Summary
Se presenta un protocolo para la extracción de pigmentos a partir de los gránulos nanoestructurados en Doryteuthis pealeii cromatóforos calamar.
Introduction
Cefalópodos como el calamar, la sepia, el pulpo y tienen la capacidad de alterar su apariencia dinámica para camuflar y señalización. 1-6 Esta capacidad es apoyado en parte por la expansión de área selectiva de órganos pigmentadas conocidas como cromatóforos. 4,7-9 Cromatóforos son actuadores blandos que contienen una red de gránulos de pigmento nanoestructurados confinados dentro de un sáculo cytoelastic que está anclado radialmente por las fibras musculares. 1,3 a medida que se accionan, cromatóforos expanden por 500% de la superficie presentado la distribución de los gránulos de todo el órgano. 3,7 10,11 Cuando esta acción es concertada a través de una serie de cromatóforos, se cambia la coloración general del animal. Aunque se sabe que los gránulos de pigmento contribuyen a este cambio de color, su composición sigue siendo desconocido. Se describe un procedimiento para aislar y purificar los pigmentos cromatóforos que pueden ser adaptados para futuros estudios de composición.
3,12 chromatophore tejido que contiene se cosecha a través de la extirpación cuidado del cefalópodo. Un proceso de la digestión y la homogeneización se utiliza a continuación para disociar el tejido circundante y separar las células cromatóforos. Los gránulos nanoestructurados son entonces aislado y purificado a partir de los restantes cromatóforos utilizando sonicación y centrifugación repetidas. Tras la purificación, los pigmentos se extraen de los gránulos en un proceso que es una adaptación de la extracción de color visible de alas de mariposa usando soluciones de metanol ácidos. Microscopía electrónica 13 de barrido (SEM) y espectrofotometría se utilizan para confirmar que los pigmentos cromatóforos se extraen con éxito utilizando este proceso.
Este método describe el aislamiento de gránulos cromatóforos que se utiliza para explorar las contribuciones moleculares acoloration en cefalópodos. 12 extracciones de moléculas de animales enteros a menudo puede ser un proceso largo y tedioso. El objetivo es informar a los futuros investigadores de un protocolo eficaz y fácil para la adquisición de los pigmentos de los gránulos nanoestructurados en los cefalópodos.
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Protocol
los estudios en animales invertebrados realizadas en este documento no están regulados en los Estados Unidos; Por lo tanto, el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional no tiene autoridad para la revisión de dichos protocolos. En lugar de estos no cae bajo la jurisdicción de la regulación en los Estados Unidos, los autores declaran que estos estudios fueron realizados con un esfuerzo sincero hacia el uso ético, el cuidado y el tratamiento de estos animales, se redujo al mínimo el número de individuos y estos esfuerzos son consistentes con la Declaración de Basilea y el Consejo Internacional para la Ciencia Animal de Laboratorio (ICLAS) las directrices éticas.
1. Doryteuthis pealeii (pealeii D.) La disección
- Compra de calamar decapitado D. pealeii del Departamento de Recursos Marinos en el Laboratorio de Biología Marina en Woods Hole, MA o de cualquier mercado de pescado fresco. No utilice muestras que han sido previamente fileteados o alterados con el fin de aplicar este procedimiento. Específicamente, el cromacapa tophore todavía debe estar intacto en la muestra.
- Si los animales no se utilizan inmediatamente, almacenar a -20 ° C hasta su uso. Para descongelar las muestras, colocarlos en agua a temperatura ambiente durante 1 hora antes de la disección.
- El uso de acero inoxidable tijeras de disección de punta fina rectas, cortadas a lo largo de la parte posterior del animal. Comience en la base del manto ventral, y terminará en la región de la aleta.
- Eliminar todos los órganos internos (estómago, las branquias, glándula de tinta, órganos reproductivos, corazón sistémico, y el corazón braquial) levantándolas con pinzas de disección y la ruptura de su tejido conjuntivo con tijeras de disección. Desechar los órganos en una bolsa de muestras.
- Utilice la disección de T-alfileres para fijar el manto (lado de las aletas hacia arriba) en un estándar de 11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "pan disección de aluminio que contiene una almohadilla de disección flexible. Sumergir el tejido en 250 ml de agua de mar que se ha filtrado a través de un sistema de filtración a vacío desechable de poliestirenoque contiene 0,2 micras tamaños de poro.
- Retirar con cuidado la capa epidérmica de la piel (color opaco) con pinza de disección, manteniendo intacta la capa de piel que contiene chromatophore. Una vez que se retira la capa epidérmica, desprenderse de ella en una bolsa de muestras.
