.
- Jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques, et répétez l'étape précédente 2-3 fois afin d'assurer la digestion complète des chromatophores sacculus et de protéines longes. La solution restante doit contenir un surnageant jaune clair et une pastille de couleur rouge contenant les granules pigmentaires isolés.
- Préparation de Homogénéisation Buffer
3. Pigment Extraction
- Préparation du méthanol acide (HCl-MeOH)
- ajouter avec précaution 25 pi de concentré (36,5 à 38% (p / p)) de l'acide chlorhydrique (HCl) à 5 ml de methanol (MeOH). Conserver la solution HCl-MeOH dans un bouchon à vis échantillon de verre du flacon. Agiter doucement pour mélanger uniformément la solution.
NOTE: Plus la solution est acide, plus pigment sera extrait au cours de la fiextraction première.
- ajouter avec précaution 25 pi de concentré (36,5 à 38% (p / p)) de l'acide chlorhydrique (HCl) à 5 ml de methanol (MeOH). Conserver la solution HCl-MeOH dans un bouchon à vis échantillon de verre du flacon. Agiter doucement pour mélanger uniformément la solution.
- Extraction du pigment
- Centrifuger la suspension de pigment de granule (de 2.2.2) pendant 5 min à 14000 xg et jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques.
- Ajouter 500 ul de la solution de HCl-MeOH et Vortexer chaque échantillon pendant environ 3-4 min. Soniquer les échantillons pendant 10 min (~ 40 kHz), puis centrifuger pendant 5 min à 14 000 x g.
- En utilisant une pipette de transfert, de recueillir le surnageant dans un flacon 1 dram vis-top en verre. Le surnageant doit être de couleur rouge foncé.
- Répétez la 3.2.2 étape d'extraction jusqu'à ce qu'aucun autre couleur est extrait (~ 4-5 lavages).
NOTE: Chaque extraction donnera ~ 1,5 ml de pigment. Le culot incolore restant est le pigment extrait des granules. REMARQUE: Les deux granules incolores et des pigments extraits peuvent être stockés dans l'eau à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
4. Caractérisation tout au long du processus d'extraction
- Numérisation ElECTRON Microscopie
- Les granules d'image (pas réagi provenant de l'étape 2.2.1 et un pigment extrait à l'étape 3.2.3), en utilisant la microscopie électronique à balayage (SEM) pour vérifier la pureté du procédé d'extraction.
- Pour préparer des échantillons de granulés pour l'imagerie, première centrifugeuse à la fois des granules pigmentaires ayant pas réagi et extrait des granules pendant 5 min à 14000 xg, et jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques. Resuspendre ceux-ci dans 1 ml d'éthanol et de dépôt 2-3 gouttes de la suspension de granulés ONTO moignons aluminium SEM en utilisant une pipette de transfert.
- Après séchage, les échantillons pendant une nuit, par pulvérisation cathodique couche de revêtement d'or-platine pendant 3 min pour obtenir un revêtement de 15 nm.
- L'image en utilisant un MEB avec un émetteur Schottky, et un détecteur d'électrons secondaires. Utilisez une tension de faisceau 5-7 kV et une distance de travail entre 8 et 9 mm à l'image de ces matériaux.
- Ultraviolet-visible Mesures spectrophotométriques (UV-vis)
- Surveiller la pro absorbanceles fichiers pour les 3 conditions (2.2.2 granule n'a pas réagi, du pigment extrait de 3.2.3, et de pigment extrait granules à partir 3.2.4) à l'aide d'un spectrophotomètre à double faisceau 200-800 nm.
- Recueillir une mesure à blanc avec de l'eau déminéralisée dans une cuvette de 1 ml pour les granules ayant pas réagi et les pigments extraits granulés. Recueillir des spectres d'absorption UV-Vis pour les deux échantillons.
- Recueillir une mesure à blanc en utilisant la solution de méthanol acide dans une cuvette de 1 ml pour le pigment extrait. Recueillir le spectre d'absorption UV-Vis pour l'échantillon.
- Déterminer la longueur d'onde maximale de chaque échantillon en identifiant la longueur d'onde à laquelle le pic d'absorbance atteint sa hauteur maximale relative.
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Representative Results
Chromatophores sont disséqués à partir du D. pealeii dorsale manteau (Figure 1A, 1B). Une fois qu'ils sont retirés, les chromatophores sont lysées et purifiées en utilisant des cycles de centrifugation et de lavage pour isoler les granulés pigmentés (figures 2A, 2B). Des solutions de méthanol acide (HCl-MeOH) sont utilisées pour extraire le pigment à partir des granulés (figure 2C), ce qui donne un extrait de pigment soluble et des granules de pigment insolubles, on extrait incolores.