- Diseccionar pequeños (1 cm x 1 cm) de las secciones de la capa de chromatophore con unas pinzas y tijeras de disección. Recoger muestras en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga (llene la mitad de cada tubo de vacío con el tejido diseccionado).
- Añadir 500 l de agua de mar filtrada al tejido que contiene tubos. Las muestras se pueden almacenar durante la noche a 4 ° C.
2. Aislamiento de chromatophore pigmento gránulos
- La digestión del tejido
- Preparación de papaína / colagenasa
- Pesar 30 mg de colagenasa y 5 mg de papaína utilizando una "x 4" bajo nitrógeno 4 Documento de pesar. Transferirlas a un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml con tapón de rosca.
- Medir 10 ml de deionized agua usando una pipeta graduada. Añadir directamente al vial que contiene papaína / colagenasa. Vórtice a la máxima temperatura hasta que la solución es clara.
- La eliminación de tejido extracelular
- Centrifugar el tejido chromatophore recogido de la etapa 1.7 durante 5 minutos a 14.000 x g. Desechar la capa superior de agua de mar en un cubo de residuos plásticos.
- Añadir 500 l de la solución de papaína / colagenasa al tejido usando una micropipeta de volumen variable solo canal P1000. Vortex cada muestra durante 1-2 minutos en la posición más alta.
- Sonicar las muestras durante 5 min a una frecuencia de 40 kHz para disociar las células del tejido circundante.
- Centrifugar durante 5 min a 14.000 x g. Descartar el sobrenadante en un cubo de residuos plásticos.
- Centrifugar el tejido chromatophore recogido durante 5 min a 14.000 x g. Desechar la capa superior de agua de mar en un cubo de residuos plásticos. Repetir una vez más.
- quitar manualmente cualquier tejido seg gran restantelas que no digieren en este proceso con unas pinzas antes de proceder al siguiente paso.
- Preparación de papaína / colagenasa
- El aislamiento del pigmento gránulos
- Preparación de tampón de homogeneización
- Pesar 2,38 g de (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico) (HEPES, 100 mM), 0,095 g de cloruro de magnesio (10 mM), 0,856 g de potasio-aspartato (50 mM), y 0,015 g de ditiotreitol (1 mM). Transferir a un recipiente de poliestireno 150 ml con un tapón de rosca. Añadir un inhibidor de la proteasa de mini tableta comercial.
- Medir 100 ml de agua desionizada usando un cilindro graduado. Añadir directamente al recipiente que contiene las sales de homogeneización. Vortex hasta que la solución es clara.
- La homogeneización de gránulos de pigmento
- Centrifugar cada muestra de la etapa 2.1 a 14.000 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante en un cubo de residuos plásticos. Esta muestra debe ser nula de tejido extracelular.
- Añadir 500 y# 181; l de tampón de homogeneización a cada tubo y agitar durante 1-2 minutos cada uno para mezclar bien las muestras. Sonicar las muestras para 30 min (~ 40 kHz) y seguir con 5 min de centrifugación a 14.000 x g.
- Descartar el sobrenadante en un cubo de residuos de plástico, y repetir el paso anterior 2-3 veces para asegurar la digestión completa de las correas de sujeción sáculo chromatophore y proteínas. La solución restante debe contener un sobrenadante de color amarillo claro y un sedimento de color rojo que contiene los gránulos de pigmento aisladas.
- Preparación de tampón de homogeneización
3. Pigmento Extracción
- Preparación de metanol ácido (HCl-MeOH)
- Añadir cuidadosamente 25 l de concentrado (36,5 a 38% (w / w)) de ácido clorhídrico (HCl) a 5 ml de metanol (MeOH). Almacenar la solución de HCl-MeOH en un vial de muestra de vidrio tapón de rosca. Agitar suavemente para mezclar uniformemente la solución.
NOTA: La más ácida la solución, la más pigmento se extrajo durante la fiextracción de primera.
- Añadir cuidadosamente 25 l de concentrado (36,5 a 38% (w / w)) de ácido clorhídrico (HCl) a 5 ml de metanol (MeOH). Almacenar la solución de HCl-MeOH en un vial de muestra de vidrio tapón de rosca. Agitar suavemente para mezclar uniformemente la solución.
- Extracción de Pigmento
- Centrifugar la suspensión de gránulos de pigmento (de 2.2.2) durante 5 min a 14.000 xg y descartar el sobrenadante en un cubo de residuos de plástico.
- Añadir 500 l de la solución de HCl-MeOH y agitar cada muestra para ~ 3-4 min. Sonicar las muestras para 10 min (~ 40 kHz), centrifugar durante 5 min a 14.000 x g.
- Usando una pipeta de transferencia, recoger el sobrenadante en un vial de vidrio con tapa de rosca 1 dram. El sobrenadante debería ser de color rojo oscuro.
- 3.2.2 Repetir la etapa de extracción hasta que ya no se extrae el color (~ 4-5 lavados).
NOTA: Cada extracción producirá ~ 1,5 ml de pigmento. El sedimento restante es incoloro los gránulos de pigmento extraído. NOTA: Los dos gránulos incoloros y pigmentos extraídos se pueden almacenar en agua a 4 ° C hasta su uso posterior.
4. Caracterización largo proceso de extracción
- El Escaneoectron Microscopía
- La imagen de gránulos (sin reaccionar de la etapa 2.2.1 y pigmento extraído de la etapa 3.2.3) usando microscopía electrónica de barrido (SEM) para verificar la pureza del proceso de extracción.
- Para preparar las muestras de los gránulos para formación de imágenes, primero centrífuga tanto gránulos que no han reaccionado y los gránulos de pigmento se extrajo durante 5 minutos a 14.000 xg, y descartar el sobrenadante en un cubo de residuos de plástico. Vuelva a suspender estos en 1 ml de etanol, y depósito de 2-3 gotas de la suspensión de gránulos Onto trozos de aluminio SEM utilizando una pipeta de transferencia.
- Después de secar las muestras durante la noche, revestir con recubrimiento de oro-platino durante 3 minutos para lograr un revestimiento de 15 nm.
- Imagen utilizando un SEM con un emisor Schottky y un detector de electrones secundarios. Utilice un voltaje del haz de 5-7 kV y una distancia de trabajo entre 8 y 9 mm a imagen de estos materiales.
- Las mediciones espectrofotométricas ultravioleta-visible (UV-VIS)
- Supervisar el pro absorbanciaarchivos para las 3 condiciones (gránulo sin reaccionar de 2.2.2, 3.2.3 pigmento extraído de, y pigmentos extraídos de gránulos 3.2.4) utilizando un espectrofotómetro de doble haz de 200-800 nm.
- Se recoge una medida en blanco usando agua desionizada en una cubeta de 1 ml para los gránulos sin reaccionar y los gránulos de pigmento extraído. Recoger los espectros de absorción UV-Vis para ambas muestras.
- Se recoge una medida en blanco utilizando la solución de metanol ácido en una cubeta de 1 ml para el pigmento extraído. Recoger espectro de absorción UV-Vis para la muestra.
- Determinar la máxima longitud de onda de cada muestra mediante la identificación de la longitud de onda a la que el pico de absorbancia alcanza su altura máxima relativa.
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Representative Results
Cromatóforos se disecan de la D. pealeii dorsal manto (Figura 1A, 1B). Una vez que se quitan, cromatóforos se lisan y se purificaron usando los ciclos de centrifugación y lavado para aislar los gránulos pigmentados (Figuras 2A, 2B). Soluciones de metanol ácido (HCl-MeOH) se utilizan para extraer el pigmento de los gránulos (Figura 2C), produciendo un extracto de pigmento soluble y gránulos de pigmento extraído insolubles, incoloros.
El proceso de extracción reduce el diámetro medio de los gránulos. Esto se observa mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Antes de que los gránulos están expuestos a HCl-MeOH, tienen un diámetro medio de (527,3 ± 91,8) nm (N = 100, el error es la desviación estándar; Figura 3A). Cuando el pigmento se extrae de los gránulos, la disminución de tamaños a (202,6 ± 32,2) nm (N = 100, el error es la desviación estándar; Figura 3B). Esta reducción de tamaño es la hipótesis de que es debido a la extracción de pigmento del gránulo cuando se trata con HCl-MeOH.
Para probar esta hipótesis, las diferencias en color visible pre- y post-extracción se controlan mediante microscopía de luz y espectrofotometría. Tras la adición de HCl-MeOH, el color asociado con los gránulos sin reaccionar reduce visiblemente (Figura 4A). Este se caracteriza además mediante espectrofotometría UV-vis (Figura 4B), donde se observa un perfil de amplia absorbancia (~ 280-800 nm) para los gránulos pre-extraído y gránulos post extraída, aunque a una intensidad mucho menor; mientras que, el extracto de pigmento soluble exhibe un máximo lambda centrada a ~ 500 nm, con un hombro a ~ 380 nm. En conjunto, estos datos sugieren un método para extraer con éxito el color visible a partir de los gránulos.