Le procédé d'extraction permet de réduire le diamètre moyen des granules. Ceci est observé par microscopie électronique à balayage (MEB). Avant que les granulés sont exposés à du HCl-MeOH, ils ont un diamètre moyen de (527,3 ± 91,8) nm (N = 100, l' erreur est l' écart type, la figure 3A). Lorsque le pigment est extrait à partir des granulés, la diminution de la tailles à (202,6 ± 32,2) nm (N = 100, l' erreur est l' écart type; la figure 3B). Cette réduction de taille est supposée être due à l'extraction du pigment à partir du granulé lorsqu'il est traité avec du HCl-MeOH.
Pour tester cette hypothèse, les différences de pré- couleur visible et l'extraction post sont surveillés en utilisant la microscopie lumineuse et spectrophotométrie. Lors de l' addition de HCl-MeOH, la couleur associée à des granulés réduit visiblement pas réagi (figure 4A). Cela se caractérise en outre l' utilisation UV-vis spectrophotométrie (figure 4B), où un large profil d'absorbance (~ 280-800 nm) est observée pour les granules pré-extrait et les granulés de post-extraction, mais à une intensité beaucoup plus faible; tandis que, l'extrait soluble de pigment présente une lambda max centrée à ~ 500 nm avec un épaulement à ~ 380 nm. Collectivement, ces données suggèrent une méthode avec succès pour extraire la couleur visible à partir des granulés.
Figure 1: Chromatophores de calmar D. pealeii. (A) Squid D. pealeii manteau dorsal. (B) de l' image lumineuse du champ de chromatophores rouges, jaunes et bruns. Barre d' échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Illustration du processus d'extraction (A) Chromatophores sont disséqués. (B) les granulés de pigments sont éliminés à partir de tissus homogénéisés chromatophores et purifiés en utilisant une série de cycles de centrifugation et de lavage. (C) Le pigment peut être ex subdivisées à partir des granulés en utilisant HCl-MeOH donne un surnageant de pigment soluble qui est séparé des granules de pigment incolore extraits. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: HCl-MeOH extraction alters diamètres des granulés nanostructurés micrographies électroniques à balayage (A) de methanol pré-acide extrait des granules de pigment et (B) de post-méthanol acide extrait des granules de pigment.. Barre d' échelle = 1 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4: HCl-MeOH extraction altère la couleur visible de granulés nanostructurés (A) images de champ lumineux de granules pigmentaires tout au long du processus d'extraction.. (B) de spectres Absorbance de pré (noir) - et post (bleu) -. Extraction avec le surnageant de pigment (rouge) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous avons démontré une méthode pour extraire les pigments de granulés de chromatophores calmar. En ciblant spécifiquement les granules, notre objectif est de déterminer leur rôle dans la médiation de la coloration adaptative. Cette méthode diffère des précédents rapports conçus pour caractériser les pigments de céphalopodes en utilisant des échantillons de tissus en vrac 14 ou lyophilisé la peau 15.
Bien que ce protocole est efficace pour l'extraction des pigments de chromatophores, elle est limitée à de petites échelles de réaction. Disséquer un rendement calmar ~ 11 mg de granules purifiés. Environ 58% de cette masse contient le pigment soluble, qui est extrait en utilisant la solution de HCl-MeOH 12. La pureté du tissu à partir chromatophores influe directement sur le rendement en produit à partir d' une dissection. Si les échantillons semblent contaminés par un excès de tissu épidermique ou iridophore recueillies lors de la dissection, il est préférable de séparer le contenu de l'échantillon, les remettre en suspension dans buf supplémentairesfer, et commencer l'homogénéisation étapes encore. Isoler une population pure de granules pigmentaires de tissu chromatophores peut prendre jusqu'à huit, 4 cycles hr sonication qui pourrait étendre sur 4 jours. Il est important de rester dans l'isolement du patient afin d'assurer une population pure de granulés de pigment.
La pureté de la solution de départ des granules influe également sur le pigment étapes d'extraction avec du HCl-MeOH. Si les granulés sont obstrués par du tissu non digérés, il suffit de vortex et sonication les échantillons jusqu'à 1 h et homogénéiser l'échantillon avant de recommencer l'extraction. Souvent 4-5 lavages à l'aide de 500 pi de HCl-MeOH par échantillon sont nécessaires pour extraire le pigment à partir des granulés. Si fait correctement, cette procédure donnera entre 2-3 ml de pigment soluble par échantillon. Quand on utilise une purification supplémentaire par Chromatographie sur couche mince, les pigments isolés séparés en quatre fractions uniques contenant des concentrations variables de xanthommatine et decarboxanthommatine xylated. 12
Cette méthode peut être utilisée par les chimistes, des biologistes, ou les ingénieurs à mieux comprendre le rôle des pigments dans la modulation de la couleur. La présence du pigment dans les granules suggère un mécanisme hiérarchique pour la coloration dans les céphalopodes qui provient des composants moléculaires contenus dans nanostructuré chromatophores des granulés de pigments. Ces résultats peuvent être utilisés pour informer les systèmes d'ingénierie conçus pour imiter la gamme dynamique de la couleur adaptative affichée dans les céphalopodes utilisant des nanoparticules pigmentées préemballés.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
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