Figura 1: Cromatóforos de calamar D. pealeii. (A) Calamar D. pealeii dorsal del manto. La imagen de campo claro de cromatóforos rojos, amarillos, marrones y (B). Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Ilustración del proceso de extracción Cromatóforos (A) se disecan. (B) los gránulos de pigmento se eliminan del tejido chromatophore homogeneizada y se purificaron usando una serie de ciclos de centrifugación y lavado. (C) El pigmento puede ser ex retraída de los gránulos utilizando HCl-MeOH dando un sobrenadante pigmento soluble que se separa de los gránulos de pigmentos extraídos incoloro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: HCl-MeOH extracción altera diámetros de los gránulos nanoestructurados micrografías electrónicas de barrido de pre-ácida de metanol extraído gránulos de pigmento (A) y (B) post-ácida de metanol extraído gránulos de pigmento.. Barra de escala = 1 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4: HCl-MeOH extracción altera color visible de gránulos nanoestructurados imágenes de campo (A) brillante de los gránulos de pigmento en todo el proceso de extracción.. (B) los espectros de absorbancia de pre (negro) - y post (azul) -. De extracción junto con el sobrenadante de pigmentos (rojo) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos demostrado un método para extraer pigmentos de gránulos cromatóforos calamar. Al dirigirse específicamente a los gránulos, nuestro objetivo es determinar su papel en la mediación de la coloración de adaptación. Este método difiere de informes anteriores diseñados para caracterizar los pigmentos de cefalópodos usando muestras de tejido a granel 14 o liofilizado piel 15.
Mientras que este protocolo es eficaz en la extracción de pigmentos cromatóforos, se limita a las escalas de reacción pequeños. La disección de los rendimientos uno de calamar ~ 11 mg de gránulos purificados. Aproximadamente el 58% de esta masa contiene el pigmento soluble, que se extrae usando la solución de HCl-MeOH. 12 La pureza del tejido chromatophore de partida influye directamente en el rendimiento del producto de una disección. Si aparecen las muestras contaminadas por el exceso de tejido epidérmico o iridophore recogidos durante la disección, lo mejor es separar el contenido de la muestra, volver a suspender en buf adicionalfer, y comenzar la homogeneización los pasos de nuevo. Aislar una población pura de gránulos de pigmento a partir de tejido chromatophore puede tardar hasta ocho, 4 ciclos de sonicación horas que podría extenderse a lo largo de 4 días. Es importante mantener la paciente en el aislamiento para asegurar una población pura de gránulos de pigmento.
La pureza de la solución de partida de gránulos influye también en las etapas de extracción de pigmentos con HCl-MeOH. Si los gránulos se ocluyen por el tejido sin digerir, simplemente vórtice y sonicar las muestras de hasta 1 hora y homogeneizar la muestra antes de comenzar la extracción de nuevo. A menudo 4-5 lavados usando 500 l de HCl-MeOH por muestra se requieren para extraer el pigmento de los gránulos. Si se hace correctamente, este procedimiento dará entre 2-3 ml de pigmento soluble por muestra. Cuando se emplea la purificación adicional a través de cromatografía en capa fina, los pigmentos aislados se separan en cuatro fracciones únicas que contienen concentraciones variables de xanthommatin y decarboxanthommatin xylated. 12
Este método puede ser utilizado por los químicos, biólogos, o ingenieros de entender mejor el papel de los pigmentos en la modulación de color. La presencia del pigmento dentro de los gránulos sugiere un mecanismo jerárquico para la coloración en cefalópodos que se origina con los componentes moleculares contenidos en los gránulos de pigmento nanoestructurado cromatóforos. Estos resultados se pueden utilizar para informar a los sistemas construida diseñada para imitar la gama dinámica de colores de la imagen que se muestra en cefalópodos usando nanopartículas pigmentadas preenvasados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
- Bell, G. R. R., et al. Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin. Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).
- Crookes, W. J., et al. Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues. Science. 303 (5655), 235-238 (2004).
- Deravi, L. F., et al. The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores. J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).
- Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods. J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid. Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores. Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).
- Cloney, R. A., Brocco, S. L. Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods. Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).
- Hanlon, R. T., Messenger, J. B. Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).
- Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects. J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).
- Florey, E. Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores. Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).
- Florey, E., Kriebel, M. E. Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs. Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).
- Williams, T. L., et al. Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores. Langmuir. , (2016).
- Nijhout, H. F. Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae). Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).
- Van Den Branden, C., Decleir, D. A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis. L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).
- Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).
